中药毒理学研究

1、 中中 药药 毒毒 理理 学学 研研 究究概念概念 研究中药对生物体的损害及其毒性研究中药对生物体的损害及其毒性作用机理的一门学科。作用机理的一门学科。 研究目的：研究目的： （1） 发现中药的毒性反应发现中药的毒性反应（2） 确定毒性作用的剂量范围确定毒性作用的剂量范围（3） 确定中药毒副作用的靶组织或靶器官确定中药毒副作用的靶组织或靶器官 （4） 判断毒性的可逆性判断毒性的可逆性（5） 研究解毒药及药物中毒后的解救措施研究解毒药及药物中毒后的解救措施中药进行毒性试验的必要性：中药进行毒性试验的必要性： 纯天然观念纯天然观念 传统传统汤剂汤剂口服口服 注射剂注射剂 现在现在剂型改变剂型改变口

2、服液口服液 胶囊剂胶囊剂 中药进行毒性试验的必要性：中药进行毒性试验的必要性： 中药成分复杂中药成分复杂有效成分、有效成分、赋形剂、杂质赋形剂、杂质 澄清剂、增溶剂等澄清剂、增溶剂等 新技术、新工艺应用于中药研究新技术、新工艺应用于中药研究有效成有效成分、有效部位及其制剂分、有效部位及其制剂 某些成分含量明某些成分含量明显提高毒性作用增大显提高毒性作用增大 现在的中药不同于传统意义上的中药现在的中药不同于传统意义上的中药 研究内容研究内容 急性毒性试验急性毒性试验一般毒性试验一般毒性试验 长期毒性试验长期毒性试验 局部毒性试验局部毒性试验 致畸试验致畸试验特殊毒性试验特殊毒性试验 致癌试验致癌

3、试验 致突变试验致突变试验 药物依赖试验药物依赖试验 研究方法研究方法体内试验体内试验利用整体动物进行的试验。利用整体动物进行的试验。体外试验体外试验利用离体脏器、培养细胞利用离体脏器、培养细胞 进行的试验。进行的试验。中药毒理学中药毒理学药政管理学药政管理学中药药动学中药药动学分子生物学分子生物学细胞生物学细胞生物学统计学统计学药理学药理学生理学生理学病理学病理学遗传学遗传学动物学动物学组胚学组胚学临床医学临床医学中中 药药 安安 全全 性性 评评 价价急性毒性试验急性毒性试验 概念概念 急性毒性试验：中药一次或急性毒性试验：中药一次或24小时内多次给予小时内多次给予试验动物，观察在短时间内

4、对动物所引起的快试验动物，观察在短时间内对动物所引起的快速而剧烈的中毒效应的试验方法。速而剧烈的中毒效应的试验方法。 1.了解中药急性毒性的强弱了解中药急性毒性的强弱 2.为长期毒性试验及特殊毒性试验选择为长期毒性试验及特殊毒性试验选择 剂量提供依据剂量提供依据 3.获取毒性反应信息获取毒性反应信息意义意义一、试验管理一、试验管理执行执行药物非临床研究质量管理规范药物非临床研究质量管理规范（GLPGLP）。）。二、试验设计二、试验设计符合符合” ” 随机、对照、重复随机、对照、重复”的原则。的原则。三、试验药品三、试验药品 采用制备工艺稳定、符合临床试用质量标准规定的采用制备工艺稳定、符合临床

5、试用质量标准规定的中试样品。中试样品。实验设计实验设计 实验设计实验设计 四、四、实验动物的选择：实验动物的选择： 小鼠和大鼠。雌雄各半，小鼠为小鼠和大鼠。雌雄各半，小鼠为1822g。 温度：温度：233 湿度：湿度：30%70%，通风良好，笼具应清洁。，通风良好，笼具应清洁。 五、剂量和分组五、剂量和分组1.找出找出0%及及100%估计致死量。估计致死量。2. 以一定的剂距（以一定的剂距（10.60.85）上下各推）上下各推二组确定预试验的剂量分组。二组确定预试验的剂量分组。3.改良寇氏法改良寇氏法 )5 . 0P(XLogLDm150i六、给药方式和给药容量六、给药方式和给药容量 拟临床给

6、药途径拟临床给药途径两种两种 静脉注射静脉注射 大鼠大鼠 20ml/kg灌胃给药灌胃给药 小鼠小鼠 40ml/kg 七、观察时间与观察指标七、观察时间与观察指标1观察时间观察时间 持续观察持续观察30分钟分钟1-4小时各一次小时各一次2周周记录毒性反应的特点，出现时记录毒性反应的特点，出现时间、消失时间、死亡只数。间、消失时间、死亡只数。2观察指标观察指标 体重、外观、毛色，活动、呼吸体重、外观、毛色，活动、呼吸 死亡解剖死亡解剖3.最大耐受量试验最大耐受量试验指动物在最大体积和浓度的条件下，指动物在最大体积和浓度的条件下，不产生死亡的最大给药量的试验。不产生死亡的最大给药量的试验。 长期毒性

