食品微生物技术(学时)

1、 第一节第一节 无菌操作技术和灭菌技术无菌操作技术和灭菌技术n一、无菌操作的概念一、无菌操作的概念n无菌技术（无菌技术（ aseptic technique)aseptic technique)： 在操作过程中如分离转接及培养物在操作过程中如分离转接及培养物时，防止被其他生物污染的技术称为无时，防止被其他生物污染的技术称为无菌技术。菌技术。 微生物小，肉眼看不到，而且无处不在。微生物小，肉眼看不到，而且无处不在。在微生物的研究应用中，不仅需要从混杂的天在微生物的研究应用中，不仅需要从混杂的天然微生物中分离出特定的微生物，而且还必须然微生物中分离出特定的微生物，而且还必须随时保持微生物的纯洁。随

2、时保持微生物的纯洁。二、抑杀菌的概念二、抑杀菌的概念灭菌、消毒、防腐、商业灭菌灭菌、消毒、防腐、商业灭菌n1 1 灭菌（灭菌（Sterilization)Sterilization)：n采用强烈的理化因素使采用强烈的理化因素使物体内外部的一物体内外部的一切微生物死亡切微生物死亡的措施称为灭菌。的措施称为灭菌。n可分为：可分为：杀菌（杀菌（bacteriocidationbacteriocidation) )溶菌（溶菌（bacteriolysisbacteriolysis)2 2 消毒（消毒（disinfection)disinfection)n 采取较温和的理化因素，仅杀死物体表采取较温和的理

3、化因素，仅杀死物体表面和内部面和内部对人体有害的病原菌对人体有害的病原菌，而对被消，而对被消毒的物体基本无害的措施。毒的物体基本无害的措施。3 3 防腐（防腐（antisepsis):antisepsis):n 利用理化因素完全抑制霉腐微生物的生利用理化因素完全抑制霉腐微生物的生长、繁殖。长、繁殖。n 即通过各种抑菌作用（即通过各种抑菌作用（bacteriostasisbacteriostasis) )防止食品、生物制品等发生霉变腐烂的防止食品、生物制品等发生霉变腐烂的措施。如低温、干燥、缺氧、高糖、高措施。如低温、干燥、缺氧、高糖、高盐、加防腐剂等盐、加防腐剂等4 4 商业灭菌商业灭菌（co

4、mmercial sterilization):commercial sterilization):n 食品经过杀菌处理后，按照规定的食品经过杀菌处理后，按照规定的微生物检验方法，无活微生物检出或仅微生物检验方法，无活微生物检出或仅有少数检出，并在食品保存中不可能生有少数检出，并在食品保存中不可能生长、繁殖。这种灭菌方法称为商业灭菌。长、繁殖。这种灭菌方法称为商业灭菌。三、抑杀菌的方法与技术三、抑杀菌的方法与技术n1 1 低温杀菌技术：低温杀菌技术：n（1 1）巴氏杀菌（）巴氏杀菌（pasteurization)pasteurization)杀菌温杀菌温度一般是度一般是65856585处理处理

5、15301530分钟分钟经典的低温维持法：经典的低温维持法： low temperature holding method. LTH low temperature holding method. LTH 高温瞬时法：高温瞬时法： high temperature short timehigh temperature short time或或 flush point HTST.flush point HTST.适用于不适合高温灭菌的牛奶、果汁、适用于不适合高温灭菌的牛奶、果汁、啤酒、果酒等（啤酒、果酒等（98 98 ，数秒），数秒）n(2)(2)间歇杀菌法间歇杀菌法 fractional st

6、erilization fractional sterilization 或或tyndallizationtyndallization, ,有称丁达尔杀菌法或分段杀菌有称丁达尔杀菌法或分段杀菌法：方法是法：方法是8010080100度下煮度下煮15601560分，过夜，分，过夜，连续三天。适用于不耐热的培养基等。连续三天。适用于不耐热的培养基等。n（3 3）煮沸杀菌法）煮沸杀菌法n 100100下煮数分钟，物品在下煮数分钟，物品在100100度水中煮度水中煮1515分钟以上，可以杀死细菌和细菌的部分芽孢。分钟以上，可以杀死细菌和细菌的部分芽孢。在水中加如在水中加如1%5%1%5%的石炭酸效果更

