实验一底物浓度对酶活性的的影(带图片)3

1、实验一 底物浓度对酶活性的影响碱性磷酸酶米氏常数的测定一、实验原理 在温度、PH和酶浓度一定时，底物浓度对酶活性（V）的影响，可用米氏方程表示为： V=式中Vmax为最大反应速度，Km表示米氏常数，S表示底物浓度，当 V=Vmax时，KmS。 Km是酶的特征性常数，测定酶的Km值是研究酶性质的重要方法之一。大多数酶的Km值在0.01100mM之间。对于不同的底物，酶有不同的Km值。 本实验以碱性磷酸酶为例，测定在不同底物浓度时酶活性的变化。然后再分别以 为横座标，以 为纵座标作图，从图上可以方便地求出碱性磷酸酶的Km值。 在本实验中，利用分光光度比色法测定酶的活性。碱性磷酸酶可作用于多种底物。

2、当它作用于磷酸苯二钠时，释放出酚。酚在碱性溶液中与4氨基安替比林作用，并经铁氰化钾氰化生成红色的醌类化合物，该化合物在510nm处有显著光吸收。与标准酚的溶液作对照或制作标准曲线，可计算出在不同底物浓度时酶的活性。显色反应的原理如下：二、试剂： 酚贮存标准液：溶解（AR）酚1g于0.1mol/L盐酸中，用0.1mol/L盐酸稀释至1L。此酚溶液含量约为1mg/mL。须进行标定。标定方法见上海市医学化验所主编临床生化检验上册第十章，酚类测定。 酚应用标准液（0.1mg/mL）：使用前将酚贮存标准液用蒸馏水稀释10倍。此液只能保存23天。 0.1mol/L碳酸缓冲液（pH=10）：溶解3.18g无

3、水碳酸钠和1.68g碳酸氢钠于500mL蒸馏水中。 0.5mol/L NaOH 500mL。溶解10g NaOH于500mL蒸馏水中。 0.01mol/L Tris-醋酸缓冲液（PH=8.8）：配制0.1M Tris溶液100mL，另配制0.1M的醋酸镁溶液100mL。将二种溶液混合，加蒸馏水至900mL。用1醋酸调节pH至8.8，再用蒸馏水加至1L。 0.5铁氰化钾溶液：分别溶解5g铁氰化钾和15g硼酸于二份400mL蒸馏水中，将二种溶液混合，加蒸馏水至1L，棕色瓶保存。 0.3 4氨基安替比林溶液：溶解3g 4氨基安替比林和42g硫酸氢钠于1000mL蒸馏水中。置棕色瓶中冰箱保存。 0.0

4、4mol/L底物溶液：溶解10.16g的磷酸苯二钠（含二个结晶水）于1000mL煮沸冷却的蒸馏水中，加氯仿数滴，贮于棕色瓶中，冰箱保存，可用一周。 5mg/100mL碱性磷酸酶溶液：溶解5mg碱性磷酸酶（Sigma,No.3877）于100mL pH=8.8 Tris-醋酸缓冲液中，冰箱保存。三、操作 酶反应进程曲线的制作。该曲线有助于找到合适的酶反应时间以测定初速度，以及估计出合适的酶量与底物浓度，为米氏常数测定作准备。A取五支试管，编号，依次加入0.4mL底物溶液，0.9mL碳酸缓冲液，0.6mL蒸馏水。另取同样数量的试管，编号，作为空白对照管，用蒸馏水代替底物溶液。B充分混匀，置37水浴

5、中，保温5分钟。C在各管中加入碱性磷酸酶溶液0.1mL，立即混匀，在37水浴中，分别准确反应5，10，15，20，25分钟。D反应用1.0mL 0.5mol/L的NaOH终止，接着依次加入1.0mL 4氨基安替比林，2.0mL铁氰化钾溶液，充分混匀，10分钟后，测定OD510或A510。E分别以OD510为纵座标和反应时间为横座标，画出酶反应进程曲线。米氏常数的测定 取8支试管，编号，按下表操作，注意准确吸取酶和底物的量。0123456标准管0.04M底物（mL）00.10.20.30.40.81.00PH10碳酸缓冲叶（mL）0.90.90.90.90.90.90.90.9蒸馏水（mL）1.

