植物快速繁殖技术实验指导

1、植物快速繁殖技术实验指导国平编生态与资源工程系2014年1月8日目录前言 III学生实验守则 IV实验一 观赏植物种子无菌萌发与试管开花技术 1实验二 金线莲的快速繁殖技术 3实验三 铁皮石斛的快速繁殖技术 5 实验四 一种植物的组织培养与快速繁殖 8刖言植物组织培养即植物无菌培养技术，又称离体培养，是根据植物细胞具有 全能性的理论，利用植物体离体的器官（如根、茎、叶、茎尖、花、果实等）、 组织（如形成层、表皮、皮层、髓部细胞、胚乳等）或细胞（如大抱子、小抱子、 体细胞等）以及原生质体，在无菌和适宜的人工培养基及温度等人工条件下，能 诱导出愈伤组织、不定芽、不定根，最后形成完整的植株的学科。近

2、40年以来,植物组培技术已渗透到植物生理学、病理学、遗传学、药学、育种以及生物化学 等各个研究领域，为快速繁育优良品种，培育无毒苗木，进行突变筛选培育，药 用植物工厂化生产，种质保存和基因库建立等方面开辟了新途径，成为生物学科 中的重要研究技术和手段之一。现如今，植物组织培养技术具有保持花卉优良性 状、培育脱毒苗木、保存种质资源等优势，根据这些优势，植物栽培技术也被广 泛应用于花卉的种苗繁殖与生产之中。学生实验守则、自觉遵守纪律和各项规章制度，保持室安静，注意环境卫生，不吸烟、不随地吐痰、不乱扔纸屑杂物，爱护公务。二、实验过程中应严肃认真，严格遵守操作规程。贵重、精密仪器的使用 须在专人指导下

3、进行。三、爱护实验仪器设备，厉行节约。仪器若有损坏，应如实报告，填写登 记表。凡损坏、丢失的仪器设备，均应查清原因，按仪器设备损坏、丢失赔偿制 度处理。四、实验物品不得随意翻动，严禁携出室外。若需借用应办理借物手续。五、注意实验室安全，易燃易爆品的操作应远离火源。六、实验结束，由实验指导教师和管理人员检查清点仪器设备， 学生应办 好交接手续，做好清洁卫生，及时关好水电阀门，保持实验室和仪器的清洁整齐。实验一观赏植物种子无菌萌发与试管开花技术一、实验目的掌握利用种子作为外植体进行快速繁殖的方法；掌握试管花卉的培养技术； 了解植物开花的影响因素。二、实验原理试管开花是指用组织培养的方法，使植物开花

4、的过程在培养容器中完成。一般情况下，植物必须达到某种成熟阶段时才能开花。自1946年罗士韦在对菟丝子茎尖培养时发现了花器官的形成后，植物组织培养技术已用于植物离体开花 的研究。影响试管开花的因素主要有外植体， 外源植物激素，营养水平和环境因 素等4个方面。通过改变培养基中外源植物激素、 营养水平和培养环境条件，可 以诱导培养物在试管开花。试管花卉作为高新技术与工艺生产相结合的新生物，不仅在理论研究上有 重要作用，而且可以利用成花决定因素的研究来培养能迅速进入生殖阶段的试 管苗或有观赏价值的试管花卉，并将这一技术直接应用于花卉生产。试管花卉有 较大市场前景，目前可以做成试管花卉的植物有石斛兰、龙

5、角、波露、短叶芦荟、美丽十 二卷、鸡冠花、玫瑰、红莲、凤梨、大花蕙兰、狼牙掌、燕尾芦荟、非洲紫罗兰、 下城芦荟、金线莲、迎春、六月雪、红叶、无刺火棘、紫薇、情人草、康乃馨、 幸运草、草莓、非洲菊、文心兰等。三、实验器具与药品 器材：电子天平、托盘天平、烧杯(50ml, 100ml, 500ml, 1000ml)、量筒 (1000ml,100ml, 25ml)、容量瓶(1000ml,500ml,100ml)、药勺、称量纸、玻璃棒、 滴管、电炉、冰箱、移液枪、pH计、高压灭菌锅、超净工作台、镊子、酒精灯、 棉球、三角瓶、培养皿。试剂：MS培养基各种母液、PP333 KT、6-BA、NAA、IAA、

