第六章分子杂交技术

1、第六章第六章 分子杂交技术分子杂交技术第一节第一节 探针的选择和标记探针的选择和标记第二节第二节 杂交和洗膜杂交和洗膜第三节第三节 检测与分析检测与分析 1、原理、原理 碱基互补配对碱基互补配对 探针（探针（probe） 同特异性目标作用同特异性目标作用 有效检测有效检测2、基本步骤、基本步骤 探针的选择和标记探针的选择和标记 转膜转膜 预杂交、杂交预杂交、杂交 洗膜洗膜 检测检测第一节第一节 探针的选择和标记探针的选择和标记1、克隆探针和合成的寡核苷酸探针、克隆探针和合成的寡核苷酸探针 特异性特异性 灵敏度灵敏度 杂交时间杂交时间2、寡核苷酸探针的类型和应用、寡核苷酸探针的类型和应用 特定序

2、列的单一寡核苷酸探针特定序列的单一寡核苷酸探针 较短而简并性较高的成套的寡核苷酸探针较短而简并性较高的成套的寡核苷酸探针 对少量高度纯化的蛋白质进行测序；按照遗传密码推导对少量高度纯化的蛋白质进行测序；按照遗传密码推导 较长而简并性较低的寡核苷酸探针较长而简并性较低的寡核苷酸探针只含有所有可能密码中的一部分只含有所有可能密码中的一部分简并位点上带上一个简并位点上带上一个“中性中性”碱基，如次黄苷酸碱基，如次黄苷酸例：根据氨基酸序列选择长例：根据氨基酸序列选择长17个核苷酸的寡核苷个核苷酸的寡核苷酸探针酸探针l 数目数目22 24=323、寡核苷酸探针的选择原则寡核苷酸探针的选择原则 长度长度1

3、8-50bp G、C碱基组成在碱基组成在40%-60% 分子内不存在互补区分子内不存在互补区 避免在序列中连续出现一个碱基的多次重复避免在序列中连续出现一个碱基的多次重复4、探针的标记方法、探针的标记方法 双链双链DNA探针的制备探针的制备 切口平移；随机引物切口平移；随机引物 使用前变性；杂交过程中可能发生自退火使用前变性；杂交过程中可能发生自退火 单链单链DNA探针的制备探针的制备 在单链模板上进行引物延伸反应；化学合成；在单链模板上进行引物延伸反应；化学合成；PCR 单链单链RNA探针的制备探针的制备双链双链DNA的切口平移标记法的切口平移标记法DNA的随机引物标记法的随机引物标记法ba

4、ck酶切位点要选择在酶切位点要选择在正好处于插入的正好处于插入的目标目标DNA的下游的下游使转录产物使转录产物不含载体序列不含载体序列 利用体外转录体系产生单链利用体外转录体系产生单链RNA探针探针5、标记物的选择、标记物的选择 放射性同位素放射性同位素 非放射性同位素非放射性同位素地高辛（地高辛（Digoxigenin）-11-dUTP的结构的结构第二节第二节 杂交和洗膜杂交和洗膜1、杂交的速率与探针长度及复杂性、杂交的速率与探针长度及复杂性示示t1/2和杂交探针长度之间的关系和杂交探针长度之间的关系2、杂交的最适条件、杂交的最适条件 杂交分子的稳定性杂交分子的稳定性 温度温度 杂交的严紧性

5、杂交的严紧性 高温高温/低盐低盐第三节第三节 检测与分析检测与分析非放射性非放射性DNA标记和检测程序标记和检测程序例：转基因植物的检测例：转基因植物的检测抗生素筛选、抗生素筛选、PCR、Southern、Northern、Western 双酶切检测双酶切检测 单酶切检测单酶切检测R0代转化子的代转化子的Southern分析分析转化子转化子R1后代的后代的Southern分析分析 如何判断插入拷贝数？如何判断插入拷贝数？与含有不同拷贝数（与含有不同拷贝数（1、5、10）的质粒杂交结果做对照）的质粒杂交结果做对照通过多个单酶切结果判断通过多个单酶切结果判断 通过选择酶切位点和探针位置，可进行通过

6、选择酶切位点和探针位置，可进行comprehensive杂交杂交，以判断外源插入片段是否串，以判断外源插入片段是否串联排列，以及排列方向联排列，以及排列方向 原位杂交（原位杂交（in situ hybridization，ISH） 利用含有互补序列的利用含有互补序列的DNA或或RNA探针直接检测在染色体、探针直接检测在染色体、细胞或组织内特定细胞或组织内特定DNA或或RNA序列的技术序列的技术 广泛应用于检测染色体的结构变异、外源染色体的渗入和广泛应用于检测染色体的结构变异、外源染色体的渗入和转基因的分子细胞遗传学鉴定等转基因的分子细胞遗传学鉴定等 荧光原位杂交荧光原位杂交 （fluoresc

7、ence in situ hybridization，FISH）习题习题1 某人在做某人在做Southern杂交时，为节省时间，完成凝胶电泳后，杂交时，为节省时间，完成凝胶电泳后，未经未经NaOH溶液浸泡凝胶，就直接将溶液浸泡凝胶，就直接将DNA从凝胶转至硝酸从凝胶转至硝酸纤维素膜上，然后应用标记探针杂交，结果发现放射自显纤维素膜上，然后应用标记探针杂交，结果发现放射自显影后胶片上一片空白。请问应如何解释这一结果。影后胶片上一片空白。请问应如何解释这一结果。习题习题2 2个正常个体生育一个患有唐氏综合症（个正常个体生育一个患有唐氏综合症（21号染色体三体）号染色体三体）的病儿，利用的病儿，利用1段段21号染色体探针，