ELISA试剂的选用和质检

1、ELISA试剂的选用和质检 卫生部临床检验中心王露楠影响试剂盒质量的因素试剂盒的选用试剂盒的质检方法目前试剂盒存在的问题影响试剂盒质量的因素1原材料(1)固相材料 商品ELISA试剂盒中基本上都使用聚苯烯塑料微孔板，其对ELISA试剂盒的影响在于孔间的显色差异。(2)抗原 -自然抗原、合成抗原和基因重组抗原。纯 度：纯度不高可致试剂盒的特异性不强。立体结构：合成抗原一般都是多肽抗原，缺乏完整抗原所具有的立体结构决定簇，用于相应的抗HCV和抗HIV抗体的检测有可能导致结合上述决定簇的抗体漏检。影响试剂盒质量的因素(3)抗体 多克隆抗体(多抗)：制备简单，含针对抗原的多种决定簇，但抗体的亲和力和特

2、异性相对要低于单抗，且每次制备的抗体在其亲和力和特异性上均有区别。单克隆抗体(单抗)：可无限大量的得到针对单一决定簇的抗体，缺点是结合的单一性。当建立双抗夹心ELISA测定方法时，如包被和指示抗体使用同一单抗，则由于结合位点的缺乏，很容易造成假阴性结果，尤其是在使用一步法时“钩状”效应(Hookeffect)的出现。因此，在使用单抗建立双抗夹心ELISA方法时，包被和指示抗体常使用针对抗原的不同决定簇的单抗，包被抗体可为混合单抗，从而使得固相抗体在免疫测定中能更为完全地结合待测物中的特异抗原。影响试剂盒质量的因素(4)酶结合物 ELISA试剂盒的核心部分，通常ELISA试剂盒的有效使用期限即是

3、根据酶结合物的稳定性而定的。辣根过氧化物酶(HRP)：易于提取，价格相对低廉；性质稳定，耐热及有机溶剂的作用，与抗原或抗体偶联后，活性很少受损失。碱性磷酸酶(ALP)：碱性磷酸酶用于ELISA必须注意的是含磷酸盐的缓冲液对其酶活性的抑制作用F半乳糖甘酶影响试剂盒质量的因素(5)色原底物：HRP最常用的色原底物有邻苯二胺(OPD)和四甲基联苯胺(TMB) 。邻苯二胺(OPD)：OPD被认为是HRP最为敏感的色原底物之一，当pH值降为1.0时，最大吸收波长为492nm，显色加深，因而常用强酸如硫酸或盐酸终止反应。OPD的缺点是其对机体具有致突变作用。四甲基联苯胺(TMB)：氧化产物联苯醌在波长45

4、0nm处有最大消光系数。试剂盒中常为已配好的A、B两种液态试剂，即一定浓度双氧水溶液和TMB。它们在溶液中相对不稳定，因此在使用ELISA试剂盒时，如底物A或和B出现颜色，或各取一滴混合后显色，说明该试剂盒的底物溶液已变质或已受污染，必须废弃。 影响试剂盒质量的因素2试剂盒的方法学设计双抗原夹心法测抗体(抗HIV、Tp) 洗板待测抗体底物温育显色酶标抗原EE洗板固相抗原EEEEEEE影响试剂盒质量的因素间接法测抗体（抗HCV、Tp) 洗板待测抗体底物温育显色E酶标抗体EE洗板EEEEEE固相抗原影响试剂盒质量的因素双抗体夹心法测抗原-两步法固相抗体温育待测抗原底物温育显色E酶标抗体EEEEEE

5、EE影响试剂盒质量的因素双抗体夹心法测抗原-一步法待测抗原底物温育显色固相抗体E酶标抗体EEEEE洗板EEEEEEE影响试剂盒质量的因素3试剂盒的运输和贮存ELISA试剂盒的效期一般为6个月，这是指在贮存温度为28C的情况下，但一个试剂盒从出厂至用户手中，均要经历运输(如送检、检定、发货等)及运输中的贮存，某一环节的不当，均会影响试剂盒的临床使用质量。试剂盒的选用1根据可能影响试剂盒质量的因素，从以下几个方面来判断该试剂盒是否符合我们的要求 效期 固相材料的来源 包被抗体或抗原的性质(单抗、多抗或合成多肽或重组多肽) 显色底物(是TMB还是OPD) 测定模式(一步法或二步法)试剂盒的选用2同行

