萌发麦苗淀粉酶活力的测定_实验报告

1、班级：植物142 学号：1401080229 姓名：刘国强实验七：萌发麦种的淀粉酶活力的测定1、 研究背景及目的酶是由生物体内活细胞产生的一种生物催化剂。大多数由蛋白质组成（少数为RNA）。能在机体中十分温和的条件下，高效率地催化各种生物化学反应，促进生物体的新陈代谢。生命活动中的消化、吸收、呼吸、运动和生殖都是酶促反应过程。酶是细胞赖以生存的基础。细胞新陈代谢包括的所有化学反应几乎都是在酶的催化下进行的。因此，对酶的研究是十分重要的。通过对酶活性的测定，可以更好地了解生物体的代谢过程。2、 实验原理淀粉酶是水解淀粉和糖原的酶类总称，可以分成-淀粉酶，-淀粉酶等。-淀粉酶既作用于直链淀粉，亦作

2、用于支链淀粉，无差别地随机切断糖链内部的-1，4-链。-淀粉酶与-淀粉酶的不同点在于从非还原性末端逐次以麦芽糖为单位切断-1，4-葡聚糖链。 根据其催化产物的特点和现有测定方法规定酶活力单位为：每分钟每克鲜重麦种所催化产生的麦芽糖毫克数。3,5二硝基水杨酸法是一种对还原糖定量测定的方法。还原糖和碱性二硝基水杨酸试剂一起共热，产生一种棕红色的氨基化合物，在一定的浓度范围内，棕红色物质颜色的深浅程度与还原糖的量成正比。因此，我们可以测定样品中还原糖以及总糖的量。麦芽糖是还原性糖，可用该方法对其含量进行测定。本实验分为两部分，一是通过纯化-淀粉酶活力完成-淀粉酶的活力测定，二是不进行任何纯化处理测定

3、总酶活力。 三、仪器试剂1、仪器设备：低温冷冻离心机（Eppendorf 5804R）恒温水浴锅（ ）分光光度计（ ）托盘天平（JYT-1，原常熟市金羊天平仪器厂）2.试剂：（1）1%淀粉溶液，称取1g可溶性淀粉，加入80ml左右蒸馏水，在电炉上加热溶解，等冷却后，定容到100ml。（2） pH5.6的柠檬缓冲液：A液（称取柠檬酸20.01克，溶解后定容至1L）B液（称取柠檬酸钠29.41克，溶解后定容至1L）取A液5.5ml、B液14.5ml混匀即为pH5.5柠檬酸缓冲液；（3）3，5-二硝基水杨酸溶液（称取3，5-二硝基水杨酸1.00克，溶于20ml 1M氢氧化钠中，加入50ml蒸馏水，再

4、加入30克酒石酸钠，待溶解后，用蒸馏水稀释至100ml，盖紧瓶塞，勿使二氧化碳进入）；（4）麦芽糖标准液（称取0.100克麦芽糖，溶于少量蒸馏水中，小心移入100ml容量瓶中，用蒸馏水定容到100ml）；（5）0.4M NaOH；3、 实验材料：萌发的小麦种子。四、实验步骤1.酶液的制备（蒸馏水浸提）：称取2克萌发的小麦种子（芽长一厘米左右），置于研钵中加少量石英砂，蒸馏水作为匀浆液，研磨成匀浆，转移到50ml容量瓶中至40ml左右，浸提15-20分钟，用蒸馏水定容到刻度，混匀后3500转/分离心20分钟，取出上清液备用（初始酶液）。2.淀粉酶活性的测定：（1）.取试管4支，注明两支为对照管，

5、两支为测定管。（2）.于每个管中各加入酶提取液1毫升，在70恒温水浴中（水浴温度的变化不应超过±0.5）准确加热15分钟，取出后迅速在水浴中彻底冷却。(3).在试管中各加入1ml pH5.6柠檬酸缓冲液。4).将测定管和对照管置于40（±0.5）恒温水浴中准确保温15分钟后，向两支对照管中各加入4ml 0.4MNaOH，再向各管分别加入40下预热的淀粉溶液2ml，摇匀，立即放入40水浴中准确保温5分钟后，向两支测定管分别迅速加入4ml 0.4NaOH，然后准备下步糖的测定。3.-淀粉酶及-淀粉酶总活性的测定：取酶液5ml，放入100ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度。混均后，

6、取4支试管，2支为对照管，2支为测定管，各加入稀释后酶液1ml及pH5.6柠檬酸缓冲液1ml，以下步骤重复淀粉酶测定的第(4)步的操作。4.麦芽糖的测定：（1）.标准曲线的制作取15ml具塞刻度试管7支，编号，按表1操作试剂 管号1234567麦芽糖标准液00.10.30.50.70.91.0蒸馏水1.00.90.70.50.30.10 表1.麦芽糖标准管的制备摇匀后再加入3,5-二硝基水杨酸1毫升，摇匀，在沸水浴中准确保温5分钟，取出冷却，用蒸馏水稀释到15毫升，混均匀后用分光光度计在520nm波长下进行比色，记录消光值，以消光值为纵坐标以麦芽糖含量为横坐标绘制标准曲线。（2）.样品的测定取

