液体酶制剂工作手册-

1、康地恩生物集团CONTINENT BIOTECH GROUP液体酶制剂工作手册康地恩生物技术部2008年4月目 录1康地恩液体酶制剂产品概况2酶学性质研究3液体酶贮存稳定性4后喷涂设备设计指标、均匀度测定方法及部分测定结果5饲料中固体耐制粒植酸酶和后喷涂植酸酶的稳定性比较6内切木聚糖酶实验初报7液体酶动物试验报告附录:康地恩生物集团酶活定义及测定方法一、康地恩液体酶制剂产品概况KDN液体酶产品包括:植酸酶、木聚糖酶、复合酶、甘露聚糖酶。目前市场主要应用产品是液体植酸酶,其次为液体复合酶。1KDN液态植酸酶主要功能:磷是动植物必需的营养成分,饲料中的磷主要来源于植物性原料的植酸(C6H18O24

2、P6和磷酸氢钙等无机磷。每分子植酸含有六个磷酸基团,与钙、镁、钾、钠、铁等金属离子结合成为植酸盐。植酸还与饲料中蛋白质形成稳定络合物,降低赖氨酸等各种氨基酸的利用率。植酸降低动物胃肠道内的内源淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶活性,导致饲料的消化率降低。植酸酶能够降解饲料中的植酸盐,不仅释放出与其结合的磷,同时将钙、锰、锌及蛋白质、氨基酸释放出来,供给动物吸收利用,进一步提升饲料原料的潜在营养价值。饲料中植物性磷源的充分利用,降低了饲料中无机磷原料的用量,减少粪便中磷对环境的污染,起到降低生产成本,提高饲养效益的目的。KDN液态植酸酶筛选高活力、高稳定性植酸酶基因,利用转基因工程菌作为表达系统,采用先进的

3、液体深层发酵工艺,大规模地标准化工业生产。产品抗逆性强,酶活稳定;适宜作用温度3755。采用KDN液体后喷涂设备,可以均匀地喷涂到颗粒饲料表面,最大限度地保持酶活。KDN液态植酸酶的性状和保存:酶活含量:5000U/ml。外观:橘黄色,液态,允许有少量的凝聚物。包装:20L/桶。贮存:本品为生物活性物质,应密闭、避光、低温保存,保质期6个月。KDN液态植酸酶用法:用户可以根据饲料配方中原料结构及所含植酸磷水平,决定添加植酸酶的用量。将KDN植酸酶的全部潜在营养价值输入配方原料数据库中,在原料用量限制中设定KDN植酸酶的最高用量为60120ml/吨,不用对配方需要量设定作任何调整,直接由配方系统

4、优化计算最优配方。植酸酶潜在营养价值(5000 U/ml蛋鸡肉鸡猪添加量 60ml/吨 100ml/吨 100ml/吨73000 代谢能 530000530000粗蛋白 2250 2250 2000钙 1667 1000 1000总磷 2330 1150 1150有效磷 1960 1000 1000赖氨酸 120 120 80蛋氨酸 10 10 25胱氨酸 30 30 30苏氨酸 130 130 50色氨酸 30 30 302KDN 液体复合酶康地恩与丹尼斯克、山东大学微生物技术国家重点实验室合作,在原有固体复合酶的基础上,筛选出酶谱广、酶活高的生产菌株,采用固液联合发酵的先进工艺,成功地开发

5、出液体复合酶,已经在六和集团、希望集团推广使用,显著地提高了饲料的品质和消化率。产品优势:广酶谱、高酶活,适合中国饲料的配方特色,含木聚糖酶、果胶酶、甘露聚糖酶、纤维素酶、-葡聚糖酶、-半乳糖苷酶、淀粉酶。 木聚糖酶 200,000U/ml果胶酶 20,000U/ml甘露聚糖酶 1,000U/ml纤维素酶 3,000U/ml-葡聚糖酶 150,000U/ml-半乳糖苷酶 2000U/m淀粉酶 120U/ml稳定性高,相对固体酶而言,一般液体酶具保存期短的缺陷,康地恩液体复合酶经过高科技特殊稳定化处理,完全能满足饲料企业运输和库存的要求。KDN 液体复合酶产品性状和保存:外观:棕褐色透明液体包装

6、:20L/桶贮存:本品为生物活性物质,应密闭、避光、低温保存,保质期6个月。KDN 液体复合酶用法用量:通过后喷涂设备喷雾于高温制粒后的颗粒饲料上,每吨饲料100ml 。3KDN液体木聚糖酶在谷物籽实细胞壁中含有大量的抗营养因子木聚糖,占谷物细胞干重的20% 30%,而单胃动物消化道几乎不分泌分解木聚糖的酶。木聚糖在消化道中可以部分溶解,与蛋白质及淀粉共同形成粘性胶体,有很强的持水力,使食糜的黏度升高,由于是细胞壁中存在的一种结构多糖,将细胞内脂类,胆固醇,消化酶等包被在细胞内,难以释放,降低了营养物质的消化利用及消化酶的活性,影响日粮的转化效率和动物的生产性能,此外,木聚糖会与消化道后段微生

7、物区系相互作用,造成厌氧发酵,产生大量的生孢梭菌,分泌的某些毒素及酸性物质会影响动物的生长。由于木聚糖的影响,粪便粘性增加,影响畜舍和周围环境,污染禽蛋。木聚糖酶可以将木聚糖降解为寡糖,减小木聚糖的抗营养作用,促进营养物质的释放,提高饲料的利用率,也有利于环境保护,同时降解得到的低聚木聚糖能够促进双歧杆菌等有益菌大量增殖,改善动物肠道生态环境,抑制致病菌的生长。产品特点:1、KDN木聚糖酶为内切木聚糖酶,能快速有效地从分子内部随机地切断木聚糖的1,4糖苷键,水解效率高。2、解除植物性饲料中木聚糖对营养物质及消化酶的笼子效应,促进营养物质的释放和消化酶的作用效果。3、显著提高日增重和饲料转化率,