6、00.90.80.70.60.201.0混匀，37保温5分钟酚标准应用液（mL）00000000.1酶液（mL）0.10.10.10.10.10.10.10充分混匀，37准确反应10分钟（勿超过37）终止反应的方法，同操作（1）中所述，以0号管为空白对照，测定各管的OD510，记录结果。四、结果： 计算出各管的底物浓度S，用mM表示。 利用公式：C为浓度，计算出各管的酶活性U，用酶活力单位数表示。本实验中，定义在37下，10分钟产生1mg酚为一个酶活力单位。 将米氏方程式转化为Lineweaver-Burk方程式，得 = ·。以为横座标，以为纵座标作图。为直线斜率。纵坐标的截距为 ，

7、直线与横座标相交于，以求得Km值。实验二 蛋白质浓度测定双缩脲法目的要求学习双缩脲法测定蛋白质的原理和方法。原理具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应，因此蛋白质在碱性溶液中，能与Cu2形成紫红色络合物，颜色深浅与蛋白质浓度呈正比，故可用来测定蛋白质的浓度。试剂和器材一、测试样品 标准蛋白溶液 10mg/mL牛血清白蛋白溶液或相同浓度的酪蛋白溶液（用0.05M氢氧化钠溶液配制）。作为标准用的蛋白质要预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度称量、配制成标准溶液。 测试样品液 人（鸭）血清（稀释10倍）。测定其它蛋白样品应稀释适当倍数，使其浓度在标准曲线测试范围内。二、试剂 双缩脲试剂

8、：将0.175g硫酸铜（CuSO4·5H2O）溶于15mL蒸馏水，置于100mL容量瓶中，加30mL浓氨水，30mL冰冷的蒸馏水和20mL饱和NaOH溶液，摇匀，室温放置12小时，再以蒸馏水定容至100mL后，摇匀，备用。三、器材 试管、试管架、恒温水浴、752型分光光度计操作方法一、 标准曲线的绘制 取6支干试管，按下表操作。012345标准蛋白液(mL)00.20.40.60.81.0蛋白浓度(mg/mL)02.04.06.08.010.0蒸馏水（mL）1.00.80.60.40.20.0双缩脲（mL）4.04.04.04.04.04.0充分混匀后，室温下（2025）放置30分钟

9、测A540值 以A540为纵座标，蛋白质浓度为横座标，绘制标准曲线。二、样品测定 取2支试管，按下表操作。试管01血清稀释液（mL）00.5蒸馏水（mL）1.00.5双缩脲（mL）4.04.0充分混匀后，室温下（2025）放置30分钟A540三、计算血清样品蛋白质含量（g/100mL血清）×103×100固体样品蛋白质含量（）×100其中，Y为标准曲线查得蛋白质的浓度（mg/mL），N为稀释倍数，V为血清样品所取得体积（mL），c为样品原浓度。注意事项（1） 本法应用范围，因不同书籍报道，数值不一。本实验测定范围110mg蛋白质。（2） 须于显色后30分钟内比色测

10、定。30分钟后，可有雾状沉淀发生。各管由显色到比色的时间应尽可能一致。（3） 有大量脂肪性物质存在时，会产生混浊的反应混合物，这时可用乙醇或石油醚使溶液澄清后离心，取清液再测定。实验三 糖的薄层层析一、原理 层析法是利用混合物中各组分物理化学性质的差别（如吸附力，溶解度，分子形状、大小和极性等），使各组分以不同的程度分布在两相中。其中固定不动的称固定相，流过此固定相的液体或气体称流动相。从而使各组分以不同的速度随流动相向前移动而达到分离的目的。 20世纪初发现植物中各种颜色的色素可以在吸附柱上流动后排列成色谱，从而可以分离提取植物色素，故称为色谱分离法。后来无色物质也可利用吸附柱分离。1944