6、对有关试剂盒的使用效果 个别的使用效果个别的使用效果 在实际工作中，其它实验室对某种试剂盒的实际使用效果，往往具有很强的说服力。 综合的使用评价综合的使用评价对一种试剂盒的综合使用评价，是指多个实验室对这种试盒实际应用效果的综合分析。ELISA试剂盒的质检 1.包装、储存状态 内外包装、效期、试剂瓶是否漏液，真空包装是否破损，试剂是否齐全等等 2.采用血清盘(panel)质检 血清盘由一定数量的阴、阳性样本组成，可用来判断试剂盒的灵敏度、特异性和符合率，如HBsAg、抗HCV和抗HIV等血清盘。ELISA试剂盒的质检 使用待检试剂盒测定血清盘中的各份样本，以血清盘的结果为相对标准，依照表 2

7、的 公式，计算被检试剂盒的灵敏度、特异性和符合率。 表 2 试剂盒评价四格表 血清盘结果 + 合 计 待检试剂盒 + a b a+b 结 果 c d c+d 合 计 a+c b+d a+b+c+d 表中 a 为真阳性，b 为假阳性，c 为假阴性，d 为真阴性。于是，被评价试剂盒的各项 指标以下列公式计算： 灵敏度()caa100 特异性()= dbd100 符合率()= dcbada100 一般认为，符合率大于 90为有高度相关性试剂。 ELISA试剂盒的质检-HBsAg样本编号 结果 大约含量 (ng/ml) 样本编号 结果 大约含量 (ng/ml) 1 + 8 16 + 约 0.5 2 +

8、 500 17 3 + 0.2 18 + 约 0.7 4 19 5 20 + 100,000 6 21 + 200,000 7 + 15 22 + 20-30 8 + 约 0.5 23 + 2 9 24 + 2,000 10 + 12 25 + 50 11 26 + 10,000 12 27 + 200 13 28 + 10 14 29 15 30 + 12 ELISA试剂盒的质检-抗HCV 确认结果 确认结果 编号 结果 NS4 NS3 C NS5 编号 结果 NS4 NS3 C NS5 17 + + 30 + + + + + 18 + + 31 + +/- + 19 + + + + + 3

9、2 + + + + + 20 + + + + + 33 + + + 21 + +/- + 34 + + + + 22 + + + + + 35 + +/- + 23 + + + + + 36 + + + +/- 24 + + + + + 37 + + 25 + + + + + 38 + + + + + 26 + + + + + 39 + + + + + 27 + + 40 + + + + + 28 + + + + + 29 + + + + + ELISA试剂盒的质检-TP样 本 编 号 初 筛 (R PR /T R U S T ) 确 认 (E IA /T PP A ) 样 本 编 号 初 筛

10、 (R PR /T R U S T ) 确 认 (E IA /T PP A ) 17 + + 29 +* + 18 + 30 +* + 19 + 31 + + 20 + + 32 + + 21 + 33 +* + 22 + + 34 + + 23 + 35 + + 24 +* 36 +* +* 25 + 37 + 26 + + 38 + 27 +* + 39 + + 28 + 40 +* + ELISA试剂盒的质检3.采用弱阳性定值质控血清进行质检对不同厂家或同一厂家不同批号试剂盒采用同一弱阳性定值质控血清检测，可比较出不同厂家或不同批号试剂盒的检测灵敏度(测定下限)的差异，对判断试剂盒的质量

11、及其稳定性具有重要的参考价值。检验结果的正确与否，是试剂盒质量、人员素质、仪器设备状态和室内质控措施等的综合反应，任何一个环节出现问题，都会导致检测的失败。 目前试剂盒存在的问题-抗HCV表15-1. 三代抗HCV ELISA测定试剂的比较 试试 剂剂 包被抗原 窗口期 敏感性 特异性 第一代 C1003 34个月 8090 假阳性较高 第二代 C223、C33C和C1003 812周 90以上 特异 第三代 C223、C33C和NS5 610周 95 特异性更好 目前试剂盒存在的问题-抗HCV试剂的不足之处 1.主要是在低危人群中仍发现大量的不确定和假阳性结果，再则仍有较长的“窗口期”。 2

12、.核心区抗原的减少程度把握不好的话，有可能会导致漏检的发生。 3.由于这些试剂所使用HCV抗原只是病毒的部份重组多蛋白或合成肽抗原，加之，固相对这些蛋白或多肽的吸附能力的局限性，使得固相上能捕获抗体的抗原决定基的数量有限，从而影响测定的敏感性。 目前试剂盒存在的问题-抗HCV两家试剂检测结果不一致 1.不同试剂厂家的ELISA试剂盒所用包被抗原的差异：目前抗HCV检测ELISA试剂盒均采用HCV的基因工程或合成多肽抗原（核心区、NS3、NS4和NS5等）包被固相，以间接法进行测定，由于上述HCV抗原的组合、来源及用量等方面的差异。 2.所用包被抗原成份相互之间抗原决定簇的覆盖，这种覆盖将严重影

13、响ELISA测定的敏感性。 表 1. 22 份 HCV RNA 阳性血清抗-HCV ELISA 检测及 RIBA 确认结果 ORTHO RIBA 结果 样本 编号 NS3 NS4 NS5 C A (S/CO) B (S/CO) C (S/CO) D (S/CO) E (S/CO) F (S/CO) G (S/CO) 1 + +3.3 +1.4 +1.2 +4.6 2 + +1.1 0.8 +2.0 +1.9 3 + +1.6 +1.9 +1.9 +2.8 +2.4 +1.3 +1.3 4 + +2.8 5 + +2.1 +2.5 +3.5 +2.9 6 + +5.0 +2.4 +3.6 +2.