8、降低饲养成本。4、促进有益菌的生长,抑制致病菌,减少消化失调症及腹泻。5、增强动物免疫力,提高成活率,改善畜禽生长均匀度。6、减轻粪便黏度,有利于环境保护,防止粪便污染,改善禽蛋品质。7、同时具有一定葡聚糖酶及纤维素酶的活性,与木聚糖酶共同发挥作用。8、无任何副作用,使用方便,安全。KDN木聚糖酶性状及保存:酶活含量:5000U/ml。外观:棕褐色透明液体。包装:20L/桶。贮存:本品为生物活性物质,应密闭、避光、低温保存,保质期6个月。KDN液体木聚糖酶用法用量:通过后喷涂设备喷雾于高温制粒后的颗粒饲料上,每吨配合饲料3060ml。4KDN液体甘露聚糖酶产品特点1、促进动物生长,提高动物的饲

9、料转化效率。提高肉鸡增重4.410.3%,饲料转化率2.96.0%,肉猪增重4.28.6%,饲料转化率49%;50万单位/g的甘露聚糖酶在玉米豆粕型日粮中添加60-100g/T,可提高代谢能100-150kcal/kg,蛋白质消化率提高2.57%,粗纤维消化率提高6.45%。2、促进营养成分消化,改善动物肠道微生物生态,改善动物体的健康状况。玉米/豆粕日粮中添加甘露聚糖酶可使肉鸡盲肠沙门氏菌数量比对照减少12%。3、降低肠道内容物的粘稠度,减少粪便排泄,减轻环境污染。4、提高微量元素的生物利用率。5、甘露聚糖酶降解产物甘露寡糖可促进动物肠道有益菌的生长,可正向刺激机体免疫活性。6、改善营养,减

10、少应激反应压力,瘦肉率高、体型均匀、死亡率减少、饲料报酬高。7、降解产物甘露寡糖还能够吸附真菌毒素,减少抗生素等化学药物的使用,是生产绿色动物食品的添加剂。甘露聚糖酶对玉米-豆粕型日粮的应用效果动物种类 增重,%饲料转化效率%猪 + 4.2 18 + 4 9火鸡 + 5 + 3.7 6肉鸡 +2.2 3.6 + 4.3 5.6KDN液体甘露聚糖酶性状及保存:酶活含量:甘露聚糖酶500000u/ml。外观:淡黄至黄色,液态。包装:20L/桶。贮存:本品为生物活性物质,应密闭、避光、低温保存,保质期6个月。KDN液体甘露聚糖酶用法用量:通过液体后喷涂工艺,每吨全价饲料添加100ml(0.01%。二

11、、液体酶酶学性质研究1KDN植酸酶KDN植酸酶筛选高活力、高稳定性植酸酶基因,利用转基因工程菌毕赤酵母作为表达系统,采用先进的液体深层发酵工艺,大规模地标准化工业生产。KDN液态植酸酶适合颗粒饲料制粒温度高于80时,建议采用KDN液体后喷涂设备,最大限度地保持酶活。植酸酶为生物活性物质,应密闭、避光、低温保存,保质期6个月。标准酶活5000U/ml。饲料厂可以根据饲料配方中原料结构及所含植酸磷水平,决定植酸酶的用量。将KDN植酸酶的全部潜在营养价值输入配方原料数据库中,在原料用量限制中设定KDN植酸酶的最高用量为60-120ml/吨,不用对配方需要量设定作任何调整,直接由配方系统优化计算最优配

12、方。 *备注:KDN植酸酶在pH 1.56.5范围内都较好的活性表现,适合动物消化的需要. *备注:KDN植酸酶在温度30-80度范围内都较好的活性表现,适合动物消化的需要.2KDN木聚糖酶木聚糖酶可以将木聚糖降解为木寡糖,促进营养物质的释放,提高饲料的利用率;木寡糖促进双歧杆菌等有益菌大量增殖,改善动物肠道生态环境,抑制致病菌的生长。粪便水份和营养物质减少,有利于环境保护。KDN木聚糖酶选用优良发酵菌种,采用液体深层发酵技术,产品棕褐色透明液体,酶活高,木聚糖酶活性不低于10000U/ml;可采用KDN液体后喷涂设备,广泛用于各类禽猪颗粒饲料中。产品特点:1、KDN木聚糖酶,为内切木聚糖酶,

13、能快速有效地从分子内部随机地切断木聚糖的-1,4糖苷键,高效地解除植物性饲料中木聚糖对营养物质及消化酶的笼子效应,促进营养物质的释放和消化酶的作用效果,显著提高日增重和饲料转化率,降低饲养成本。2、降解产生的木寡糖促进有益菌的生长,抑制致病菌,减少消化失调症及腹泻,提高成活率,改善畜禽生长均匀度。3、减轻粪便黏度,有利于环境保护,防止粪便污染,改善禽蛋品质。4、无任何副作用,使用方便,安全。 *备注:木聚糖酶具有较宽温度作用范围,不仅适合动物消化的需要,而且能耐受饲料的高温制粒。. *备注:木聚糖酶具有较宽pH作用范围,非常适合动物消化的需要。各公司对产品性能的宣传相似,在对产品的描述上多是“