11、年开始用滤纸作为固定相出现了纸层析后，层析法不断发展，成为生物化学中最常用的方法之一。根据其层析过程的机理不同，层析可分为以下几种：（1） 吸附层析：利用吸附剂对各种物质吸附能力的不同，来达到分离的目的。（2） 分配层析：利用各种不同的物质在二种不同溶剂中的分配系数的不同而达到分离的目的。（3） 离子交换层析：是利用离子交换剂对需要分离的各种离子有不同的亲和力，而使其达到分离的目的。（4） 凝胶层析（分子筛层析）：是根据混合物中各种分子的大小及形状不同，通过凝胶时，分子的扩散移动速率各异，而使大小不同的分子得到分离。（5） 亲和层析：是利用高分子物质能与相应的配基特异性的可逆结合的原理而进行分

12、离。 层析法又按操作的方式不同，可分为柱层析、纸层析和薄层层析等。 硅胶具有吸附其它物质的性能，而且它对各种糖的吸附能力是各不相同的。本实验就利用这种吸附能力的差异，将硅胶在玻璃板上均匀地铺成薄层，而后将糖的混合液点在薄层上，再用乙酸乙酯、甲醇、冰醋酸和水按一定比例构成的混合液为展开剂进行层析，能使混合的糖分离。再用Molish氏反应使糖显色，其反应式如下： 糖 糖醛（或糖醛的衍生物） 糖醛（或糖醛衍生物）萘酚(1-萘酚)紫红色物质 层析的结果，可测得被测物质的Rf 值。Rf值是用来表示物质被分离后位置的数值，即物质的迁移率。它是被测物质的移动距离与溶剂移动距离之比。一般应用同一吸附剂和同一溶

13、剂系统展开时，其Rf值应相对恒定。因此可以根据Rf值来鉴定被分离的物质。但是被测物质Rf值尚与所用的操作方法、吸附剂的性质、薄层的厚度、溶剂的质量、滴加样品的数量、以及层析缸中蒸汽的饱和度等条件有关。为了避免上述因素的影响，一般都使用已知样品与被测样品在同一薄层上，在相同条件下层析，对照所得的Rf值而进行定性鉴定。二、试剂（1）硅胶G（2）2乳糖溶液（4）2葡萄糖溶液（5）2乳糖、2葡萄糖等体积的混合液（7）展开剂：乙酸乙酯甲醇冰醋酸水（12：3：3：2）（8）萘酚硫酸试剂（Molish试剂）：15萘酚乙醇溶液21mL，加浓硫酸13mL，再加乙醇81mL及水8mL混匀置棕色瓶中。要新鲜配制。

14、（9）0.5羧甲基纤维素钠（CMC）溶液三、操作（1）薄板制备：称取硅胶G 1g于烧杯中，加3mL 0.5羧甲基纤维素钠（CMC）溶液，用玻璃棒调成均匀糊状，铺于载波片上。晃动载波片，使之均匀分布。置室温20分钟凝固后，置110干燥箱烘半小时备用。（2）点样：用毛细管分别吸取乳糖、葡萄糖、以及二者的混合液各少许，在距载波片一端1.5cm的起点线处，三等分分别点样。点样的直径应小于3mm，待样品干燥后展开。（3）展开：慢慢沿缸壁注入展开剂约0.5cm高度（注意展开剂的高度必须在薄板的起点线以下），展开剂其体积比为乙酸乙酯：甲醇：冰醋酸：水12：3：3：2。将薄板60°倾斜放置于层析缸中

15、，密闭层析缸，让其展开。当溶剂的前沿升高到距薄层顶端1cm处，取出薄板，用铅笔在展开剂前沿划线，用电吹风将展开剂吹干。（4）显色：将薄板全部浸于萘酚硫酸试剂中，迅速取出，用电吹风（高温档）均匀吹至斑点出现为止。（5）求出各点的Rf值。附注（1）Rf值求法： Rf（2）薄层层析法的优点是：设备简单，操作容易。层析展开时间短，只需数分钟到几小时，即可获得结果。分离时几乎不受温度的影响。可采用腐蚀性的显色剂，而且可以在高温下显色。分离效率高。实验四 凝胶渗透层析法一、原理 凝胶渗透层析是按照溶质分子的大小不同而进行分离的一种层析技术。当大小不同的溶质分子通过凝胶柱时，由于凝胶颗粒内部的网络结构具有分