7、以上各管中酶作用后的溶液及对照管中的溶液各1毫升，分别放入15毫升具塞刻度管中，在加入1毫升，3,5-二硝基水杨酸试剂混匀，置于沸水浴中准确煮沸5分钟，取出冷却，用蒸馏水稀释至15毫升，混匀，用分光光度计在520nm波长下进行比色，记录消光值，根据标准曲线，进行结果计算。5.结果计算-淀粉酶活性（毫克麦芽糖·克-1鲜重·分钟-1）=（A-A）*样品稀释总体积/样品重(g)*5（-+-）淀粉酶总活性（毫克麦芽糖·克-1鲜重·分钟-1）= (B-B)* 样品稀释总体积/样品重(g)*5A -淀粉酶测定管中的麦芽糖浓度A -淀粉酶对照管中的麦芽糖浓度B -及-

8、淀粉酶总活性测定管中的麦芽糖浓度B -及-淀粉酶总活性对照管中的麦芽糖浓度五、数据整理与计算麦芽糖标准曲线：管号1234567麦芽糖标准液浓度×15(mg/ml)00.10.30.50.70.91.0OD520淀粉酶活力测定液：管号89101112131415项目-对照管-测定管+-对照管+-测定管OD520OD520均值麦芽糖浓度（mg/ml）结果计算：六、结果分析七、参考文献1百度百科-淀粉酶百科名片 2<-淀粉酶的性质> 八、 思考题1、酶活力测定实验的总体设计思路是什麽？实验设计的关键你认为是什麽？为什么？答：酶活力的测定其总体思路就是在最适条件下测定酶促反应的初

9、速度（底物消耗小于5%）。据此具体实验设计是底物过量的情况（一般S10KM），于酶的最适pH、温度等条件下测定某种酶作用产物的生成速度以表征酶的催化能力。所以本实验在保证以上要求下，以麦芽糖的生成量来表征淀粉酶的活力，并严格定义了酶活单位。在这个总体思路的指导下，我们首先必须关注的是：材料自身、原本就存在的被测定产物的含量！具体到本实验即是麦芽中自身已经存在的麦芽糖。这部分酶作用产物是必须要精确刨除的，否则我们实验的最终定量便无法准确。而这就是“对照管”要完成的任务。所以，所有的酶活力测定实验中都有所谓“对照管”的设计，其作用就是刨除所有非指定酶促反应测定时间段内的待测产物！以保证最终结果的可

10、信准确。这是酶活力测定中最关键的设计。2、本实验最易产生对结果有较大误差影响的操作是哪些步骤？为什么？怎样的操作策略可以尽量减少误差？答：浸提步骤。70温度或15min时间控制不严格不准确则可能导致淀粉酶未完全钝化使测得活性偏大。应严格控制温度和时间。70水浴后需要立即冰浴，否则淀粉酶复性使测得淀粉酶活性结果偏大。向测定管中加入NaOH时应迅速，否则酶与底物继续反应使结果偏大。3、-淀粉酶活性测定时70水浴为何要严格保温15分钟？保温后为何要立即于冰浴中骤冷？答：由于-淀粉酶不耐热，在70下处理一定时间可以钝化，严格保温15分钟可以达到理想的钝化效果，时间过长，-淀粉酶活性也会受到影响；时间不

11、足，-淀粉酶钝化不完全。保温后立即骤冷是为了通过剧烈的温变改变b-淀粉酶的结构以防止在随后的反应中复性，这样就保证了在随后的40温浴的酶促反应中，-淀粉酶不会再参与催化反应。此外我认为冰浴使酶迅速降温，便于严格控制高温处理时间的长短。4、pH5.6柠檬酸缓冲液的作用？各管于40水浴准确保温15分钟的作用？答：酶实验体系的pH值变化或变化过大，会使酶活性下降甚至完全失活。加入pH5.6的缓冲液调至酶促反应的最适pH，同时稳定溶液的pH不至于在反应过程中大幅波动。 40水浴准确保温15分钟为调整酶促反应的最适温度5、众多测定淀粉酶活力的实验设计中一般均采取钝化b-淀粉酶的活力而测a-淀粉酶和测总酶

12、活力的策略，为何不采取钝化a-淀粉酶活力去测b-淀粉酶活力呢？这种设计思路说明什么？答：淀粉酶与淀粉酶的催化特性是有差异的。淀粉酶主要作用于直链淀粉的-1，4-糖苷键，而且仅从淀粉分子外围的非还原性末端开始，切断至-1,6-键的前面反应就停止了；而淀粉酶则无差别地作用于直链淀粉与支链淀粉的-1，4-糖苷键，所以淀粉酶需要淀粉酶淀粉支链的-1，4-糖苷键后才能完全体现其催化能力。 此外我认为在实验中温度比酸度更易控制，钝化淀粉酶难度远远高于淀粉酶，而且若提高酸度钝化淀粉酶，则回调最适pH时淀粉酶也有可能由于复性恢复活力。这种设计思路说明在测定酶的比活力时要综合考虑各种可能出现的酶的性质以及它们之间的联系，也要考虑到实验操作的可行性。6、本实验中所设置的对照管的作用？它与比色法测定物质含量实验中设置的空白管有何异同？本实验可否用对照管调分光光度计的100%T？为什么？答：消除非酶促反应（如淀粉酸性环境下加热水解）和非测定时间内的酶促反应引起的麦芽糖的生成带来的误差。两种都是为了消除非测定部分对光的吸收，空白组是为了消除溶液中溶剂等其它组分对光的吸收，而对照管是为了消除非测量所需反应所得的多余溶质对光的吸收。不可，因为标准曲线的确定是在空白的基础上的，得到的是OD值与麦芽糖含量的关系7、我们所测定得到的总酶活力减去所测定得到的a-淀粉酶活力是否就