14、内切木聚糖酶”,按专家的意见,发挥主要酶解作用的应该是“内切木聚糖酶”,但现有的酶测定方法多是测定“外切木聚糖酶”酶活。所以,事实上并不能通过酶活测定结果来真实评价酶产品的实际功能。目前KDN酶制剂正致力于建立新的酶性能评价方法,比如:体外酶解实验。3KDN甘露聚糖酶甘露聚糖类物质作为半纤维素的第二大组分,广泛分布于自然界中。它是所有豆科植物细胞壁的主要组成成分,在其他植物性饲料原料中含量也很高。猪、鸡等单胃动物的肠道中不能分泌甘露聚糖酶等相关酶,因而-甘露聚糖及其衍生物不能被消化酶分解,从而对动物生产性能造成负面影响。KDN甘露聚糖酶特点:1、促进动物生长,提高动物的饲料转化效率。提高肉鸡增

15、重4.410.3%,饲料转化率2.96.0%,肉猪增重4.28.6%,饲料转化率49%;50万单位/g的甘露聚糖酶在玉米豆粕型日粮中添加60-100g/T,可提高代谢能100-150kcal/kg,蛋白质消化率提高2.57%,粗纤维消化率提高6.45%。2、促进营养成分消化,改善动物肠道微生物生态,改善动物体的健康状况。玉米/豆粕日粮中添加甘露聚糖酶可使肉鸡盲肠沙门氏菌数量比对照减少12%。3、降低肠道内容物的粘稠度,减少粪便排泄,减轻环境污染。4、提高微量元素的生物利用率。5、甘露聚糖酶降解产物甘露寡糖可促进动物肠道有益菌的生长,可正向刺激机体免疫活性。液态 KDN甘露聚糖酶在低温、避光、密

16、闭条件下贮存,保质期6个月。通过液体后喷涂工艺,每吨全价饲料添100ml(0.01%。 KDN甘露聚糖酶是目前国内唯一的非常适合动物消化需要的酸性酶,在较宽酸性pH作用范围内具有较高的酶活性表现。除了常规的温度和pH曲线外,康地恩还研究了甘露聚糖酶的耐热性和耐酸性。其“湿热稳定性”研究方法如下:称取酶样5.0000g。加入pH4.0的缓冲液在磁力搅拌上搅拌30分钟并定容至50ml,4000rpm离心10min,取上清液待用。将水浴锅温度分别调整为 40、50、60、70、80、90,在试管中加入24ml最适pH 的缓冲液置各水浴锅中预热10分钟,在每支试管中加入1ml酶样立即摇匀并计时,每个温

17、度两份,分别计时2分钟和5分钟,取出后立即放入冰水浴中迅速冷却。在最适pH和温度40的条件下测定酶活,以未经高温处理的酶样酶活为100%,其他条件的酶活占未处理酶样酶活的百分数为相应条件的相对酶活。 实验结果表明:在4060酶活无差异。超过60以后湿热5min的酶活比湿热2min的酶活下降明显,且随着温度的升高二者差异程度逐渐增大;经不同的pH条件处理1hr后,随着pH 的升高,酶活呈上升趋势,pH达到7.0时,酶活达到最高。该酶对不同pH的环境的耐受性较好,在pH3.07.5之间酶活一直保持在80%以上。4复合酶非淀粉多糖是妨碍饲料消化的重要因素,在原有固体复合酶的基础上,筛选广酶谱、高酶活

18、的生产菌株,采用固液联合发酵、超滤浓缩的先进工艺,并通过代谢筛选,利用单酶加强复配,成功地开发出液体复合酶,可显著地提高饲料的品质和消化率。KDN液态饲用复合酶优势:广酶谱、高酶活,兼容性好,适合中国饲料的配方特色,含木聚糖酶、纤维素酶、甘露聚糖酶、果胶酶、-葡聚糖酶、-半乳糖苷酶、淀粉酶。木聚糖酶 200,000U/ml纤维素酶 3,000U/ml甘露聚糖酶 1,000U/ml果胶酶 20,000U/ml-葡聚糖酶 150,000U/ml-半乳糖苷酶 2,000U/ml淀粉酶 120U/ml KDN液态饲用复合酶棕褐色,澄清透明,经过稳定化处理,稳定性高,完全能满足饲料企业运输,贮存和生产需

19、要。本品为生物活性物质,避光、密闭保存,低温贮存,保质期半年。通过后喷涂设备喷涂于高温制粒后的颗粒饲料表面,每吨配合饲料添加100ml。康地恩生物技术部酶制剂项目技术组,对复合酶酶谱中主要组分进行了一系列酶学性质研究,研究内容包括目标酶组分的温度、pH曲线、耐酸性、耐热性等等。本手册就部分研究成果:复合酶中的木聚糖酶、甘露聚糖酶和果胶酶的基本酶学性质简介如下:z复合酶中木聚糖酶酶学性质研究: 以上曲线说明,该木聚糖酶为酸性酶,最佳作用温度在45左右,吻合动物体内消化的温度,适合动物消化的需要。z复合酶中甘露聚糖酶的酶学性质研究: 该甘露聚糖酶极其耐酸性,在较宽酸性pH作用范围内具有较高的酶活性

20、表现。z复合酶中果胶酶的酶学性质研究: 该温度曲线说明KDN复合酶中的果胶酶最佳作用温度在40左右,非常吻合动物体内消化的温度。 此pH曲线说明该果胶酶是酸性酶,在较宽酸性pH作用范围内具有较高的酶活性表现,符合动物前段消化道pH特性的需要。在pH中性时也具有相当的酶活表现,能满足肠道消化道pH特性的需要。三、液体酶贮存稳定性液体酶自研究开发、生产至今,一直在探索更好的保存方法和稳定剂配方。原有的液体酶保存稳定实验数据,大多集中在稳定剂配方的筛选方面。而至今为止大量的液体酶产品储存稳定性试验结果表明:影响酶活储存稳定性的最主要因素是温度和剂型,其次是酶的品种,配方是较为次要的因素。以下图表由生