16、子筛效应，分子大小不同的溶质就会受到不同的阻滞作用。分子量大的因不易渗入网络，被排阻在凝胶颗粒之外，因而所受到的阻滞作用小，先流出层析床，分子量小的因能渗透到网络内部，洗脱流程长，所受到的阻滞作用大，后流出层析床，这样就可以达到分级分离的目的。二、目的与要求 利用SephadexG-25凝胶层析，分离一含有溶质分子大小不同的样品，并测出洗脱曲线，通过实验了解并熟悉凝胶渗透层析的原理和实际应用。三、仪器与试剂 层析柱；恒流泵（或恒压瓶）；自动部分收集器 吸管；刻度试管；752型分光光度计 样品：血红蛋白、核黄素 洗脱液：0.05M、PH4.3磷酸缓冲液（或蒸馏水）四、操作 凝胶的处理溶涨与浮选：

17、将凝胶放入过量的水中浸泡六小时（沸水浴中为两小时）。浸泡后搅动凝胶再静置，待凝胶沉淀后，用倾泌法去除上层清细粒悬液，如此反复数次。平衡：将浸泡后的凝胶抽干，用十倍量的洗脱液处理约一小时，搅拌后继续去除上层细悬浮液。 装柱：将层析柱垂直装好，加适量洗脱液除气泡，待气泡赶完后，使洗脱液在底端留至约1cm高即可关闭开关。将处理好的凝胶在烧杯内用1倍的溶液搅调成悬浮液，自柱顶部沿管内壁缓缓加入柱中。待底部凝胶沉积至12cm时，缓缓打开底端出口管，随之继续添加凝胶悬浮液直至床体积沉积至20cm（据层析柱高度而定）高度为止（操作中应注意防止产生气泡与节痕）。 平衡：柱装好后，使层析床稳定510分钟，然后接

18、上恒流泵打开出口，用2倍于床体积的洗脱液平衡，使层析床稳定。恒流泵要预先调好流速，流速为1015滴/分（以下均同）。 注意：在洗脱时要将恒流泵至层析柱的连接管内气泡全部排除，以免影响流速。此外如果需要温度平衡则同时在层析柱夹套内通入恒温冷却水。 层析床校正：为了取得良好的层析效果，在层析前需要对所装的层析柱进行检查。检查方法如下： 首先用肉眼观察层析床是否均匀，有没有“纹路”和气泡，床表面是否平整，然后再用兰葡聚糖2000进行层析行为的检查，在层析柱内加进1mL（2mg/mL）兰葡聚糖2000，然后用洗脱液进行洗脱（洗脱的流速同前），在层析中当移动的指示剂色带狭窄均一则说明装柱良好。检查后再经

19、洗脱液平衡即重复步骤3即可使用。 加样与洗脱：打开平衡好的层析柱底部出口，使柱内溶液流至床表面时关闭，将吸取0.5mL样品的加样滴管在距床表面上1mm处沿管壁轻轻转动加进样品，加完后，再打开底端出口使样品流至床表面，用少量洗脱液同样小心清洗表面12次，使洗脱液流至床表面，然后将洗脱液在柱内约加至4cm高，接上恒流泵或恒压洗脱瓶并调好流速即开始洗脱（注意在加样和洗涤过程中防止冲坏床表面）。 收集与测定：收集时可用自动部分收集器按每管2mL收集或手工操作分管收集15管，收集后用752型分光光度计在451nm波长处以洗脱液为空白管溶液对每管收集液进行光吸收测定。测定后以收集管数（或mL数）为横座标，

20、光密度为纵座标对应作图。注：市售的凝胶如需彻底处理，可在溶涨后再用0.5mol/L NaOH-0.5mol/L NaCl溶液在室温中浸泡半小时，但注意必须避免在酸或碱中加热。另外用过的凝胶柱如需再生时，可用0.1mol/L NaOH-0.1mol/L NaCl，洗涤以去掉堵住凝胶网孔的杂质，然后用蒸馏水洗至中性备用，一般使用几次后就需再生。实验五 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离乳酸脱氢酶同工酶（活性染色鉴定法）目的要求（1）复习有关同工酶的知识。（2）掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳分离乳酸脱氢酶同工酶、底物染色技术及有关原理。原理1959年Markert等用电泳的方法将牛心肌提纯的LDH结晶分离出5条区带，靠