7、试验长期毒性试验 概念概念 长期毒性试验长期毒性试验: :试验动物连续多日接触较大试验动物连续多日接触较大剂量的药物所引起的中毒效应。剂量的药物所引起的中毒效应。发现药物蓄积、毒性作用。发现药物蓄积、毒性作用。推测靶器官或靶组织。推测靶器官或靶组织。预测预测安全范围。安全范围。为临床试验中的解毒或解救措施提供参考信为临床试验中的解毒或解救措施提供参考信息。息。 目的目的一、试验管理一、试验管理执行执行药物非临床研究质量管理规范药物非临床研究质量管理规范（GLPGLP）。）。二、试验设计二、试验设计符合符合” ” 随机、对照、重复随机、对照、重复”的原则。的原则。三、试验药品三、试验药品 采用制

8、备工艺稳定、符合临床试用质量标准规定的采用制备工艺稳定、符合临床试用质量标准规定的中试样品。中试样品。实验设计实验设计 实验设计实验设计 四、试验动物的选择四、试验动物的选择要求选择两种试验动物，啮齿类和非啮齿类各一种。要求选择两种试验动物，啮齿类和非啮齿类各一种。Beagle狗，大鼠狗，大鼠五、剂量和分组五、剂量和分组 1半数致死法（半数致死法（LD50法）法） 大鼠大鼠 1/10、1/50、1/100的的LD50 2. 最大耐受量法（最大耐受量法（MTD法）法） 1MTD、1/3MTD、1/10MTD3. 拟用临床剂量法（拟用临床剂量法（ACD） 3个月个月 大鼠大鼠 50-100倍、倍、

9、25-50倍、倍、10-20倍倍 狗狗 30-50倍、倍、15-25倍、倍、5-10倍倍 六、给药途径和周期六、给药途径和周期与临床拟用药途径相同。与临床拟用药途径相同。 长期毒性试验的给药周期长期毒性试验的给药周期临床疗程临床疗程 长期毒性给药周期长期毒性给药周期 啮齿类动物啮齿类动物 非啮齿类动物非啮齿类动物11周周 2 2周周 2 2周周22周周 1 1个月个月 1 1个月个月11个月个月 3 3个月个月 3 3个月个月33个月个月 6 6个月个月 6 6个月个月33个月个月 6 6个月个月 9 9个月个月 七、观察指标七、观察指标1 1、一般指标一般指标体征、外观、行为、食欲、恶心、呕

10、吐、大小便等。体征、外观、行为、食欲、恶心、呕吐、大小便等。2、血液学指标、血液学指标HGB/RBC/HCT/WBC/PLT计数和分类计数和分类凝血时间凝血时间 3、血生化指标、血生化指标AST、ALT、ALP、CREA、BUN、TP、ALB、GLU、T-BILTC、TG 4、尿分析、尿分析外观、比重、外观、比重、PH值、尿糖、尿胆原、尿胆红素、酮体值、尿糖、尿胆原、尿胆红素、酮体 5 5、器官重量：肝脏、心、肾脏、性腺、器官重量：肝脏、心、肾脏、性腺、脑、肾上腺、甲状腺、垂体和胸腺。脑、肾上腺、甲状腺、垂体和胸腺。 脏器系数脏器系数=脏器重量脏器重量/动物体重动物体重*100%6 6、病理检

11、查、病理检查7 7、恢复性观察恢复性观察8、数据处理及结果分析、数据处理及结果分析大鼠肝组织小炎症灶大鼠肝细胞脂肪变性 长期毒性试验长期毒性试验 肾小管变性、扩张肾间质炎症 局部毒性试验局部毒性试验 局部给药：经眼、耳、鼻、口腔、呼吸道、关局部给药：经眼、耳、鼻、口腔、呼吸道、关节腔、皮肤、直肠、阴道、静脉、动脉、肌肉、节腔、皮肤、直肠、阴道、静脉、动脉、肌肉、皮下、静脉旁和鞘内等途径给药。皮下、静脉旁和鞘内等途径给药。局部给药的毒性：指上述非口服给药制剂用药局部给药的毒性：指上述非口服给药制剂用药后对用药局部产生的毒性和对全身产生的毒性。后对用药局部产生的毒性和对全身产生的毒性。 一、一、皮