7、好。的石炭酸效果更好。2 2 高温杀菌技术高温杀菌技术n（1 1）高压蒸汽杀菌法）高压蒸汽杀菌法 （normal autoclaving)normal autoclaving)n常用的温度是常用的温度是121121，15201520分钟。也有分钟。也有1151153030分钟。分钟。n是实验室常用的灭菌方法之一。是实验室常用的灭菌方法之一。n（2 2）连续加压蒸汽杀菌法）连续加压蒸汽杀菌法 （continuous autoclaving):continuous autoclaving):n135140135140，515515秒。秒。n在大规模的发酵工厂中做培养基灭菌用。在大规模的发酵工厂中做

8、培养基灭菌用。培养基在发酵罐中连续不断进行加热、培养基在发酵罐中连续不断进行加热、维持和冷却。维持和冷却。(3) (3) 超高温瞬时杀菌法超高温瞬时杀菌法 ultra high temperature shout time,UHTultra high temperature shout time,UHTn杀菌温度在杀菌温度在135150135150度度,26s,26s,可杀死微生物可杀死微生物营养体和耐热的芽孢营养体和耐热的芽孢. .广泛应用于各种果汁、广泛应用于各种果汁、牛奶、花生乳、酱油等液态食品。牛奶、花生乳、酱油等液态食品。（4 4）干热灭菌）干热灭菌 dry heat sterili

9、zationdry heat sterilization：n常用电热烘箱，常用电热烘箱，150170150170度维持度维持1212小时。玻璃器皿、金属等耐热小时。玻璃器皿、金属等耐热物品。物品。n（5 5）灼烧）灼烧 incineration incineration 或或 combustion:combustion:n是一种最彻底的灭菌方法。一般用是一种最彻底的灭菌方法。一般用于接种针、环等物品的灭菌处理。于接种针、环等物品的灭菌处理。3 3 其他物理因素的抑杀菌技术其他物理因素的抑杀菌技术n（1 1）辐射作用：）辐射作用： radiation sterilizationradiation

10、 sterilizationn利用电磁辐射产生的电磁波杀死微生物。利用电磁辐射产生的电磁波杀死微生物。常用的电磁波包括：微波、常用的电磁波包括：微波、(UV)(UV)、 X X射线射线和和r- r-射线等。射线等。n实验室灭菌常用紫外线照射。实验室灭菌常用紫外线照射。n（2 2）高渗作用：）高渗作用： 如如20%NaCl20%NaCl溶液中。生产上的果脯等溶液中。生产上的果脯等常用的糖浓度常用的糖浓度5070%5070%，盐浓度，盐浓度515%515%。n（3 3）超声波作用：）超声波作用：n超声波是频率大于超声波是频率大于20KHz以上的声波，是一种机械振以上的声波，是一种机械振动在媒质中的

11、传播过程。其作用原理是，当超声波强动在媒质中的传播过程。其作用原理是，当超声波强度超过某一空化阀值时，在液体中产生空化现象，它度超过某一空化阀值时，在液体中产生空化现象，它表现为泡核的振荡、生长、收缩及崩溃等一系列动力表现为泡核的振荡、生长、收缩及崩溃等一系列动力学过程。使细菌或病毒丧失毒力，甚至会使细菌形态学过程。使细菌或病毒丧失毒力，甚至会使细菌形态结构破裂和溶解，从而起到杀菌作用。结构破裂和溶解，从而起到杀菌作用。 超声波灭菌在医学上的应用n（4 4）过滤作用）过滤作用n孔径非常小，能阻挡细菌通过。它们可孔径非常小，能阻挡细菌通过。它们可用陶瓷、硅藻土、石棉或玻璃屑等制成。用陶瓷、硅藻土