21、近阳极一端的称LDH1，靠近阴极一端的称为LDH5，其余3种，由阳极到阴极依次命名为LDH2,LDH3,及LDH4。它们均具有LDH催化活性，从而首先提出了同工酶（isoenzyme）的概念。目前，已知LDH同工酶是由H亚基及M亚基按不同比例组成的四聚体，它们是H4(LDH1),H3M(LDH2),H2M2(LDH3),HM3(LDH4)及M4(LDH5)5种，这些LDH同工酶广泛分布于动物的各种组织以及微生物和植物中。心肌中以LDH1含量高，骨骼肌及肝中LDH5含量高。LDH同工酶底物染色显色反应如下：乳酸 NAD+ PMSH2 NBT LDH 丙酮酸 NADH(H+) PMS NBTH2(

22、蓝紫色甲 )反应式中PMS为甲硫吩嗪(phenazine methosulfate)，NBT为氯化硝基四氮唑蓝（nitro-blue tetrazolium chloride）的缩写，它们都是接受电子的染料。LDH与底物染色液在37温浴中脱下的氢最后传递给NBT生成蓝紫色的NBTH2称为甲 ，此物不溶于水，有利于显色后区带的保存，但可溶于氯仿及95乙醇（9：1）的混合液。因此，电泳后的显色区带可通过浸泡法浸出，于560nm处比色，也可用光吸收扫描仪扫描得出LDH同工酶各成分的相对百分含量。目前，LDH及同工酶检测已广泛应用于临床，作为某些疾病鉴别诊断的依据，常用醋酸纤维素薄膜电泳，琼脂糖电泳及

23、聚丙烯酰胺电泳分离LDH及同工酶，这3种不同支持物电泳及染色原理完全相同，但灵敏度不同。因而正常值不完全相同。本实验用连续PAGE法分离LDH及同工酶。试剂与器材一、 材料 人（动物）未溶血新鲜血清，动物组织提取液组织重量与组织匀浆缓冲液体积比为1：5或1：10（g/mL）。二、试剂1PAGE有关试剂凝胶贮液（28Acr-0.735Bis）：丙烯酰胺（Acr）28.0g，甲叉双丙烯酰胺（Bis）0.735g,加重蒸馏水使其溶解后定容至100mL。凝胶缓冲液（pH8.9 Tris-HCl）：量取1mol/L HCl 48mL，称取Tris（三羟甲基氨基甲烷）36.6g，TEMED(N,N,N,N

24、-四甲基乙二胺)0.23mL，加重蒸馏水至80mL使其溶解，调PH8.9，然后加重蒸馏水使其溶解后定容至100mL置棕色瓶，4保存。电极缓冲液（pH8.3 Tris-甘氨酸）：称Tris 6.0g，甘氨酸28.8g，加蒸馏水至900mL，调pH8.3后，用重蒸馏水定容至1000mL，置试剂瓶中，4保存，临用前稀释10倍。AP溶液：分析纯过硫酸胺（AP）0.14g，加重蒸馏水至100mL，置棕色瓶，4贮存，仅能用一周，最好当天配制。脱色液：7乙酸溶液。（保存液：甘油10mL，冰乙酸7mL,加蒸馏水至100mL。）2LDH同工酶染色贮存液（1）5mg/mL氧化型辅酶溶液：称50mg NAD+，加蒸

25、馏水10mL，置棕色瓶，4贮存可稳定两周。（2）1mol/L乳酸钠溶液：取60乳酸钠9.25mL，加蒸馏水定容至50mL。置棕色瓶，4贮存。（3）0.1mol/L氯化钠溶液：称0.584g NaCl，加蒸馏水溶解并定容至100mL。（4）1mg/mL甲硫吩嗪（PMS）溶液：称5mg PMS，加蒸馏水5mL使其溶解。（5）1mg/mL氯化硝基四氮唑蓝（NBT）溶液：称20mg NBT，加蒸馏水20mL使其溶解。PMS及NBT溶液遇光不稳定，应置于棕色瓶中，4贮存，若黄色溶液变绿，则不能使用，需要重新配制。（6）0.5mol/L pH7.5 磷酸盐缓冲溶液（或Tris-HCl）。(3制备组织匀浆缓