6、蔗糖、琼脂、酒精、升汞以矮生鸡冠花品系的种子为试材 四、实验容与操作步骤1、培养基 的配制 种子萌发培 养基： MS基本培养基 增殖培养基：MS+NAA.1mg L-1+6-BA I.Omg L-1+ 蔗糖20 g L-1+ 琼脂 10 g L-1 试管开花诱导培养基： MS+PP3330.5mg L-1+NAAO.01mg L-1+ 蔗糖 20 g L-1 + 琼脂 I0g L-12、种子灭菌先用洗洁精洗净种子， 用自来水流水沖洗干净；再用0.1% HgCb浸泡10 min, 最后用无菌水反复冲洗 5 遍。在超净工作台上将灭菌后的种子接种到 MS 培养基 上,每三角瓶接种5-10个外植体。培

7、养室条件为：光照12hd-1、光照强度1500LX、 温度2526C。14d后统计种子发芽率和污染率。3、增殖培养当无菌苗长到约2cm时，取其中约1cm芽段，接种到增殖培养基上，培 养 26 d 后统计其增殖倍数。4、开花诱导将高约23cm的试管苗，转到试管开花诱导培养基中，培养条件：日 温（2 5±2）C，夜温（20±2）C，光照强度 150 03 0 0 0 1 x，光照时间12h/d，接种30d后观察统计试管开花情况。五、实验结果观察试验结果，报告种子发芽率和污染率、增殖倍数和试管开花情况。六、思考题：什么是试管花卉？有何开发价值？影响试管开花的主要因素有哪些？实验二

8、金线莲的快速繁殖技术一、实验目的掌握利用组织培养方法进行金线莲快速繁殖的技术；了解影响金线莲快速繁殖的各种因素。二、实验原理金线莲为兰科开唇兰属花叶开唇兰 (A noectochilus roxburghii (Wall.)Lin dl.)，又名金线兰、金丝草。主要种植于我国、等亚热带及热带地区，素 有“金草”、“神药”等美称。金线莲喜欢生长在潮湿、阴凉的环境中，温度需 要控制在2028 C之间，喜散射光，最忌直射，对环境的要求比较严格。近 年来，由于其药用价值不断被发掘，金线莲人工环境中的量产也逐步实现。 特别 是在、等华南地区，应用金线莲组织培养技术生产商品金线莲的模式不断兴起。野生金线莲

9、自然繁殖是用种子繁殖的， 其人工繁育技术难度较大。应用组培 繁殖可大大缩短金线莲成苗时间，显著提高培养效率，降低育苗成本，是金线莲 种苗生产的重要方法。三、实验器具与药品 器材：电子天平、托盘天平、烧杯(50ml, 100ml, 500ml, 1000ml)、量筒 (1000ml,100ml, 25ml)、容量瓶(1000ml,500ml,100ml)、药勺、称量纸、玻璃棒、滴管、电炉、冰箱、移液枪、pH计、高压灭菌锅、超净工作台、镊子、酒精灯、 棉球、三角瓶、培养皿。 试剂：MS培养基各种母液、KT、6-BA、NAA、IAA、蔗糖、琼脂、酒 精、升汞、香蕉汁、活性炭等。 金线莲野生种苗或试管