12、肤毒性试验皮肤毒性试验皮肤吸收定性试验皮肤吸收定性试验皮肤吸收定量试验皮肤吸收定量试验皮肤急性毒性试验皮肤急性毒性试验药物经皮肤吸收的两条途径药物经皮肤吸收的两条途径 1.1.通过表皮脂质屏障被吸收通过表皮脂质屏障被吸收角质层角质层 透明层透明层 颗粒层颗粒层 生生发层和基膜发层和基膜 真皮（渗透相）真皮（渗透相）毛毛细血管（吸收相）细血管（吸收相）2.2.通过汗腺、皮脂腺和毛囊等皮肤附属器通过汗腺、皮脂腺和毛囊等皮肤附属器被吸收。被吸收。 皮肤吸收试验（定性）皮肤吸收试验（定性）浸尾试验浸尾试验1 1组鼠尾部完好无损组鼠尾部完好无损 药液液浸泡药液液浸泡6小时小时2 2组鼠尾尖部剪掉皮肤破损

13、组鼠尾尖部剪掉皮肤破损皮肤吸收定量试验皮肤吸收定量试验 脱毛并罩上玻璃钟罩脱毛并罩上玻璃钟罩加入定量药物加入定量药物药药物与皮肤接触物与皮肤接触2626小时小时观察观察脱毛：化学法和机械法脱毛：化学法和机械法 血管血管肌肉肌肉 红肿、充血、渗出、变性或坏死红肿、充血、渗出、变性或坏死皮肤皮肤粘膜粘膜注意：不宜进行局部刺激性试验的情况注意：不宜进行局部刺激性试验的情况 pH 2pH 2 pH 11.2 pH 11.2 二、局部刺激性试验二、局部刺激性试验 血管刺激性试验血管刺激性试验 家兔家兔耳背血管注射药物耳背血管注射药物观察局部血管观察局部血管及周围组织反应（及周围组织反应（48-9648-

14、96小时）小时）肉眼观察、显微镜检查、组织病理学检查。肉眼观察、显微镜检查、组织病理学检查。 血管刺激性试验血管刺激性试验 正常耳缘静脉薄壁血管异常耳缘静脉血管内有大量红细胞淤积，周围组织有出血以及炎症细胞浸润。 肌肉刺激性试验肌肉刺激性试验 家兔家兔股四头肌内注入药物股四头肌内注入药物观察注射局观察注射局部肌肉反应情况部肌肉反应情况注射后注射后4848小时处死小时处死取取出股四头肌出股四头肌观察观察 肌肉刺激性试验肌肉刺激性试验 正常注射部位肌肉异常注射部位肌肉 皮肤刺激性试验皮肤刺激性试验 家兔、豚鼠家兔、豚鼠背部脱毛背部脱毛完整和破损皮肤完整和破损皮肤给药给药观察局部皮肤反应观察局部皮肤

15、反应 眼刺激性试验眼刺激性试验 家兔家兔一只眼睛滴入一只眼睛滴入0.1ml0.1ml或涂敷或涂敷0.1g0.1g受试受试物，另一只眼作为对照物，另一只眼作为对照观察观察注意：注意：1.1.应设赋形剂对照组应设赋形剂对照组 2.2.制剂渗透压与血液或眼泪相等制剂渗透压与血液或眼泪相等 直肠刺激性试验直肠刺激性试验滴鼻剂和吸入剂刺激试验滴鼻剂和吸入剂刺激试验 口腔用药和滴耳剂等刺激性试验口腔用药和滴耳剂等刺激性试验 过敏性试验过敏性试验 定义定义过敏性试验：指机体受同一抗原再刺激后产生过敏性试验：指机体受同一抗原再刺激后产生的一种表现为组织损伤或生理功能紊乱的特异的一种表现为组织损伤或生理功能紊乱

16、的特异性免疫反应。性免疫反应。 分类分类型（速发过敏型）型（速发过敏型）IgEIgE型（细胞毒型或溶细胞型）型（细胞毒型或溶细胞型）IgGIgG型（免疫复合物型）型（免疫复合物型）IgGIgG、IgMIgM型（迟发型）型（迟发型）TT淋巴细胞淋巴细胞 常见方法常见方法被动皮肤过敏试验（被动皮肤过敏试验（PCAPCA） 生理盐水生理盐水 1:2抗原抗原 人血白蛋白人血白蛋白 临床途径临床途径 豚鼠豚鼠取血清取血清 1:8 药物药物 1:32 皮内注射皮内注射 另一批豚鼠另一批豚鼠 耳缘静脉注射耳缘静脉注射 抗原抗原 伊文氏蓝伊文氏蓝 被动皮肤过敏试验（被动皮肤过敏试验（PCA）全身主动过敏试验（

17、全身主动过敏试验（ASAASA）对致敏成立的动物体内，静脉注射抗原，观察抗对致敏成立的动物体内，静脉注射抗原，观察抗原与原与IgEIgE抗体结合后导致肥大细胞、嗜碱性细胞抗体结合后导致肥大细胞、嗜碱性细胞脱颗粒、释放活性介质而致的全身性过敏反应。脱颗粒、释放活性介质而致的全身性过敏反应。 常见方法常见方法全身主动过敏试验（全身主动过敏试验（ASAASA） 生理盐水生理盐水 抗原抗原 人血白蛋白人血白蛋白 临床途径临床途径 豚鼠豚鼠 静脉注射静脉注射 抗原抗原 药物药物 溶血性试验溶血性试验 定义定义溶血性试验溶血性试验: :考察中药注射剂是否具有溶血和考察中药注射剂是否具有溶血和红细胞凝聚等反

