生物离心-区带分离

1、区带离心法区带离心法原理原理：利用各种粒子的沉降速度和浮力密度差，当一：利用各种粒子的沉降速度和浮力密度差，当一定粒子到达与其密度相同的梯度位置时则停止沉降，定粒子到达与其密度相同的梯度位置时则停止沉降，不同粒子处于不同位置，则得到了分离。不同粒子处于不同位置，则得到了分离。分类分类: A: A、差、差速区带离心法速区带离心法 B B、等、等密度区带离心法密度区带离心法区区带离心法带离心法 A A、速率区带离心：速率区带离心： 速率速率区带离心法依据样品中各组分区带离心法依据样品中各组分沉降速率的差别沉降速率的差别而使其互相而使其互相分离。在离心管中灌制好预制的一种分离。在离心管中灌制好预制的

2、一种正密度梯度介质液正密度梯度介质液，在其表面，在其表面铺上一层样品溶液，离心期间，样品中各组分会按照它们各自的速铺上一层样品溶液，离心期间，样品中各组分会按照它们各自的速率沉降，被分离成一系列的样品组分区带，故称速率区带离心。率沉降，被分离成一系列的样品组分区带，故称速率区带离心。 预制预制密度梯度介质的作用有二个，一是密度梯度介质的作用有二个，一是支撑样品支撑样品，二是，二是防止离防止离心过程中产生的对流对已形成区带的破坏作用心过程中产生的对流对已形成区带的破坏作用。但是。但是样品液的密度样品液的密度一定要大于密度梯度介质的最大密度一定要大于密度梯度介质的最大密度，否则就不能使样品各组分得

3、，否则就不能使样品各组分得到有效分离。到有效分离。 离心离心过程中，各组分的移动是相互独立的。因此，过程中，各组分的移动是相互独立的。因此，S S值相差很值相差很小的组分也能得到很好的分离，这是差速离心法做不到的。但速率小的组分也能得到很好的分离，这是差速离心法做不到的。但速率区带离心区带离心不适于大量制备实验。不适于大量制备实验。 严格控制离心时间严格控制离心时间颗粒密度大于介质密度颗粒密度大于介质密度pmpm事先配成较平缓的连续密度的梯度溶液事先配成较平缓的连续密度的梯度溶液不能用角式转头、只能用水平式转头不能用角式转头、只能用水平式转头不能用刹车不能用刹车分离蛋白质，分离蛋白质，RNA和

4、核糖体这类生物大分子是比较理想的。和核糖体这类生物大分子是比较理想的。B B、等密度区带离心法、等密度区带离心法 依据依据粒子本身的粒子本身的密度差异密度差异而进行分离。如果离心管中而进行分离。如果离心管中介质的密介质的密度梯度范围包括待分离样品中所有组分的密度度梯度范围包括待分离样品中所有组分的密度，离心过程中各组分，离心过程中各组分将逐步移至与它本身密度相同的地方形成区带，这种分离方法称为将逐步移至与它本身密度相同的地方形成区带，这种分离方法称为等密度梯度离心。等密度梯度离心。 在在等密度梯度离心中，组分的分离完全取决于组分之间的等密度梯度离心中，组分的分离完全取决于组分之间的密密度差。离

5、心时间的延长或转速提高不会破坏已经形成的样品区带，度差。离心时间的延长或转速提高不会破坏已经形成的样品区带，也不会发生共沉现象。也不会发生共沉现象。用用预制密度梯度的等密度离心分离方法预制密度梯度的等密度离心分离方法用用自生梯度的等密度离心分离方法自生梯度的等密度离心分离方法 离心离心开始后开始后, , 梯度液受离心力的作用逐渐形成底浓而管顶稀的梯度液受离心力的作用逐渐形成底浓而管顶稀的密度梯度密度梯度, ,与此同时原来分布均匀的样品粒子也发生重新分布。各与此同时原来分布均匀的样品粒子也发生重新分布。各种颗粒移动到与它们各自密度恰好相等的位置上形成区带。种颗粒移动到与它们各自密度恰好相等的位置