21、产基地品控数据整理,这些数据均来自生产基地液体酶产品保存过程。实验方法简介:费县生产液体植酸酶3批,取每批新产品测定酶活,求其平均值设为相对酶活100%,每批产品分4、30、37条件分别存放样品。在样品保存达30、60、90天时分别测定样品酶活,取各批次样品酶活平均值,与初始酶活平均值相比,得到一定温度条件下的样品相对剩余酶活。费县生产液体木聚糖酶1批,实验方法同上。惠民科技园生产液体复合酶10批,实验方法同上。实验结果:1、液体植酸酶 2、液体木聚糖酶 3、液体复合酶 讨论:1.以上液体酶保存稳定性属一般水平,是KDN液体酶产品保存稳定性的现况,也是国内外一般酶产品保存稳定性的现况,供市场应

22、用参考。2.液体酶为具生物活性的生化酶产品,其最适宜安全的运输、储存过程必须冷藏,全世界都一样。短期内室温储存也是允许的。无须冷藏的具生物活性的生化酶产品是不存在的。3.酶制剂项目将进一步提高产品技术水平,永无止境。四、后喷涂设备设计指标、均匀度测定方法及部分测定结果1、后喷涂设备研制酶作为一种蛋白质,对环境因素很敏感。温度、pH值、水分、强酸、强碱、紫外线和贮存过程等都会对酶活产生很大的影响。在饲料制粒、挤压和膨化过程中受温度、压力和水分的强烈作用,酶制剂等热敏性微量组分的大部分功效都丧失。一般酶活性的最适温度为30-50,超过60时酶就会变性,丧失活性。如制粒温度超过85,就应采用液体酶制

23、剂喷涂到冷却后的颗粒料上,从而避免高温蒸汽对酶活的不利影响。由于液体后喷涂的优越性,世界上各设备生产商,如瑞士的Buhler、德国的Kahl 和Chevita、美国的Finnfeads、丹麦的Sprout-Matador、Danisco、比利时的Schranwen 和荷兰的Wijnveen等公司纷纷投入到研制液体喷涂机的行列上来,并不断有新产品问世。国内外饲料生产商纷纷采用这种工艺添加酶制剂等热敏性微量组分。国内对液体后喷涂的认识始于20世纪80年代末,而液体喷涂机的出现只是在近几年。时至今日,生产厂家也屈指可数。KDN-PPA液态酶后喷涂设备组成KDN-PPA液态酶后喷涂设备是用于全价饲料加

24、工过程中,向饲料颗粒表面喷涂微量液态酶制剂的设备。本设备按照上述要求,采用国外同行业最先进技术研制而成、主要的电控件、泵、传感器、阀均采用国际名牌产品,确保产品运行可靠,计量准确。KDN-PPA设备的硬件由泵室、添加室、控制箱组成:泵室含有计量泵、酶流量标定装置等。添加室含有颗粒饲料流量秤和喷涂装置等。控制箱含有PLC、触摸屏等。工作原理合格的饲料颗粒经分级筛进入缓冲仓(C,控制箱内的PLC收到仓料料位传感器(A的有料输入信号,产生输出,给箱内颗粒饲料流量表启动信号,颗粒饲料流量表将根据人为指定的目标流量(t/h进行PID调节,相应打开添加室进料门(B,饲料靠自重流下,同时,安装在添加室内的喷

25、涂电磁阀(D打开,泵室根据触摸屏中指定的酶制剂流量(1/h、酶泵的选择以及颗粒饲料流量表的开门信号启动,将高压空气和酶(单泵为E,双泵为E和F按要求的流量和压力送到添加室,达到喷涂的目的。技术参数额定饲料生产率4-20吨/小时酶加入量(参考值为每吨饲料加酶0-200ml;称重精度:饲料的称重精度±0.5%;微量液体的计量精度少于5%建议安装位置添加室安装在旋转分级筛和颗粒饲料成品仓之间,要求水平。泵室安装在添加室的附近,要求水平。控制箱安装在离现场50米以内,无灰尘的室内。一般安装在饲料厂控制室内。上料位传感器安装在添加室上方的颗粒饲料缓冲仓的适当位置。下料堵塞传感器安装在添加室下方

26、,靠近添加室的落料管壁上。2、市场上的后喷涂设备酶稀释方式精确度均匀度CV缓存仓称量振动稳定性粉化率安装规模Sprout-Matador 多种未知未知 / 分配器固定高高无,100万和美酵素和美酵素水低 / 有固定高低早期多,NSP酶农机院无水低 / 无固定高低未见正昌无空气、水高 / 有悬挂低低 4ADISSEOcomec罗酶宝水高 / 有/无压力低低广东60台DANISCO 植酸酶空气高 40% 无,长管道压力低高广东多KDN植酸酶复合酶维生素空气高 10-15% 有位移低低山东、广东、河南、江苏、广西、海南 80台3、颗粒饲料中植酸酶均匀度测定方法(液体酶性质及后喷涂设备的研制、设备可行

27、性实验后喷涂后喷涂植酸酶的均匀度测定,已在饲料工业等杂志发表。基于此测定方法的后喷涂植酸酶稳定性,实验结果见第五部分“饲料中植酸酶的稳定性”,现有结果证明植酸酶喷涂到饲料表面后相当稳定。1前言植酸酶是催化植酸释放磷酸根的酶。由于在植物来源的饲料中加入植酸酶可明显提高动物对其中植酸磷的利用,不仅可以降低饲料生产成本,而且能够大幅度减少动物粪便中的磷含量,植酸酶已经在养殖业被广泛使用。在颗粒饲料生产中,调质和制粒步骤可使饲料温度升高到85以上,可使植酸酶不同程度的失活,普通植酸酶的活性能降低80%。因此,在颗粒饲料中,通常添耐高温、耐制粒的植酸酶或使用后喷涂设备在制粒后喷涂液体植酸酶。准确、快速的