18、应。红细胞凝聚等反应。 分类分类免疫性溶血免疫性溶血免疫反应免疫反应抗体抗体溶血溶血非免疫性溶血非免疫性溶血药物诱导药物诱导溶血溶血 必要性必要性中药中药1 1、含有溶血成分、含有溶血成分2 2、含有杂质成分、含有杂质成分3 3、免疫性溶血、免疫性溶血 常见方法常见方法一、常规体外试管法（肉眼观察法）一、常规体外试管法（肉眼观察法）红细胞悬液红细胞悬液加入受试物加入受试物温育温育观察观察溶血或凝集反应情况。溶血或凝集反应情况。透明红色透明红色溶血溶血棕红色或红棕色絮状沉淀棕红色或红棕色絮状沉淀红细胞聚集红细胞聚集 常见方法常见方法 Ml 试试 管管 编编 号号 1 2 3 4 5 6 72%红

19、细胞混悬液红细胞混悬液 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5生理盐水生理盐水 2.0 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 0蒸馏水蒸馏水 0 0 0 0 0 0 2.5受试物受试物 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0 常见方法常见方法二、体外红细胞计数法二、体外红细胞计数法采用显微镜直接计数红细胞的量采用显微镜直接计数红细胞的量, ,计算溶血计算溶血百分率。百分率。溶血度溶血度(%)=(%)=(空白对照管红细胞数空白对照管红细胞数- -试药管试药管红细胞数红细胞数)/)/空白对照管红细胞数空白对照管红细胞数 100%100%。 常见方法常见方法三、体内溶血试验

20、法（红细胞计数法）三、体内溶血试验法（红细胞计数法）体内试验体内试验显微镜直接计数显微镜直接计数 思考题思考题五月四日作业：五月四日作业：1.有一中药复方临床治疗中风症多年，请你给该有一中药复方临床治疗中风症多年，请你给该药设计一个较完善的药效实验，为扩大临床应药设计一个较完善的药效实验，为扩大临床应用和开发新药提供实验依据。用和开发新药提供实验依据。 特殊毒性试验特殊毒性试验 致突变试验致突变试验致畸试验致畸试验致癌试验致癌试验依赖性依赖性试验试验 致突变试验致突变试验 基本概念基本概念突变：指生物体遗传物质发生急剧的遗传学变突变：指生物体遗传物质发生急剧的遗传学变化，导致可遗传的表型变异（

21、不可逆）。化，导致可遗传的表型变异（不可逆）。 分类分类基因突变：称为点突变，是组成一个染色体的基因突变：称为点突变，是组成一个染色体的一个或几个基因发生变化。一个或几个基因发生变化。染色体畸变：某一个或几个染色体的结构或染染色体畸变：某一个或几个染色体的结构或染色体的数目发生变化。色体的数目发生变化。 直接致突变物直接致突变物原型就可引起生物体的突变。原型就可引起生物体的突变。间间接致突变接致突变物物代谢活化才具有致突变作用。代谢活化才具有致突变作用。 鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验利用微生物来观察受试物可能引起基因突变的方法。利用微生物来观察受试物可能引起基因突变的方

22、法。 受试物受试物 + + 微生物微生物 发生突变的微生物发生突变的微生物可能引起突变可能引起突变 野生型野生型 突变型突变型 形态形态 颜色颜色 改变合成某种氨基酸功能不能生长改变合成某种氨基酸功能不能生长基因突变试验基因突变试验 原理：原理： 正向突变正向突变鼠伤寒沙门氏菌组氨酸鼠伤寒沙门氏菌组氨酸 + + 组氨酸缺陷型鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型鼠伤寒沙门氏菌 （野生型）（野生型） 回复突变回复突变 （突变型）（突变型） 回复突变菌落数增加，超过自发对照的回复突变菌落数增加，超过自发对照的2 2倍或倍或以上可判为阳性。以上可判为阳性。 染色体畸变实验染色体畸变实验哺乳动物培养细胞染色体畸变

23、试验哺乳动物培养细胞染色体畸变试验用细胞遗传学方法检测中药是否影响用细胞遗传学方法检测中药是否影响DNADNA结构结构或改变信息来判定药物的遗传性的试验方法。或改变信息来判定药物的遗传性的试验方法。 仓鼠肺细胞（仓鼠肺细胞（HCL）细胞周期短（细胞周期短（12-14h）染色体数目少（染色体数目少（2n22） 微微 核核 试试 验验 微微 核核 试试 验验致突变试验中唯一的整体试验。致突变试验中唯一的整体试验。当药物损伤染色体，其着丝点被破坏即会断当药物损伤染色体，其着丝点被破坏即会断裂，碎片形成近有普通细胞核的裂，碎片形成近有普通细胞核的1/20-1/51/20-1/5大大小，故称微核。小，故