26、冲液,0.01mol/L pH6.5磷酸钾盐缓冲液。)三、器材稳压、稳流电泳仪（100mA，600V），夹芯式垂直板电泳槽，吸量管（1，5，10mL），微量注射器（50l），烧杯（25，50mL），培养皿（12cm）,生化培养箱（37），可见分光光度计或光密度扫描仪，窄滤纸条，玻璃纸。操作方法一、安装及配制1夹心式垂直板电泳槽的安装（1）装上贮槽和固定螺丝销钉，仰放在桌面上。（2）将长、短玻璃板分别插到凹形硅胶框的凹形槽中。注意勿用手接触灌胶面的玻璃。（3）将已插好玻璃板的凝胶模平放在上贮槽上，短玻璃板应面对上贮槽。（4）将下贮槽的销孔对准已装好螺丝销钉的上贮槽，双手以对角线的方式旋紧螺丝帽。

27、（5）竖直电泳槽，在长玻璃板下端与硅胶模框交界的缝隙内加入已融化的1琼脂（糖）。其目的是封住空隙，凝固后的琼脂（糖）中应避免有气泡。2配制pH 8.9，7% 凝胶混合液（20mL） 本实验采用28Acr-0.735%Bis凝胶贮液。取出各种贮液，平衡至室温后，按凝胶缓冲液：凝胶贮液：水：AP溶液1：2：1：4（各2.5，5.0，2.5，10mL）的配比配制20mL ,7.0凝胶混合液。前3种溶液混合在一小烧杯内，AP溶液单独置另一小烧杯。准备灌胶。二、灌胶 本实验采用连续PAGE，灌胶方法如下： 将配制好的两小烧杯溶液，（抽气后）轻轻混匀，立即（用细长头的滴管）将凝胶混合液倒（加）到凝胶模长、

28、短玻璃板间的狭缝内，当加至距离玻璃板上缘约0.5cm时，停止加胶，轻轻将样品槽模板插入。在上下贮槽中倒入蒸馏水，液面不能超过上贮槽的短玻璃板，防止蒸馏水进入凝胶中。其作用是增加压力，防止凝胶液渗漏。凝胶液在混合后15分钟开始聚合，约0.51小时，完成聚合作用。聚合后，在样品槽模板梳齿下缘与凝胶界面间有折射率不同的透明带。看到透明带后继续放置30分钟。待凝胶聚合后，小心取出样品模板，用窄滤纸条吸去样品槽中的液体。放掉上下贮槽中的蒸馏水。倒入电极缓冲液至电极槽中，并浸没过短玻璃板。三、预电泳 为防止LDH及其同工酶受凝胶聚合后残留物（如AP等）的影响，引起酶的钝化或其它人为效应，在加样前，应进行预

29、电泳，电泳条件为10mA，1小时。关闭电源后准备加样。四、加样 取1015l血清（或组织匀浆），加等体积40蔗糖（内含少许1溴酚蓝）混合后，用微量注射器吸取2030l样品，小心加到凹形样品槽内。五电泳 加样品后，打开电源，将电流调至10mA，待样品进入分离胶后，改为2025mA，当溴酚蓝前沿距离硅胶框下缘12cm时，将电流调回零，关闭电源。六、染色、脱色（与制干板） 按表的顺序，在临用前将有关试剂混合配制25mL LDH活性染色液。LDH活性染色液的配制贮存液NAD+乳酸钠NaClNBTPMS磷酸缓冲液用量/mL4.02.52.510.01.05.0 电泳结束后，取下凝胶模，剥下硅胶框，撬开玻