28、测定颗粒饲料中植酸酶的含量和均匀度,对植酸酶的有效利用十分必要。由于全价饲料中存在水溶性磷酸盐,从饲料中提取植酸酶后直接用分光光度法测定酶活,存在底物抑制、检测偏差大、重复性差的问题。另外,饲料中的酯类及其复合物对测定也有不利影响。康乃尔大学的T. W. Kim及其合作者改进了以前的检测方法,利用微滤膜除去提取液中的酯类、使用超滤柱除去水溶性磷。在01500u/kg的植酸酶活范围内,CV由原方法的2839%降低到16% (n=6,添加的植酸酶活性与测定的植酸酶活性呈线形关系(r2=0.99,P<0.01。新方法可以准确的测定全价饲料中的植酸酶含量。本试验在T. W. Kim报道的改进方法

29、的基础上,通过增加称样量和反应体系中的酶液量,提高了检测灵敏度(线性检测限100u/kg。酶活500u/kg时回收率为98.02%,CV=2.90%(n=6。2 颗粒饲料中植酸酶的检测方法2.1试剂与仪器本方法中所有试剂,在没有注明其它要求时,均指分析纯试剂和符合GB/T 6682中规定的三级水。清洗试验用容器不要用含磷清洗剂。称取34.02g三水乙酸钠(CH3COONa3H2O 于1000ml容量瓶中,加入900ml水用盐酸调节pH至5.0±0.01,并用蒸馏水定容至1000ml,室温下存放两个月有效。称取34.02g三水乙酸钠(CH3COONa3H2O,0.5g Trion X-

30、100, 0.5g牛血清白蛋白(BSA于1000ml 容量瓶中,加入900ml水用盐酸调节pH至5.0±0.01,并用蒸馏水定容至1000ml,室温下存放两个月有效。称取0.6929g肌醇六磷酸钠(C6H6O24P6Na12于100ml容量瓶中,用0.25mol/L乙酸缓冲液(5.1溶解并定容至刻度,用盐酸调pH值到5.0,现用现配(实际反应液中的最终浓度为5.0mmol/L。2.2测定步骤称取不含植酸酶的空白饲料试样7份,每份10克,精确至0.0002克,分别加入150 ml过称重(1ml缓冲液=1.00263g定溶至4ml,混合均匀,制成待反应样液。开始,向每只试管中加入的时间间

31、隔要绝对一致,37水浴30min。反应步骤及试剂、溶液用量见表1。表1反应顺序样品、标准品样品空白(标准空白1. 加乙酸缓冲液(0.8ml2. 加待反应液 0.8ml3. 混合4. 37预热5min 6. 混合7. 37水解30min 9. 混合10ml 总体积 10ml以实测吸光值为横坐标、酶活为纵坐标,列出直线回归方程(y=ax+b。取试样35克,粉碎至全部过20标准筛,装入密闭容器4保存。操作同回归曲线相应部分。同标准曲线相应部分。得到实测吸光值后,用直线回归方程计算植酸酶的活性。U= C /mU 试样中植酸酶的活性,U/gC 根据实际样液的吸光值由直线回归方程计算出的酶活性,U 。m

32、试样质量,g 。两个平行样品的测定结果用算术平均值表示。同一样品两个平行测定值的相对偏差大于10%。3、部分均匀度测定结果及讨论3.1 伴随后喷涂设备的市场推广,康地恩生物研发中心实验室已经进行了数十次液体后喷涂均匀度的检测,检测样品通过随机取样法,取自各饲料厂生产线。这些测定结果可以证明康地恩后喷涂设备具有良好的喷涂均匀度。KDN后喷涂生产线颗粒饲料的植酸酶均匀度检测结果点滴:1饲料厂一的后喷涂饲料中植酸酶均匀度测定结果样品编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14酶活u/kg 606.7 656.3 455.1 502.5 509.7 654.8 613.7 5

33、27.2 557.5 489.6 504.8 506.0 411.6 584.0 平均值=541.4SD=73.34CV=13.55%2饲料厂二后喷涂饲料中植酸酶均匀度测定结果样品编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9平均值=822.1SD=83.048CV=10.10%3饲料厂三后喷涂饲料中植酸酶均匀度测定结果样品编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15SD=243.3CV=72.07%4使用固体植酸酶的颗粒饲料植酸酶均匀度检测结果样品编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12酶活u/kg192.8 455.9 219.2 426.8 1

34、53.1 263.6 341.7 195.2 260.6 285.8 230.5 268.7 平均值=274.5SD=92.34CV=33.64%3.2讨论根据各条生产线所生产饲料植酸酶含量的RSD、CV值,使用KND后喷涂设备生产的饲料植酸酶均匀度最好,使用固体植酸酶的饲料均匀度次之,其他厂商后喷涂生产线颗粒饲料的植酸酶均匀度最差。后喷涂设备喷涂均匀度是衡量其性能的最关键指标。KDN后喷涂设备与其他厂家后喷涂设备的差别在于KDN设备增加了缓冲仓,克服了冷却器间断下料,保证生产的连续和加酶系统的连续,防止控制系统的频繁启动,从而提高了控制的精度。除后喷涂设备本身的原因外,饲料加工中的一些因素也