24、称微核。采用骨髓直接涂片法采用骨髓直接涂片法观察小鼠骨髓细胞中的观察小鼠骨髓细胞中的微核率。微核率。 致畸试验致畸试验 基本概念基本概念致畸性：药物接触胚胎发生期后引起永久性致畸性：药物接触胚胎发生期后引起永久性结构或功能异常的性质。结构或功能异常的性质。致畸指数：一个药物对母体的半数致死量与致畸指数：一个药物对母体的半数致死量与最小致畸剂量变化。最小致畸剂量变化。 胚胎毒性：药物在一定剂量仅对胚胎（或胎儿）胚胎毒性：药物在一定剂量仅对胚胎（或胎儿）有毒性作用而对母体没有毒作用，称为胚胎毒有毒性作用而对母体没有毒作用，称为胚胎毒性。性。胚胎死亡、胚胎生长迟缓、畸形、功能不全。胚胎死亡、胚胎生长

25、迟缓、畸形、功能不全。母体毒性：药物引起怀孕动物的毒效应，如体母体毒性：药物引起怀孕动物的毒效应，如体重不增或减轻，最严重的是死亡。重不增或减轻，最严重的是死亡。 致畸机理致畸机理 一、基因突变一、基因突变DNADNA链上核苷酸的序列发生变化。链上核苷酸的序列发生变化。二、染色体畸变二、染色体畸变染色体的缺失、重复、重排和不分离。染色体的缺失、重复、重排和不分离。三、核酸和蛋白质合成障碍三、核酸和蛋白质合成障碍阻断阻断DNADNA合成合成干扰干扰DNADNA的复制、转录和翻译的复制、转录和翻译 致畸机理致畸机理 四、酶活性抑制四、酶活性抑制发育障碍发育障碍五、细胞死亡和抑制细胞增殖五、细胞死亡

26、和抑制细胞增殖六、渗透压不平衡六、渗透压不平衡七、生物合成基质和辅酶的缺乏七、生物合成基质和辅酶的缺乏 致畸机理致畸机理 八、能量不足八、能量不足九、干扰细胞的有丝分裂九、干扰细胞的有丝分裂 影响药物致畸性的因素影响药物致畸性的因素 一、遗传因素一、遗传因素基因突变基因突变 5% 5% 染色体畸变染色体畸变 10%10% 环境化学物环境化学物 5% 5% 原因不明原因不明65%70%65%70% 二、药物的理化性质二、药物的理化性质分子量小分子量小 极性小极性小脂溶性高脂溶性高 血浆蛋白结合率低血浆蛋白结合率低 影响药物致畸性的因素影响药物致畸性的因素三、给药时间三、给药时间胚胎对药物致畸最敏

27、感的是器官形成期。胚胎对药物致畸最敏感的是器官形成期。 3-123-12周周 影响药物致畸性的因素影响药物致畸性的因素四、给药剂量四、给药剂量无作用带致畸带胚胎致死带母体致死带药物致畸剂量增加胚胎毒性范围 影响药物致畸性的因素影响药物致畸性的因素五、母体状况五、母体状况 年龄过大年龄过大 维生素缺乏维生素缺乏 感染如风疹感染如风疹 试验方法试验方法 两种雌性动物两种雌性动物处于动情前期与同龄雄鼠同笼处于动情前期与同龄雄鼠同笼过夜过夜检查受孕检查受孕于分娩前于分娩前1-21-2日处死受孕日处死受孕动物动物检查子宫内胚胎情况检查子宫内胚胎情况 结果评定结果评定畸胎率（畸胎率（% %）= =有畸胎动

28、物数有畸胎动物数/ /妊娠动物数妊娠动物数 100%100%外观畸形率（外观畸形率（% %）= =外观畸形数外观畸形数/ /检查胎仔数检查胎仔数 100%100%骨骼畸形率（骨骼畸形率（% %）= =骨骼畸形数骨骼畸形数/ /检查骨骼标本数检查骨骼标本数 100%100%内脏畸形率（内脏畸形率（% %）= =内脏畸形数内脏畸形数/ /检查胎仔数检查胎仔数 100%100% 致致 癌癌 试试 验验 已明确有致癌作用的药物：已明确有致癌作用的药物：环磷酰胺、氯霉素、非那西丁环磷酰胺、氯霉素、非那西丁米尔法兰、已烯雌酚、萘氮介米尔法兰、已烯雌酚、萘氮介苯妥英那、奈氮芥苯妥英那、奈氮芥 中药有致癌作用