12、、石棉或玻璃屑等制成。适用于除去对热不稳定的药品溶液或液适用于除去对热不稳定的药品溶液或液体物质中的细菌的方法。体物质中的细菌的方法。 4 4 化学因素的抑杀作用化学因素的抑杀作用（1 1）氧化剂）氧化剂 臭氧、氯、漂白粉、过氧乙酸。臭氧、氯、漂白粉、过氧乙酸。（2 2） 重金属盐类重金属盐类 汞（如汞（如HgClHgCl), ), 银、砷银、砷（3 3） 有机化合物有机化合物 酚类及衍生物、甲醛、醇类（如酒精）、酚类及衍生物、甲醛、醇类（如酒精）、抗生素等抗生素等现代灭菌技术的优缺点及发展趋势现代灭菌技术的优缺点及发展趋势 超高压灭菌、臭氧灭菌、辐照灭菌、脉超高压灭菌、臭氧灭菌、辐照灭菌、脉

13、冲电场灭菌、超声波灭菌等。冲电场灭菌、超声波灭菌等。四、常用无菌操作技术四、常用无菌操作技术n1. 1. 微生物培养常用器具及其灭菌微生物培养常用器具及其灭菌n试管等玻璃器皿等常用干热灭菌或高温试管等玻璃器皿等常用干热灭菌或高温高压蒸汽灭菌。高压蒸汽灭菌。n培养基、水等可用高温高压蒸汽灭菌的培养基、水等可用高温高压蒸汽灭菌的方法。方法。n接种针、环等可用灼烧（火焰）灭菌。接种针、环等可用灼烧（火焰）灭菌。2 2 接种室的空气灭菌接种室的空气灭菌n实验室的微生物接种多采用接种箱或在接实验室的微生物接种多采用接种箱或在接种室内操作。接种室内的用品及环境要达种室内操作。接种室内的用品及环境要达到基本

14、无菌状态。常用的方法有：到基本无菌状态。常用的方法有：n（1 1）紫外线照射）紫外线照射20302030分钟分钟n（2 2）化学消毒：如）化学消毒：如5%5%石炭酸全面喷洒，石炭酸全面喷洒，用甲醛熏蒸等用甲醛熏蒸等n（3 3）超净工作台）超净工作台n3 3 无菌操作的基本程序：无菌操作的基本程序：一般程序：一般程序：n接种室清洁消毒、工作台清洁消毒、用接种室清洁消毒、工作台清洁消毒、用具和手的清洁消毒、操作用具的消毒。具和手的清洁消毒、操作用具的消毒。微生物实验室安全操作的注意事项：微生物实验室安全操作的注意事项：n微生物和生物医学实验室生物安全通用准则微生物和生物医学实验室生物安全通用准则（

15、中华人民共和国卫生行业标准（中华人民共和国卫生行业标准（WS 233-2002） 本标准规定了微生物和生物医学实验室生物安全防护的基本原则、实验室的分级、各级实验室的基本要求。 ）五五 微生物的分离培养技术微生物的分离培养技术纯种分离技术是微生物学重要的基本技术。纯种分离技术是微生物学重要的基本技术。n（一（一 ）用固体培养基分离）用固体培养基分离n1 1 稀释倒平板法稀释倒平板法pour plate methodpour plate methodn2 2 涂布平板法涂布平板法 spread plate methodspread plate methodn3 3平板划线分离法平板划线分离法st

16、reak plate methodstreak plate methodn4 4 稀释摇管法稀释摇管法dilution shake culture dilution shake culture methodmethodn（二）、液体培养基分离（二）、液体培养基分离n采用稀释发进行液体分离，必须在同一稀采用稀释发进行液体分离，必须在同一稀释度的许多平行试管中大多数释度的许多平行试管中大多数95%95%以上表以上表现为不生长。现为不生长。n（三）、单细胞（单孢子）分离法（三）、单细胞（单孢子）分离法n单细胞分离法：采用显微分离法从混杂的单细胞分离法：采用显微分离法从混杂的群体中直接分离单个细胞或单