35、会影响后喷涂均匀度。这些影响因素包括冷却器下料的连续性及均匀程度、产量、颗粒大小的均匀度等。在安装后喷涂设备时,应充分考虑这些因素。固体植酸酶的添加量为100克/吨。提供样品的饲料厂首先1:9预混,然后按0.1%加入饲料。混合过程是影响均匀度的主要原因。均质温度的差异也会造成酶史活差异,进而影响均匀度。五、饲料中固体耐制粒植酸酶和后喷涂植酸酶的稳定性比较前言由于植酸酶提高饲料中总磷利用率、减少排磷的效果确切,经济效益和社会效益明显,使用植酸酶的饲料逐步增多。植酸酶的添加方式分为制粒前添加和制粒后添加。对制粒前添加的植酸酶,要求其有良好的耐热、耐制粒性,在调质、制粒过程中酶活损失少,制粒后仍然有

36、足够的酶活。制粒后添加的植酸酶一般为液体,使用喷涂设备将其均匀地喷涂到饲料颗粒表面。耐制粒植酸酶使用方便,但价格高。液体植酸酶价格低,需要增加喷涂设备才能使用。但长期使用液体植酸酶能明显降低成本低,因此使用液体植酸酶的饲料厂逐步增多。由于液体酶被喷涂在饲料表面,与空气直接接触,其稳定性被普遍怀疑。本试验模拟茼仓储藏条件,比较了饲料中固体耐制粒植酸酶和后喷涂植酸酶的稳定性,发现喷涂在饲料表面的植酸酶的稳定性好于耐制粒植酸酶的稳定性。1、试验目的比较饲料中固体耐制粒植酸酶和后喷涂植酸酶的在模拟茼仓贮存条件下的稳定性。2、试验材料添加固体耐制粒植酸酶的饲料:添加某进口耐制粒植酸酶,添加量为每克饲料1

37、0u,制粒后酶活约每克饲料u,酶活变异系数为6.7%(n=12。喷涂液体植酸酶的饲料:喷涂用液体植酸酶为山东康地恩公司液体植酸酶,喷涂量为600 ml/吨饲料,酶活约为,酶活变异系数7.2%(n=12。所有试剂,在没有注明其它要求时,均指分析纯试剂和符合GB/T 6682中规定的三级水。3、方法3.1样品处理将添加植酸酶的饲料在相对湿度75%的条件下,6010小时、3714小时交替处理,共处理10天。一定时间间隔以四分法取样测定酶活。3.2植酸酶酶活测定按Q/KDN002-2006方法测定。每次两个平行,取两平行之间偏差不超过6%的数值作为测定结果。4、结果4.1第一次试验结果(相对酶活时间(

38、天进口植酸酶(%后喷涂(%0 100 1001 81.4 82.42 64.4 71.73 73.2 79.84 67.3 625 58.7 59.26 46.3 57.110 41 56.14.2第二次试验结果(相对酶活后喷涂(%时间(天进口耐制粒植酸酶(%0 100 1001 84.43 82.342 74.05 63.633 69.55 59.224 77.16 64.945 57.09 62.606 55.36 63.127 55.36 62.858 36.68 50.919 37.02 48.8310 37.37 50.915、讨论试验结果表明,喷涂在饲料表面的液体植酸酶比耐制粒植酸

39、酶更稳定,与人们对液体酶稳定性的普遍怀疑截然相反。饲料表面的酶与空气接触多,酶活损失一般会大些。同时,液体酶也会与饲料中的磷和植酸结合。植酸和磷作为植酸酶的底物和产物,对酶的稳定性有保护作用。另外,液体植酸酶中的保护剂,对酶在饲料表面的稳定性也会起一定作用。这些作用的共同结果,表现为喷涂在饲料表面的植酸酶,在模拟筒仓条件下,稳定性好于固体耐制粒植酸酶。六、 内切木聚糖酶实验初报目前木聚糖酶市场上各公司对产品性能的宣传相似,对产品的描述多是“内切木聚糖酶”,按专家的意见,发挥主要酶解作用的应该是“内切木聚糖酶”,但现有的酶测定方法多是测定“外切木聚糖酶”酶活。所以,事实上并不能通过酶活测定结果来

40、真实评价酶产品的实际功能。KDN 酶制剂目前正致力于建立新的酶性能评价方法,如体外酶解实验。同时,KDN 酶制剂也开始采用木聚糖酶内切酶专用底物(此内切酶测定方法国际上已经普遍认可,来评价KDN 内切木聚糖酶的表现。以下是KDN 内切木聚糖酶与市场上同类产品的比较试验,实验数据供市场参考:内切木聚糖酶酶活定义:内切酶活(Megazyme Tablets 法:在100mM,pH4.7醋酸钠溶液中,温度为40的条件下,每分钟从10mg/ml 的小麦阿拉伯木聚糖溶液中释放出1mol 的相当于D 木糖的还原糖量,为一个酶活单位。曲线:y =41.5x-0.6实验材料:1.六和F05复合酶原粉(0754

41、8批8元/kg2.六和F05复合酶原粉(08124批8元/kg3.A 酶4. B 酶5. C 酶6. D 酶7. E 酶8. F 酶9. G 酶10.H 酶11.I 酶备注:3-11 酶是市场收集品种 测定结果:样品 重量(g 稀倍 吸光度 内切酶活 外切酶活原粉070548批 1 30000 0.265 312 716103 原粉08124批 1 30000 0.264 311 709899A 酶 1.0005 13000000.356 18417 21930826B 酶 1 300000 0.253 2970 4103070C 酶 1 ml 300000 0.227 2646 306158