30、璃板，在凝胶右下角切除一小角作为标记，小心取出凝胶板，将其放在盛有染色液的培养皿中，置37生化培养箱中保温2030分钟，待LDH同工酶呈现蓝紫色区带，即可用蒸馏水洗去染色剂，加脱色液终止酶反应并使底色脱净，（将凝胶板放在保存液中浸泡23小时。按PAGE法将凝胶板放置在二层玻璃纸中间，自然干燥制成干板。干板经扫描可得知LDH同工酶相对含量）。注意事项（1） 组织匀浆制备时，一般用0.01mol/L pH 6.5磷酸盐缓冲液，此溶液需4预冷。组织重量（g）与缓冲液体积（mL）之比为1：5或1：10。用玻璃匀浆器在冰浴中匀浆，将匀浆液置离心管中10000r/min，离心1015分钟（4），取上清液进

31、行电泳。（2） 电泳时，电流不要太高，应防止热效应引起LDH同工酶失活。（3） LDH同工酶活性染色时间不要太长，一般以1530分钟为宜，当大多数条带均显蓝紫色即可终止染色。实验六 蛋白质分子量测定垂直板SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）一、原理 十二烷基硫酸钠（SDS）是一种阴离子去污剂，由于SDS分子本身带有负电荷，能够与蛋白质的疏水区相结合，使蛋白质伸展和解聚，从而使蛋白质呈一致的强负电荷。当采用加有SDS的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳时，利用聚丙烯酰胺凝胶的分子筛效应，可以进行蛋白质分子量的测定。 在用该方法进行分子量的测定中，利用某些已知分子量的指示蛋白与经SDS处理后解离成肽链的

32、蛋白质样品进行电泳比较，根据蛋白质的电泳迁移率，在一定分子量范围内与分子量的对数所呈的线性关系，就可以测定出肽链的分子量。当同时有还原剂存在时，多肽链内部的双硫键则被断开，形成巯基。因此用该方法测得的是蛋白质亚基的分子量。 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳可以采用圆盘电泳的形式，也可以采用垂直板状电泳的形式，其操作步骤大致相同。另外，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳亦分为连续体系和不连续体系。本实验采用垂直板状不连续系统的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，了解和掌握利用该方法测定分子量的技术。二、仪器与试剂 垂直板电泳槽；电泳仪；微量注射器 标准分子量指示蛋白：低分子量范围10000100000 蛋白样品：由实验室给

33、定 染色液：250mg考马斯亮兰G250溶于含有9冰醋酸、45.5甲醇和45.5水的100mL混合液中。 脱色液： 冰醋酸：甲醇：水7.5：5：87.5（V/V） 电泳缓冲液（pH8.9）：Tris 6.055g，甘氨酸28.82g，加水溶解后，加入10 SDS 20mL，再加水定容至2000mL。 30 Acr-Bis： 73.0g丙烯酰胺（Acr），2.0g甲叉双丙烯酰胺（Bis），用水充分溶解后，再定容至250mL。 浓缩胶缓冲液：Tris6.005g，10% SDS 4mL，加水溶解后，用HCl调至pH6.8，再加水定容至100mL。 分离胶缓冲液：Tris18.165g，10 SDS

34、 4mL，加水溶解后，用HCl调至pH8.8，再加水定容至100mL。 10过硫酸铵（当天配制）三、方法与步骤（1）垂直板状电泳槽，玻片等器材应用95的酒精清洁。1的封槽琼脂用对半稀释的电泳缓冲液配制。（2）10的分离胶的配制，按下列配方在50mL烧杯中，配制12.5mL凝胶液用于浇板。A、 30丙稀酰胺Bis 4.16mLB、 4×分离胶缓冲液 3.12mLC、 H2O 5.11mLD、 10过硫酸铵 150lE、 TEMED 10l（3）迅速浇板，使凝胶面与上槽边缘距离2.53.0cm，立即用少许丁醇H2O封闭胶面以隔绝空气。待完全聚合后，倾去胶面液体，用滤纸吸干表面。（4）5的

35、浓缩胶的制备，按下列配方在25mL烧杯中，配制5mL浓缩胶。 A、30丙稀酰胺Bis 0.833mL B、4×浓缩胶缓冲液 1.25mL C、H2O 2.9mL D、过硫酸铵晶体 少许 E、TEMED 5l（5）浇板后，迅速插入模梳（或先插入模梳再注入胶液）。聚合后轻轻取出模梳。（6）上下槽中注入适量电泳缓冲液。（7）蛋白质样品应预先测定浓度，电泳样品的准备方法如下：蛋白质样品X份，H2O Y份，溴酚蓝染料1份，样品缓冲液（含或不含巯基乙醇）1份，使电泳样品中的蛋白质浓度达到1mg/mL为宜。 两种样品缓冲液的配制：4×浓缩胶缓冲液30mL，巯基乙醇12mL（或用等体积的H