10、苗。四、实验容与操作步骤1、培养基 的配制 茎段诱导培养基：MS + BA 1.5+ NAA 0. 5 + 香蕉汁100 g/L 继代增殖培养基：1 2MS+ BA 2.0 + NAA0.3 +香蕉汁100 g/L + AC0.2%; 生根培养基:1 2MS + IBA + NAA 0.3 + AC 0.2% 2、茎段诱导将带芽的金线莲茎段剪成23cm长的茎段用自来水冲洗，置饱和漂白粉 上清液中浸泡15 min，并用软毛刷轻轻刷洗，冲洗干净；在自来水下滴冲12 h,双蒸水冲洗23次，置超净工作台用75%酒精消毒30 s, 0. 1%氯化汞溶 液消毒 10 13 min ，无菌水冲洗 3 5 次

11、； 取出要接种的材料放在灭过菌的 培养皿上， 用手术刀切掉与氯化汞接触的切口， 然后将材料平放在诱导培养基面 上进行诱导。每瓶接种带侧芽的茎段数 5个，每隔一周观察污染情况和记录侧芽 发芽状况， 30 d 后记录发芽个数，并算出侧芽的出芽率。3、丛生芽的增殖培养将诱导产生的高 1. 01. 5 cm 的丛生芽从瓶中取出，切去叶片和基部褐化部分，转接到增殖培养基中，每瓶接种 3-5个不定芽，每隔一周观察其污染情 况及记录增殖培养过程中丛生芽的增殖状况， 50 d 后记录增加的不定芽的个数， 计算增殖倍数。4、生根培养当丛生芽长至 1. 5 3. 0 cm 高， 2 3 片叶时，将其分成单个植株，

12、接 入生根培养基中诱导生根。 每瓶培养基接种 5 株，每隔一周观察其污染情况及记 录丛生芽的生根状况， 30 d 后记录生根株数及每株的生根数，并计算生根培养 基下幼苗的生根率及平均生根数。五、实验结果观察试验结果，报告侧芽诱导率和污染率、丛生芽增殖倍数、试管苗生根率 及平均生根数；总结金线莲的工厂化育苗技术。六、思考题：阐述金线莲的生物学特性、价值和育苗技术。实验三铁皮石斛的快速繁殖技术一、实验目的掌握利用组织培养方法进行铁皮石斛快速繁殖的技术；了解影响铁皮石斛快速繁殖的各种因素。二、实验原理铁皮石斛(Dendrobium officinale)是一种生长缓慢、自然繁殖率很低的兰科附生植物，

13、具有很高的药用价值，为传统名贵中药，有“救命仙草”、“药 中黄金”之美称。自然资源将近枯竭，已列入濒危保护植物。铁皮石斛种质资源 的保护和开发离不开植物组织培养技术，组培工厂化生产是铁皮石斛种植规模化 的基础。铁皮石斛目前关于其组织培养及快速繁殖的研究颇多，用于外植体的有 种子、无菌苗幼苗茎段、原球茎及人工种子等；再生植株的获得途径主要有种子 一原球茎一小植株,种子一原球茎-无菌苗茎段一小植株,种子一愈伤组织一原 球茎一小植株等。由于铁皮石斛组培周期长，如何有效解决快繁中存在的组培苗 生产成本高、移栽苗成活率低、标准化生产程度低等问题是维持铁皮石斛产业健 康发展的基石，是开发利用铁皮石斛资源的

14、一个重要方面。三、实验器具与药品 器材：电子天平、托盘天平、烧杯(50ml, 100ml, 500ml, 1000ml)、量筒 (1000ml,100ml, 25ml)、容量瓶(1000ml,500ml,100ml)、药勺、称量纸、玻璃棒、滴管、电炉、冰箱、移液枪、pH计、高压灭菌锅、超净工作台、镊子、酒精灯、 棉球、三角瓶、培养皿。 试剂：MS培养基各种母液、KT、6-BA、NAA、IAA、蔗糖、琼脂、酒 精、升汞、香蕉汁、活性炭等。 铁皮石斛野生种苗或试管苗。四、实验容与操作步骤1、培养基 的配制 茎段启动诱导培养基为：(1) MS+ 6 BA 0.5mg/ L，单位下同)+ NAA 0.