29、的药物：中药有致癌作用的药物：苏铁苏铁苏铁甙苏铁甙肝、肾的癌变。肝、肾的癌变。槟榔槟榔槟榔碱槟榔碱口腔、食道、胃肿瘤口腔、食道、胃肿瘤细辛、桂皮、八角、茴香细辛、桂皮、八角、茴香黄樟素黄樟素肝癌肝癌千里光、巴豆、甘遂、苏木、三棱千里光、巴豆、甘遂、苏木、三棱致癌活性致癌活性 致癌机理致癌机理 一、体细胞突变学说一、体细胞突变学说正常细胞正常细胞 为癌细胞为癌细胞 肿瘤肿瘤二、病毒学说二、病毒学说1.DNA1.DNA肿瘤病毒的感染肿瘤病毒的感染2.2.致癌性逆转录病毒的感染致癌性逆转录病毒的感染3.3.内源性致癌前病毒的激活内源性致癌前病毒的激活 致癌机理致癌机理 三、癌基因学说三、癌基因学说四

30、、癌变的阶段学说四、癌变的阶段学说1.1.引发阶段引发阶段2.2.促长阶段促长阶段3.3.进展阶段进展阶段 肿瘤转变肿瘤转变 肿瘤发展肿瘤发展 化学致癌物化学致癌物 肿瘤细胞肿瘤细胞 代谢活化代谢活化 增殖促长增殖促长 终致癌物终致癌物 分化的肿瘤分化的肿瘤 DNA 进展进展 DNA改变改变 不分化的癌不分化的癌 表达表达 实验方法实验方法大鼠给药为大鼠给药为2424个月以上个月以上 一般观察一般观察小鼠地鼠为小鼠地鼠为1818个月以上个月以上 病理检查病理检查结果评定结果评定 肿瘤发生率（肿瘤发生率（% %）= = 患肿瘤动物总数患肿瘤动物总数 / / 有效动物总数有效动物总数 100%10

31、0% 药物依赖性试验药物依赖性试验 特征及临床表现特征及临床表现 精神状态精神状态精神依赖性精神依赖性药物药物 + 机体机体 身体状态身体状态身体依赖性身体依赖性 强迫性觅药行为强迫性觅药行为耐受性耐受性依赖性依赖性 实验方法实验方法一、身体依赖性试验一、身体依赖性试验自然戒断试验自然戒断试验 镇痛药镇痛药替代试验替代试验催促试验催促试验 镇静催眠药镇静催眠药诱导试验诱导试验二、精神依赖性试验二、精神依赖性试验自身给药法自身给药法 身体依赖性实验方法身体依赖性实验方法自然戒断试验：自然戒断试验：连续给予中药连续给予中药突然停药突然停药戒断症状戒断症状 对照药对照药大鼠体重减轻试验大鼠体重减轻试

32、验 植物神经：腹泻、流涎、流泪、恶心、呕吐、植物神经：腹泻、流涎、流泪、恶心、呕吐、瞳孔大小。瞳孔大小。外观和行为：体重、饮食、体温、睡眠、呼吸、外观和行为：体重、饮食、体温、睡眠、呼吸、应激性、神情过敏、自发运动活动、攻击性、应激性、神情过敏、自发运动活动、攻击性、警觉程度、神经反射、竖尾、震颤、惊厥。警觉程度、神经反射、竖尾、震颤、惊厥。 身体依赖性实验方法身体依赖性实验方法替代试验替代试验: :给代表药物给代表药物（吗啡）（吗啡）身体依赖性身体依赖性停止给予停止给予换给中药换给中药戒断症状戒断症状大鼠替代试验大鼠替代试验 身体依赖性实验方法身体依赖性实验方法催促试验催促试验: :给予中药

33、给予中药加受体对抗剂加受体对抗剂戒断症状戒断症状适用于有竞争性受体对抗剂的阿片类药物。适用于有竞争性受体对抗剂的阿片类药物。小鼠跳跃试验小鼠跳跃试验 身体依赖性实验方法身体依赖性实验方法诱导试验诱导试验: : 正常组正常组不引起不引起惊厥惊厥诱发惊厥诱发惊厥（阈下刺激强度）（阈下刺激强度） 给药组给药组诱发惊厥诱发惊厥（对药物产生依赖性）（对药物产生依赖性） 精神依赖性实验方法精神依赖性实验方法自身给药法自身给药法 操作式条件行为实验操作式条件行为实验1.1.大鼠颈外静脉插管，另一端连接于自由转轴装置大鼠颈外静脉插管，另一端连接于自由转轴装置上，与恒速药液输入系统相连。上，与恒速药液输入系统相