6、上形成区带。特点：特点：（1 1）与样品粒子的密度有关）与样品粒子的密度有关（2 2）与样品粒子的大小和其他参数无关）与样品粒子的大小和其他参数无关 （3 3）转速、温度不变）转速、温度不变, ,则延长离心时间则延长离心时间也也不不改变这些粒子的成带位置。改变这些粒子的成带位置。注意注意点：点：离心时间要长离心时间要长可用角式转头或水平式转头可用角式转头或水平式转头粒子密度相近或相等时不宜用粒子密度相近或相等时不宜用密度梯度溶液中要包含所有粒子密度密度梯度溶液中要包含所有粒子密度不能用刹车不能用刹车 1 1、依据的原理不同依据的原理不同 速率速率区带离心依据粒子的区带离心依据粒子的沉降速率沉降

7、速率被分离；等密度梯被分离；等密度梯度离心依据粒子本身的度离心依据粒子本身的密度差异密度差异被分离。被分离。 2 2、介质的梯度范围介质的梯度范围不同不同 速率速率区带离心介质的密度区带离心介质的密度小于小于样品中各种粒子的密度；样品中各种粒子的密度；等密度梯度离心介质密度等密度梯度离心介质密度大于大于样品各种粒子的密度。样品各种粒子的密度。 3 3、时间效应不同时间效应不同 速率速率区带离心区带离心不能长时间不能长时间离心离心；等；等密度梯度离心密度梯度离心长时长时间间离心将各种粒子停留在等密度位置形成区带。离心将各种粒子停留在等密度位置形成区带。区区带离心法带离心法样品的加入量：样品的加入

8、量：速率速率区带离心法区带离心法, ,离心管离心管( (直径为直径为1.1.0 0- -1 1.6.6cm) cm) 可加可加0.0.2 2- -0 0.5.5mlml左左右的样品量，直径为右的样品量，直径为2.52.5cmcm的离心管中加入的离心管中加入1.1.0 0- -2 2.0.0mlml的样品量。的样品量。等密度离心分离等密度离心分离 ：梯度的负载量，日常实验只能凭经验来判断。：梯度的负载量，日常实验只能凭经验来判断。有很好的分辨率，分离效果好，可一次获得较纯的颗有很好的分辨率，分离效果好，可一次获得较纯的颗粒，适用范围广。粒，适用范围广。离心时间长。需要制备梯度，操作严格不易掌握。

9、离心时间长。需要制备梯度，操作严格不易掌握。分离分离蛋白质，酶，激素，蛋白质，酶，激素，核糖体亚基，病毒，细胞核糖体亚基，病毒，细胞等。等。梯度介质成份应该是惰性的；梯度介质成份应该是惰性的； 梯度介质溶液的物理和化学特性应该知道；梯度介质溶液的物理和化学特性应该知道；梯度介质溶液不应该妨碍梯度中样品分离带梯度介质溶液不应该妨碍梯度中样品分离带 的检测；的检测；容易从梯度介质中分离出样品，而不会损失容易从梯度介质中分离出样品，而不会损失 样品或使样品失活；样品或使样品失活；在紫外光和可见光区无吸收；在紫外光和可见光区无吸收；可以灭菌处理；可以灭菌处理；成份纯，能买到，价格便宜，用后能回收。成份

10、纯，能买到，价格便宜，用后能回收。 + 很好，很好，+ 好，好，+可以，可以，不适用不适用梯度介质应用范围梯度介质应用范围A.A. 穿刺法穿刺法B.B. 虹吸法虹吸法C.C. 加压法加压法D.D. 切割法切割法E.E. 自动收集器自动收集器F.F. 层层吸收法层层吸收法梯度的制备梯度的制备1.从低浓度到高浓度铺液从低浓度到高浓度铺液（顶替法（顶替法 ） 2.从高浓度到低浓度铺液从高浓度到低浓度铺液 （直铺法）（直铺法） 将将增溶后离心得到的类囊体增溶后离心得到的类囊体膜膜（类囊体膜上存在着（类囊体膜上存在着PSI单体和三聚体，以三聚单体和三聚体，以三聚体为主。）体为主。）铺铺在在10%-30%不连续的蔗糖密度梯度上，蔗糖密度由上至下依次为不连续的蔗糖密度梯度上，蔗糖密度由上至下依次为10%，15%，20%，25%，30%。所配制的蔗糖成分中分别含。所配制的蔗糖成分中分别含Triton X-100为为0.05%（m/v）。）。4超速离心超速离心15h，160000g，转子为，转子为P40ST。 在在PSIPSI提取方法中，得不到较纯