17、个个体进行群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养。培养。n（四）、选择培养分离法（四）、选择培养分离法n1 1用选择培养基直接分离用选择培养基直接分离n2 2富集培养富集培养n（五）、（五）、 二元培养法二元培养法n 如果培养物中含有二中微生物，而且是如果培养物中含有二中微生物，而且是有意识地保持二者之间的特定关系的培养有意识地保持二者之间的特定关系的培养物称为二元培养物。物称为二元培养物。 第二节第二节 微生物的观察与鉴定技术微生物的观察与鉴定技术n一、微生物的菌落观察一、微生物的菌落观察n菌落菌落colonycolony : :是指由耽搁微生物在适宜的固是指由耽搁微生物在适宜的固体培养基

18、表面或内部生长、繁殖到一定程体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度形成的肉眼可见的、有一定形态结构的度形成的肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体。子细胞生长群体。n菌落特征包括：菌落的形态、大小、边缘、菌落特征包括：菌落的形态、大小、边缘、质地、颜色质地、颜色 等，是微生物鉴定的重要依据等，是微生物鉴定的重要依据放线菌菌落二、显微镜观察技术二、显微镜观察技术n1 1普通光学显微镜普通光学显微镜n2 2 暗视野显微镜暗视野显微镜n3 3 相差显微镜相差显微镜n4 4荧光显微镜荧光显微镜n 5 5电子显微镜电子显微镜图4-1 普通光学显微镜图4-2 普通光学显微镜的构造 图4-5 显微镜的光

19、路图4-3 研究型(相差、荧光)显微镜图4-4 相差显微镜的成像原理 图4-6 大肠杆菌图4-7 黑曲霉图4-8 正在分裂的细菌图4-9 孢子与酵母三、微生物的计数三、微生物的计数n1 菌落计数法菌落计数法n定量的样品经稀释后加到固体培养基上，根据培养基上的菌落数检测样品中的微生物含量。单位： cfu(colony forming units).n2 显微镜直接计数法（又称全数法）显微镜直接计数法（又称全数法）n观察一定面积玻片上的微生物总数。也可以用血球计数板等 图5-1 Thoma血球计数板 A.正面图 B.纵切面图 1.血球计数板 2.盖玻片 3.计数室 16小格 25大格计数室 25小

20、格 16大格计数室 图5-2 计数室的两种刻度形式n3 3 阻抗法：阻抗法：n通过测量微生物代谢引起的培养基电特性通过测量微生物代谢引起的培养基电特性变化测定样品中微生物含量的一种快速检变化测定样品中微生物含量的一种快速检测方法。测方法。n培养基的电导率变化与生长曲线一致。培养基的电导率变化与生长曲线一致。n4 4 流动细菌计数法流动细菌计数法 ：n培养物在液流中被稀释，细胞被轴向分开，培养物在液流中被稀释，细胞被轴向分开，当流动的细胞遇到激光光束时反射回的散当流动的细胞遇到激光光束时反射回的散射光可用于计数射光可用于计数。n5 5 放射测量法放射测量法n把微量的碳把微量的碳1414，引入碳水

21、化合物中，根，引入碳水化合物中，根据放出的放射性二氧化碳量计数。据放出的放射性二氧化碳量计数。n等等四、微生物的鉴定四、微生物的鉴定n1 1 形态特征：菌落特征形态特征：菌落特征, ,微生物的形态。微生物的形态。n2 2 生理生化：包括对碳源、氮源的利用，能量来生理生化：包括对碳源、氮源的利用，能量来源，各种酶活性、发酵、产酸等源，各种酶活性、发酵、产酸等微量生化系统检测：微量生化系统检测：APIAPI、EnterotubeEnterotube系统。系统。n3 3微热量法：微热量法：microcalorimertrymicrocalorimertry各种微生物代谢各种微生物代谢产生的热效应不同。产生的热效应不同。n4 4化学特征：核酸特征（化学特征：核酸特征（G+C, PCRG+C, PCR， 16 sRNA16 sRNA ，基因探针，基因芯片，等）基因探针，基因芯片，等）n5 5 免疫学特征：血清反应、免疫电镜技术、酶联免疫学特征：血清反应、免疫电镜技术、酶联免疫技术等免疫技术等第三节第三节 动物实验模型动物实验模型实验动物在食品微生物学中具有重要的地实验动物在食品微生物学中具有重要的地位：位：n（1 1）食品病原的分离鉴定、毒力测定、）食品病原的分离鉴