14、0 +2.3 7 + +2.5 0.8 0.7 +1.3 +1.1 8 + +2.4 +1.0 0.8 +2.3 9 + +2.2 +3.3 +2.0 +2.1 +4.9 +3.2 +4.7 10 + +7.1 +1.3 +3.6 +7.6 +2.0 +2.0 +1.1 11 + +2.7 +1.9 0.7 +1.5 +2.9 12 + + +6.8 +6.9 +5.0 +6.8 +3.0 +1.3 +2.1 13 + + +3.2 +2.3 +4.7 +3.6 +2.2 +2.0 +1.0 14 + + + +4.3 +10.5 +1.4 +3.2 +2.0 +1.9 +1.6 15 + +

15、 + +1.8 +2.5 0.8 +1.8 +2.7 +1.1 1.3 16 + + +3.0 +1.1 17 + + 0.8 0.9 18 * * +2.6 +1.0 +1.3 +5.4 +3.0 +1.2 +1.2 19 +2.1 +1.37 +4.7 +2.3 +1.6 +1.6 20 +2.0 +1.2 +1.0 +4.6 +2.4 +1.7 +1.6 21 * * +3.0 +1.2 +1.2 +3.0 +2.4 +1.7 +3.0 22 * * +2.6 +1.0 +1.3 +5.4 +3.0 +1.2 +1.2 表 2.53 份样本 RIBA 确认、抗-HCV ELISA 检测及

16、 HCV RNA 检测结果 ORTHO RIBA 结果 样本数 国产 ELISA 进口 ELISA HCV RNA NS3 NS4 NS5 C 试剂检出率 试剂检出数 阳性结果数 + 2 70.0% 33.3% 1/2 + 10 50.0% 53.3% 4/10 + 2 30.0% 33.3% 0/2 + 3 33.3% 33.3% 0/3 + 3 46.7% 33.3% 0/3 + 1 60.0% 100.0% 1/1 + 3 93.3% 77.8% 2/3 + 4 85.0% 75% 2/4 + + 1 100.0% 100.0% 1/1 + + 3 73.3 88.9% 2/3 + +

17、2 20.0% 16.7% 0/2 + + + 3 100.0% 88.9% 2/3 + + + 2 100.0% 100.0% 0/2 14 57.1% 50.0% 8/14 目前试剂盒存在的问题-抗HCV对策-通常的做法是：初检阴性的血袋再用与不同厂家的国产试剂复检，如仍为阴性，血即为合格。或初检使用国产ELISA试剂，复检采用进口试剂。对策-应采取的办法：在血站筛检献血员血时，初检阴性尤其是S/CO值较高的血液，最好使用不同ELISA试剂盒复检，这样才能最大程度的减少经输血HCV感染的发生。 目前试剂盒存在的问题-抗HCV抗HCV ELISA出现假阳性的主要原因有：1.类风湿因子（RF）

18、的干扰2.高免疫球蛋白血症3.标本中超氧化物歧化酶（SOD）的干扰4.用于固相包被的HCV基因工程抗原不纯目前试剂盒存在的问题-抗HIV采用双抗原夹心一步法检测抗HIV -“钩状效应”所致的假阴性问题。 1.原因：HIV感染者中有些抗体滴度很高，采用可出现双抗原夹心一步法检测，可出现类似双抗体夹心一步法检测抗原的“钩状效应”现象。 2.措施：在血站筛检献血员时，应使用二步法试剂盒进行检测，或是对标本进行双份同时检测，一份原标本，一份1:10或1:100稀释标本，从而避免漏检。目前试剂盒存在的问题-抗HIVELISA测定结果的解释1.一般来说，一个感染HIV的患者，使用商品ELISA试剂盒测定，

19、结果应为阳性，因为在这些试剂盒中所用的包被抗原主要为gag编码蛋白和病毒包膜蛋白，针对这些蛋白的抗体在HIV感染的机体免疫应答中出现最早，而ELISA的测定敏感性足以将其早期测出，因此如果怀疑有可能的HIV感染，但ELISA测定结果为阴性，则HIV感染的可能性很小。2.实验操作或试剂有问题或不能确定可能出现感染的确切日期，如果HIV抗体ELISA测定为阴性，就不必立即重复检测。3.对于处于阳性判断值（Cut-off）边缘即稍低于Cut-off的样本，难于判断是否为感染早期，或实际为非感染者的样本，此时,可以再次取血测定和/或用另一种ELISA试剂盒检测，从而明确测定结果。这种情况下，如果测定结