36、2O），SDS 7.2g，加H2O至50mL。（8）电泳前，样品煮沸2至3分钟。 （9）每个样品池中加样510l。另用已知分子量的标准系列蛋白质20l作对照。见附录。（10）上槽接负极，下槽接正极，电压200V，电泳终点由溴酚蓝染料指示前沿决定。（11）终止电泳，取出凝胶，标记溴酚蓝前沿。用考马斯亮兰染色26小时，在脱色液中浸洗12小时以上，至背景无色为好。（12）分子量测定 将脱色的凝胶，从正极端起量取每条电泳带的迁移距离（或算出迁移率），即Rf值。以标准分子量指示蛋白的分子量对数为纵座标，以相应的迁移距离为横座标制作工作曲线，从曲线中查出待测样品的分子量。附：SDSPAGE低分子量标准蛋白

37、的组成：蛋白质名称 分子量磷酸化酶B 94000牛血清白蛋白 67000肌动蛋白 43000碳酸酐酶 30000烟草花叶病毒外壳蛋白 17500实验七 管式凝胶等电聚焦一、原理 每一种两性化合物例如蛋白质等都有一个等电点pI，当溶液的pHpI时，该化合物所带的净电荷为零；当pHpI时，化合物带正电荷，反之化合物带负电荷。在直流电场的作用下，带正电荷的颗粒向阴极移动，带负电荷的颗粒向正极移动。当将样品两性化合物置于由两性载体所建立起来的pH梯度体系中进行电泳时，各种两性化合物就将分别被浓集在相当于其等电点的pH位置，这即为等电点聚集，由于不同的两性化合物其等电点不同，因而可以达到分离的目的。 在

38、实验过程中，往往由于通电时产生的热量引起溶液的对流致使已分离的曲带重新混合，因此在电泳中需要有抗对流的稳定介质，采用聚丙烯酰胺凝胶作为稳定介质的即称为凝胶等电聚焦，本实验采用圆盘电泳的装置进行实验，因此亦称为管式凝胶等电聚焦。 聚丙烯酰胺凝胶有光聚合和化学聚合两种方法，本实验采取光聚合法。加样分为在单体聚合后加样，或是先将样品混合在单体配制液中然后和单体一起聚合两种，本实验采用后一种。 在聚焦后，通过对凝胶染色或是光密度扫描的方法，将样品带显示出来，然后再与未经染色的参比凝胶管所测出的pH梯度曲线比较，而对应出样品带所处的相当其等电点的pH位置。二、目的与要求 测定一蛋白质样品的等电点，通过实

39、验了解等电聚焦的原理，掌握凝胶等电聚焦的实验技术。三、仪器与装置 圆盘电泳槽 ；小玻管：内径5mm，外径7mm，长10cm，管口磨平一端配有橡皮赛（或用胶布贴封）；日光灯源：40W×2日光灯组合箱（内装有小玻管支架）；电泳仪：500W，50mA ；微量注射器：100l供加样用；普通注射器：10 mL配有长针头；洗耳球：取凝胶用；直尺、刀片、试管（20支）；固定缸、染色缸、脱色缸为三只大培养皿；pHS2型酸度计：准确±0.02PH(或pHS3型酸度计)四、试剂1、丙烯酰胺（Acr）；2、甲叉双丙烯酰胺（Bis）；3、两性载体（Amphaline）pH 410；4、核黄素；4mg；5、样品：牛血清白蛋白 2mg/mL ；6、上电极溶液（）：5磷酸溶液；7、下电极溶液（）： 5乙二铵溶液；8、12三氯乙酸。五、操作凝胶系统的配制（按总体积20mL计算）先将Acr和Bis称好，用10mL水使其溶解，然后按比例分别加入其他试剂，最后用水定容至20mL。试剂 用量 比例AcrBis核黄素4mg(%)Amphaline 20（pH 4-10）样