42、0D 酶 1.0012 600000 0.321 7624 6942029E酶 1135514104100000.2644555520.25630F酶 1.0013000317964637670.317G酶 13000000.283123346286687600000H酶 12312266650.29320000I酶 1数据处理:外切酶活内切酶活比例样品外切酶活内切酶活原粉070548批 1000000 436原粉08124批 1000000 438840A酶 1000000724B酶 1000000C酶 1000000864D酶1000000 1098767E酶 100000066F酶 10

43、00000G酶1000000 1185542H酶 1000000I酶1000000 1019外切酶活性价比样品外切酶活元/万单位原粉070548批8元/kg 716103 0.11原粉08124批8元/kg 709899 0.110.65C酶 30615800.40D酶 694202916.23E酶 1355140.88F酶 4555520.14G酶 3179646H酶 123346280.21内切酶活性价比样品内切酶活元/百单位原粉070548批8元/kg 312 2.56原粉08124批8元/kg 311 2.577.56C酶 26463.67D酶 7624211.54 E酶 104133

44、.33 F酶 301.19G酶 37673.89H酶 6687七、液体酶动物实验报告肉鸡日粮中添加KDN复合酶制剂对肉鸡生产性能影响的研究刘玉庆1,孙彩云2,孟庆贺2,隋海龙2,黄长春3,王建学3山东省农业科学院畜牧兽医研究所1山东大学微生物技术国家重点实验室2山东六和集团养殖事业部3饲喂粉料是长期以来传统的养殖模式,酶可以直接先加到预混料。随着养殖集约化程度提高,以及对饲料品质的要求提高,高温制粒生产工艺在大型饲料厂已经普及,而饲料制粒会导致饲料自身内源酶和外源添加酶的活性受到损失,因为酶是热敏感的活性蛋白质,其功能依赖于其特定的结构和构象。为了避免饲料制粒的活性损失,可采用稳定化技术和制粒

45、后喷涂酶技术。后者对酶的结构影响较少,在万吨以上的饲料厂使用已经具有经济可行性。通过精确的喷雾系统,将液体酶均匀地涂布到饲料颗粒表面,可以保护饲料中酶的有效活性,达到加酶的最佳效果,提高饲料品质。青岛康地恩生物技术有限公司与山东大学微生物技术国家重点实验室合作,在原有固体复合酶的基础上,筛选广酶谱、高酶活的生产菌株,采用固液联合的先进工艺,成功地开发出KDN液体复合酶,已经在六和集团、希望集团推广使用,本文对该复合酶的活性进行测定,通过山东六和集团养殖事业部临沂肉鸡一场规范的大规模肉鸡饲养试验证明KDN复合酶能显著地提高了饲料的品质和消化率。I.材料与方法按青岛康地恩生物技术有限公司与山东大学

46、微生物技术国家重点实验室联合制定的KDN酶活测定手册方法测定。在-18、4、20保存,测定其主要酶活的稳定性。采用非配对试验设计,将试验单位随机分为两个处理组,每个处理5个重复,共10个组,每组11220只,试验动物为AA肉食鸡,饲养密度为约11只/米2,饲养期为2005年11月1日-12月12日。各组处于基本相同的饲养环境下,饲养方式、消毒、免疫、给药方式一致。对照组日粮为普通肉鸡饲料,试验组日粮为每吨普通肉食鸡饲料通过后喷涂设备添加100ml液态复合酶制剂组成。表1、普通肉鸡饲料原料1号2号3号72.669.0玉米 63.7油脂0.8 0.7 1.8 豆粕(48% 29.6 26.6 18

47、.3大豆乳清粉 2.0 0.0 2.0 花生粕0.5 0.0 2.0 盐0.1 0.3 0.2石粉 1.3 1.2 1.2 磷酸氢钙 1.5 1.4 1.3 胆碱0.1 0.1 0.1蛋氨酸0.1 0.1 0.1预混料0.4 0.4 0.4赖氨酸0.0 0.1 0.1在第14、21、35、41个饲养日从每组中随机抽样100只,计算平均体重,统计出各期采食量及增重、料肉比。II.结果与分析2.1KDN复合酶的酶活和稳定性测定KDN复合酶为棕色透明液体,适合喷涂设备要求,有发酵清香,含木聚糖酶、纤维素酶、甘露聚糖酶、果胶酶、-葡聚糖酶、淀粉酶。广酶谱、高酶活,适合中国饲料的配方特色。表2、KDN复

48、合酶的酶活酶种酶活木聚糖酶 200,000U/ml纤维素酶 3,000U/ml甘露聚糖酶 1,000U/ml果胶酶 20,000U/ml-葡聚糖酶 150,000U/ml淀粉酶 120U/ml KDN复合酶经过稳定化处理,可以稳定保存45天,完全能满足饲料企业运输和库存的要求。表3、在不同温度下保存的KDN复合酶的酶活变化存放时间 12天 48天存放温度-184 20-184 20酶活万U/ml 21 20 18 22 21 20 木聚糖酶残存% 100 97 91 100 97 912.2试验鸡料肉比和体重比较对照组,降低1%(表4,平均日增重高于对照组(表5,同时试验组的鸡群整齐度好,存活

49、率高(表6。表4、试验鸡料肉比周龄 2 3 4 5 全期试验组 1.418±0.038 1.482±0.033 1.762±0.057 1.758±0.031 1.740±0.016对照组 1.424±0.051 1.546±0.086 1.850±0.061 1.825±0.055 1.793±0.027表5、试验鸡平均日增重(g周龄 2 3 4 5 全期试验组26.94 55.70 61.88 84.795 54.75 对照组27.08 50.8 59.38 80.5 52.925表6、试验