20、果仍处于Cut-off边缘，则建议数月后再次测定,如仍无改变,则说明无HIV感染.其它如免疫印迹,PCR测定HIV RNA也为此种情况下的HIV感染验证实验.目前试剂盒存在的问题-梅毒螺旋体抗体梅毒螺旋体抗体 检测方法1.检测非特异性抗体-使用类脂质抗原的血清学试验 ：RPR、TRUST2.检测特异性抗体-使用密螺旋体抗原的血清学试验：FTA-ABS、TPHA、TPPA 、ELISA 、WB样 本编号 ELISA 检测结果 IgG IgM 1 2 3 Western Blot 检测结果 Tp14 Tp17 Tp22 Tp25 Tp45 Tp47 X403 96.7 0.76 9.2 5.8 6

21、.6 + + + + X404 56.0 0.38 6.4 3.0 4.5 + + + + X405 142.6 0.54 5.2 9.3 8.4 + + + + X406 91.8 0.44 4.6 9.1 4.6 + + + + + X407 137.9 0.37 2.8 3.7 8.1 + + + + + X408 26.8 0.47 8.3 7.1 6.5 + * * * * X409 147.7 1.28 9.3 1.9 5.6 + + + + X410 161.0 0.82 6.6 5.0 4.3 + + + + + X411 62.8 0.60 4.3 9.8 8.2 + + +

22、 + * X528 165.3 0.30 12.3 8.8 11.8 LN59 85.4 0.22 9.6 12.0 9.48 LN60 8.48 0.18 4.1 - 2.83 - - - - - - LN61 200 1.92 2.56 12.7 13.2 + + * LN62 - 0.24 1.21 0.96 1.34 - - - - - - LN63 102.9 0.1 9.48 11.1 8.97 + + + + + LN64 200 0.51 2.63 14.7 12.8 LN65 18.8 0.2 5.68 2.06 4.71 + + + + LN66 41.0 0.3 4.43

23、 12.2 5.81 LN67 168.4 0.2 9.70 14.2 11.8 LN68 - 0.1 4.56 4.84 3.51 + + + + 目前试剂盒存在的问题-HBsAg检测灵敏度 据文献报道，到目前为止在献血员中所发现的HBsAg 携带者最低含量为0.2 ng/ml。病毒变异 个别关键的氨基酸的替代变异，足以改变HBsAg 的构型，从而改变其抗原特性 不同亚型试剂盒临床试用评价试剂盒临床试用评价项 目 试 剂 编 码 阳 性 符 合 率 % 阴 性 符 合 率 % 总 符 合 率 % 使 用 单 位 数 得 分 均 值 P T 评 价 2 3 0 0 1 9 9 .3 9 9 9

24、 .1 8 7 9 9 .2 6 8 8 2 0 .9 9 3 9 9 2 3 0 0 2 1 0 0 1 0 0 1 0 0 7 1 1 0 0 2 3 0 0 3 1 0 0 9 8 .5 1 5 9 9 .1 1 1 3 5 0 .9 9 1 9 9 2 3 0 1 5 1 0 0 1 0 0 1 0 0 5 1 1 0 0 2 3 0 1 6 1 0 0 9 3 .3 3 3 9 6 5 0 .9 6 9 6 2 3 0 1 8 1 0 0 9 8 .4 1 3 9 9 .0 4 8 2 1 0 .9 9 9 9 2 3 0 2 1 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 2 1 1

25、0 0 2 3 0 4 3 1 0 0 1 0 0 1 0 0 9 1 1 0 0 H B s A g 2 3 0 8 1 1 0 0 9 7 .9 1 7 9 8 .7 5 8 0 0 .9 8 8 9 8 2 3 0 0 1 9 8 .9 5 8 9 8 .4 3 8 9 8 .7 5 6 4 0 .9 8 8 9 8 2 3 0 0 2 1 0 0 9 3 .3 3 3 9 7 .3 3 3 1 5 0 .9 7 3 9 7 2 3 0 0 3 1 0 0 9 8 .1 4 8 9 9 .2 5 9 1 0 8 0 .9 9 3 9 9 2 3 0 0 7 1 0 0 1 0 0 1 0 0 8 1 1 0 0 2 3 0 1 5 1 0 0 9 1 .6 6 7 9 6 .6 6 7 6 0 .9 6 7 9 6 2 3 0 1 6 1 0 0 8 5 .7 1 4 9 4 .2 8 6 7 0 .9 4 3 9 4 2 3 0 1 8 1 0 0 9 5