15、05+2g/ L 活性碳； MS+ 6 BA1.0+ NAA 0. 1+ 2g/ L活性碳。 石斛继代增殖培养基为：(3) 3g/ L 花宝3号+ 6-BA 1.0+ NAA 0.25+ 2g/ L 生根培养基为 : ( 5) 1/ 2MS+ IBA 0. 5+ 2g/ L 活性碳。以上培养基均加2.0%蔗糖,0.6%琼脂，pH5.2 5. 4,培养温度(25 ± 2C ),光照 度1500 2000 lx, 光照时间 12h/ d 。2、无菌材料的处理从植株上切下长 2 5cm 的幼嫩茎段 , 在流水下冲洗 , 用刷子蘸少许洗衣粉 水轻轻刷洗 , 并经自来水充分洗净。 在超净工作台

16、上将茎段放置在 75% 的酒精中 消毒30s后，再用0. 1%的升汞水溶液浸泡810min,无菌水冲洗5 6次。3、原球茎的诱导用解剖刀将铁皮石斛的幼嫩茎段切下 , 接种在诱导培养基 (1) 中培养，每瓶 接种带侧芽的茎段数 5个，每隔一周观察污染情况和记录原球茎诱导状况。1520d 后, 外植体开始萌动 , 茎段膨大 , 切面及顶部组织形成疏松组织。继续培养 20d 后, 转入培养基 (2) 中, 切面及顶部膨大组织的表面形成凹凸不平的颗粒 物，随着培养时间的延长，颗粒物长大形成直径约12mm的原球茎颗粒物，30 d 后记录原球茎个数，并算出原球茎诱导率。4、原球茎的增殖将培养基 ( 2)

17、中形成的原球茎转入到培养基 (3) 、(4) 中, 30 d 后记录原 球茎个数，并算出原球茎增殖率。原球茎在培养基 (3) 、(4) 中都有增殖 , 培养基 (4) 增殖速度很快 , 增殖倍 数可达34 倍, 同时, 部分原球茎开始分化出芽点并长出 1 2 片小叶, 原球茎 的增殖与芽分化同时进行 , 表明高浓度的激素组合可促进原球茎的增殖与分化。 待芽数量较多时，将高1 2cm、带有23片叶的小芽切下转入生根培养基(5)上 进行生根培养。5、生根与移栽小苗在生根培养基 进行不定根的诱导。培养30d左右，基部开始出现2 3条约1cm长的白色根，随后逐渐伸长，45d统计生根率？当苗高3cm以上

18、、具3 4 片叶时 , 便可出瓶移栽。移栽前 , 将生根瓶苗打开瓶盖 , 移至常温下炼苗 7d, 然后, 将瓶苗取出 , 洗去附着在根部的培养基 , 用0. 01%的高锰酸钾溶液浸泡 8 10 min, 栽种于已灭菌的碎树皮基质中 ( 移栽前浇透水 ) , 放置在遮光度 50% 60%、湿度达 80% 以上的温室中 , 2 个月后统计成活率？ 五、实验结果观察试验结果，报告原球茎诱导率和污染率、原球茎增殖倍数、试管苗生根率及平均生根数；总结铁皮石斛的工厂化育苗技术。六、思考题：阐述铁皮石斛的生物学特性、价值和育苗技术。实验四一种植物的组织培养与快速繁殖本实验要求选择一种植物作为培养的对象，设计一个实验方案，以获得再生 植株为目标开展离体培养研究，并报告实验结果。实验方案需要说明以下容：（1） 选择的是什么植物？选择该种植物的理由是什么？（ 2）植株再生的途径是什么？（3）各阶段培养基配方是什么？ （4）外植体如何消毒？ （ 5）接种过程是怎样的？ （6）培养条件是怎样的？ （ 7）预期结果是怎样的？一、实验目的依据已掌握的植物组织培养技术，对一种有开发价值的植物进行离体培养，获得其试管苗，形成该种植物的组织培养