34、连。2.2.自身给药训练自身给药训练动物建立自身给药（踏板）行动物建立自身给药（踏板）行为。为。 精神依赖性实验方法精神依赖性实验方法大鼠药物辨别试验大鼠药物辨别试验辨别试验箱辨别试验箱 辨别吗啡和生理盐水辨别吗啡和生理盐水训练程序训练程序 正确压杆正确压杆吗啡和中药替代试验吗啡和中药替代试验观察压杆正确观察压杆正确率率 1.1.特殊性试验包括哪些研究内容特殊性试验包括哪些研究内容? ?2.2.简述微核试验的原则及实验要点。简述微核试验的原则及实验要点。3.3.身体依赖性试验有哪几种方法？身体依赖性试验有哪几种方法？2009.42009.4思考题思考题: :中药对高脂血症的药效研究方法中药对高

35、脂血症的药效研究方法概念概念高脂血症：指血浆中高脂血症：指血浆中TC和和或或TG水平升高水平升高。 脂肪脂肪 甘油三酯甘油三酯 (TG )脂质脂质 胆固醇胆固醇(TC ) 类脂类脂 磷脂磷脂 糖脂糖脂 脂蛋白（脂蛋白（LP） ： TC、TG和磷脂、蛋白质组成的复合物和磷脂、蛋白质组成的复合物称为脂蛋白。称为脂蛋白。分为：分为： 乳糜微粒乳糜微粒CM 极低密度脂蛋白极低密度脂蛋白VLDL 中间密度脂蛋白中间密度脂蛋白IDL 低密度脂蛋白低密度脂蛋白LDL 高密度脂蛋白高密度脂蛋白HDL大鼠：大鼠：模型制造方法简单，成本适中，采血量大。模型制造方法简单，成本适中，采血量大。小鼠：小鼠：造模成本低，

36、血量少。造模成本低，血量少。鹌鹑、家鸽：鹌鹑、家鸽：制作容易。制作容易。兔：兔：离人类渊源较近，是更理想的动物模型。离人类渊源较近，是更理想的动物模型。一、实验动物的选择一、实验动物的选择二、动物模型二、动物模型（一）降脂药对正常动物初筛（一）降脂药对正常动物初筛 正常大鼠正常大鼠给药四天给药四天第五天取血测第五天取血测测定总胆固醇。测定总胆固醇。 下降率下降率%=（给药前浓度给药后浓度）（给药前浓度给药后浓度）/给药前给药前浓度浓度100% （二）高脂饲料喂养法（二）高脂饲料喂养法 SD大鼠大鼠给普通饲料给普通饲料510天天血清血清测定血脂正常值测定血脂正常值分组分组高脂饲料并给高脂饲料并给

37、予不同的药物处理予不同的药物处理每周测血脂每周测血脂1次（次（24周）周） 高脂配方主要成分：高脂配方主要成分： 猪油、蛋黄粉、胆固醇、甲基硫氧嘧啶、胆酸钠猪油、蛋黄粉、胆固醇、甲基硫氧嘧啶、胆酸钠 基础饲料基础饲料1.脂类含量脂类含量 造模天数造模天数2.SD大鼠大鼠 Wistar大鼠大鼠3.稳定性差。稳定性差。（三）蛋黄注射法（急性模型）（三）蛋黄注射法（急性模型） 鸡蛋黄鸡蛋黄 + 生理盐水生理盐水75%蛋黄乳液蛋黄乳液雄性小鼠腹腔注射雄性小鼠腹腔注射0.5ml/只只注射后注射后20小小时时测定血清测定血清 （四）注入表面活化剂法（机制研究）（四）注入表面活化剂法（机制研究）1.原理原理

38、 表面活化剂表面活化剂抑制抑制卵磷脂胆固醇酰基转卵磷脂胆固醇酰基转移酶移酶 脂质交换脂质交换 脂质蛋白复合物脂质蛋白复合物 SD SD大鼠大鼠静注静注200mg/kg200mg/kg的的Triton WR Triton WR 133924h133924h后后测定测定TCTC第二个第二个24h24h后后再次测定再次测定TCTC 增加增加2 23 3倍（倍（I I期）期）胆固醇的生物合成胆固醇的生物合成 降到正常水平（降到正常水平（IIII期）期）胆固醇排泄和代谢胆固醇排泄和代谢 （五）果糖引起的大鼠高甘油三酯血症（急性）（五）果糖引起的大鼠高甘油三酯血症（急性） SDSD大鼠大鼠蛋白质及低碳水化

39、合物的饲料蛋白质及低碳水化合物的饲料11周后给予周后给予3 3天药物天药物末次给药后给予末次给药后给予2020果糖果糖20h20h后测定总甘油三酯以及总胆固后测定总甘油三酯以及总胆固醇水平。醇水平。 （六）大鼠静脉脂质耐受试验（六）大鼠静脉脂质耐受试验 SDSD大鼠大鼠给中药连续给中药连续5 5天天第第5 5天末次给天末次给药后药后2h2h静脉注射静脉注射1010脂类乳剂脂类乳剂2ml/kg2ml/kg并于注射前以及注射后并于注射前以及注射后1010、2020、3030和和45min45min，经眼眶穿刺取血，测定甘油三酯水平。，经眼眶穿刺取血，测定甘油三酯水平。三、客观指标三、客观指标 （一