50、鸡阶段存活率(%周龄 2 3 4 5 全期试验组96.7 97.1 97.3 97.5 97.15 对照组96.7 96.5 96.6 97.4 96.8III.结论与讨论动物是通过酶的强大催化作用来消化食物的,酶的来源主要是消化道分泌的酶或者消化道微生物分泌的酶,但当前超高营养水平的饲料和非常规原料的广泛使用,使饲料消化率还有很大的潜力,外源添加的的酶制剂可以看成体内消化的延伸,因而酶制剂的在饲料中的应用迅速兴起。从饲料专用酶的生产到酶在饲料中的应用都是当前饲料界的巨大挑战。KDN液体复合酶,广酶谱、高酶活,适合中国饲料的配方特色。完全能满足饲料企业运输、库存和喷涂设备的要求。六和集团养殖事

51、业部肉鸡场都是大规模的现代化肉鸡场,在这样规范稳定的生产条件下,经后喷涂工艺添加KDN复合酶,对试验组料肉比、平均日增重和整齐度都具有明显的的改善。KDN自行开发了液体后喷涂设备,采用气液双料喷涂工艺,解决了喷涂设备液体滴漏的弊端,同时KDN液体复合酶和后喷涂设备价格远低于进口同类产品,具有更好的性价比,必将有力地推动酶制剂在我国饲料行业的广泛合理应用。低代谢能日粮中添加液体复合酶对肉鸡生产性能的影响摘 要:本试验选用216只AA肉鸡采用单因素随机试验设计,研究了商品日粮AME降低30kcal/kg条件下,添加100ml/T KDN液体复合酶808LH对肉鸡生产性能的影响。试验结果表明,试验组

52、在正对照组基础上日耗料量、日增重分别提高2.1%、3.3%;试验组在负对照基础上日增重提高3.8%、4.8%,料肉比降低0.04,且在121日龄阶段降代谢能日粮后喷涂KDN液体酶808LH效果更为明显(P<0.05,试验组121日龄阶段的日耗料量、日增重比正对照组分别高2.2%、5.9%,比负对照组分别高1.8%、6.3%(P<0.05,料肉比较正对照组、负对照组分别降低0.05、0.07(P<0.05。关键词:KDN液体复合酶808LH;肉鸡;生产性能;降AME日粮酶制剂本身是一类蛋白质,影响蛋白质的任何因素都会影响酶制剂的活性。酶制剂的活性随温度的升高而增加,但当温度高到

53、一定程度时,又使酶变性而丧失活性。一般酶活性的最适温度为3045,超过60时酶会发生蛋白质变性,丧失活性。一般饲料厂在制粒过程中温度和压力都较高,而酶对高温、高压、高湿的环境非常敏感,其活性往往发生不同程度的损失,这成为酶制剂在饲料企业推广中的最大制约因素。目前,高温耐热的酶制剂研究还不成熟,相应方案之一是采用后喷涂设备将液体酶在饲料制粒后后喷涂,此工艺可避免饲料生产中高温、高压对酶的破坏,最大程度保存酶的活性。康地恩生物集团通过液体发酵工艺最新研制成适宜后喷涂的KDN液体复合酶808LH,本试验旨在研究根据商品肉鸡实际生产情况,探讨商品日粮AME降低30kcal/kg 条件下喷涂KDN液体复

54、合酶对肉鸡生产性能的影响,以此为KDN液体复合酶808LH的推广应用提供理论依据。1.材料与方法1.1 酶制剂的种类及酶活测定方法试验所用液体复合酶808LH(产品执行标准Q/SLH 001-2006由青岛康地恩生物集团山东六和农牧科技园有限公司提供,具体酶活见产品说明。1.2 基础日粮组成及营养水平本试验选用玉米-豆粕型肉鸡典型日粮,肉鸡基础日粮配制标准参照中华人民共和国农业部2004年发布的鸡饲养标准(NY/T 33-2004,基础日粮组成及营养水平见表1。1.3 试验设计试验分为正对照组、负对照组、试验组。负对照组即在正对照日粮基础上AME降低30kcal/kg配制而成,试验组是在负对照

55、组日粮中添加100ml/T KDN液体复合酶808LH配制而成。表1 基础日粮组成及营养水平510(121d(%511(2242d(%原料名称正对照 负对照 正对照 负对照玉米 60.22 61.33 64.10 64.92玉米酒精糟 3.00 3.00 4.00 4.00豆粕 22.00 21.58 14.40 14.26棉粕 2.00 2.00 3.00 3.00花生粕 5.00 5.00 5.00 5.00玉米蛋白粉 3.00 3.00 3.50 3.50猪油 0.90 0.21 2.10 1.42预混料 3.88 3.88 3.90 3.90营养水平AME(kcal/kg2899.8

56、2869.0 3013.8 2981.0 CP(% 21.12 21.01 19.00 19.00钙(% 0.92 0.92 0.89 0.89 有效磷(% 0.45 0.45 0.41 0.42总赖氨酸(% 1.12 1.11 1.03 1.02 注:1.肉中鸡预混料由山东六和集团提供;2.试验日粮均为颗粒饲料;3.液体酶制剂采用后喷涂设备添加。本试验采用单因子随机试验设计,选用216只1日龄AA肉雏鸡,按照公母各半、体重一致的原则随机分为3个处理组,每个处理设4个重复,每个重复18只鸡。试验期间记录每日耗料量,试验期前后分别对试验动物称重,并计算16周龄的日增重、阶段增重、耗料量、耗料比等数据。试验鸡只采用立体重叠式笼养,人工控制光照、温度和湿度。自由采食和饮水,自然通风,其他饲养管理和免疫按常规肉鸡饲养办法和免疫程序进行。以鸡只个体或重复为单位,计算两个处理组日粮试验前后的表观代谢能和蛋白质的利用率,数据用SPSS(11.5软件进行单因素方差分析和邓肯氏(D