40、）脂质代谢水平（一）脂质代谢水平 血清脂质（血清脂质（TC、TG） 脂蛋白（脂蛋白（HDL、LDL、VDL） 载脂蛋白（载脂蛋白（ApoA、ApoBApoB100100）（二）形态学检查（二）形态学检查病例切片：观察冠状动脉斑块病变程度病例切片：观察冠状动脉斑块病变程度0 0级：冠状动脉内膜无脂质浸润；级：冠状动脉内膜无脂质浸润；0.50.5级：冠状动脉内膜轻度脂质浸润；级：冠状动脉内膜轻度脂质浸润；1 1级：内膜斑块占管腔面积的级：内膜斑块占管腔面积的1/41/4； 2 2级：内膜斑块占管腔面积的级：内膜斑块占管腔面积的1/21/2；内膜斑块占管腔面积大于内膜斑块占管腔面积大于1/21/2；

41、4 4级：管腔几乎全被斑块堵塞。级：管腔几乎全被斑块堵塞。光镜和电镜：观察内膜泡沫细胞光镜和电镜：观察内膜泡沫细胞数及中膜完整数及中膜完整平滑肌层数。平滑肌层数。 （三）（三） 其它分析的指标其它分析的指标计算肝系数：动物每计算肝系数：动物每100g100g体重含肝重克数。体重含肝重克数。观察肝组织学改变：肝脏的脂肪变性和泡沫细胞数镜检观察肝组织学改变：肝脏的脂肪变性和泡沫细胞数镜检分级。分级。测定脂质过氧化物（测定脂质过氧化物（LPOLPO）和氧化低密度脂蛋白（）和氧化低密度脂蛋白（ox-ox-LDLLDL）。）。血液流变学指标（浓、黏、凝、聚状态）。血液流变学指标（浓、黏、凝、聚状态）。

42、抗糖尿病中药药效研究方法抗糖尿病中药药效研究方法 糖糖 尿尿 病病 1型型 10% 胰岛素依赖型胰岛素依赖型 糖尿病糖尿病 2型型 90% 非非胰岛素依赖型胰岛素依赖型 1型糖尿病的动物模型型糖尿病的动物模型1.手术手术切除胰腺切除胰腺犬犬 高糖饮食高糖饮食胰岛胰岛B细胞细胞结扎胰管结扎胰管 1型糖尿病型糖尿病1型糖尿病的动物模型型糖尿病的动物模型2.化学物质破坏胰岛化学物质破坏胰岛细胞细胞 四氧嘧啶四氧嘧啶超氧自由基超氧自由基B细胞内细胞内DNA损伤损伤mRNA 功能受损功能受损合成胰岛素合成胰岛素 腹腔注射腹腔注射方法：大鼠给予方法：大鼠给予1%一一5%的四氧嘧啶一次的四氧嘧啶一次 （20

43、0 mg/kg） 尾静脉尾静脉24 h后高血糖后高血糖 （90 mg/kg） 1型糖尿病的动物模型型糖尿病的动物模型链尿酶素链尿酶素(SZI)一次大剂量一次大剂量速发型速发型糖尿病糖尿病胰岛胰岛B细胞直接受损细胞直接受损多次小剂量多次小剂量迟发型迟发型糖尿病糖尿病T淋巴细胞介导淋巴细胞介导(可能可能) 正常动物正常动物注射链尿酶素注射链尿酶素 72小时小时 测定血糖测定血糖 3.自发性糖尿病动物模型自发性糖尿病动物模型中国地鼠中国地鼠先天胰岛先天胰岛细胞受损细胞受损胰岛素胰岛素缺乏缺乏血糖升高血糖升高类似类似1型糖尿病型糖尿病1 1型糖尿病的动物模型型糖尿病的动物模型1型糖尿病的动物模型型糖尿病的动物模型4.病毒诱导病毒诱导 鼠脑炎病毒鼠脑炎病毒 成年小鼠胰岛成年小鼠胰岛B细胞脱颗粒细胞脱颗粒 柯萨奇病毒柯萨奇病毒 胰岛胰岛B细胞破坏细胞破坏1型糖尿病模型型糖尿病模型 2型糖尿病的动物模型型糖尿病的动物模型1. 特殊膳食诱导特殊膳食诱导过量过量高蛋白高蛋白 饮食动物饮食动物 细胞萎缩细胞萎缩 高脂高脂 2型糖尿病型糖尿病高糖高糖 给动物喂高热量饲料给动物喂高热量饲料810周周动物肥胖、动物肥胖、高血脂、高胰岛素血症及胰岛素抵抗。高血脂、高胰岛素血症及胰岛素抵抗。 2.2.小剂量注射小剂量注射SZI加特殊膳食诱导加特殊膳食诱导 2