第十一章：植物体细胞无性系变异

1、第十一章：植物体细胞无性系变异微生物：诱变育种、诱发遗传变异机理的 研究高等植物：20世纪70年代后，生物技术发展使得能利用离体培养的植物细胞，在 细胞水平上直接进行诱变和筛选。第一节：体细胞无性系变异的来源与特征一、体细胞无性变异的概念与应用一、体细胞无性变异的概念与应用体细胞无性系：是指一切由植物的体细胞再生的植株。经过组织培养循环出现的再生植株的变异称为体细胞无性变异（stmaclonal variation).体细胞无性变异的优点：诱变群体大，筛选方便；不受体细胞无性变异的优点：诱变群体大，筛选方便；不受季节限制效率高；试验重复性好，诱变条件可控；诱变季节限制效率高；试验重复性好，诱变

2、条件可控；诱变频率高变化幅度大；出现新的变异；在单细胞上进行避频率高变化幅度大；出现新的变异；在单细胞上进行避免出现嵌合体；可以拓宽种质资源、加快育种进程。免出现嵌合体；可以拓宽种质资源、加快育种进程。缺点：畸变率高、依赖于基因型、变异并不总是稳定和遗传。缺点：畸变率高、依赖于基因型、变异并不总是稳定和遗传。海雀稗体细胞耐寒突变体筛选海雀稗体细胞耐寒突变体筛选拓宽遗传资源，进行遗传改良拓宽遗传资源，进行遗传改良在山东省潍坊地区，海雀稗原始品种受冻害致死，耐寒突变体材料能安全越冬（绿化）。遗传学研究、发育生物学研究、生化代谢途径研究。遗传学研究、发育生物学研究、生化代谢途径研究。二、体细胞无性系

3、变异的来源及影响变异的主要因素二、体细胞无性系变异的来源及影响变异的主要因素外植体来源：外植体来源：离体培养诱导：离体培养诱导：嵌合体嵌合体存在于分化的细胞中存在于分化的细胞中嵌合体嵌合体。 3影响变异的主要因素：影响变异的主要因素：1. 1. 外植体的种类和基因型、染色体水平、生理状态、不同培养器官外植体的种类和基因型、染色体水平、生理状态、不同培养器官2. 2. 培养基的成分培养基的成分3. 3. 继代培养时间继代培养时间三、体细胞无性系变异的特征1. 普遍性和多样性2. 可遗传性不同植物都具有体细胞无性变异变异涉及到农艺性状、生化特征、抗病性和抗逆性、细胞遗传学和分子生物学方面的变异。可

4、以通过有性生殖传递给后代。外遗传（epigenetic): 性状的变异不是有DNA序列改变引起的植物表型变异，而是特定培养条件使某些基因表达调控发生变化所致，变异具有方向性，但不能通过有性生殖进行传递。体细胞变异的植物第二节：植物体细胞无性系变异机理第二节：植物体细胞无性系变异机理在培养植物细胞和再生植株中发现各种不同变异存在，其在培养植物细胞和再生植株中发现各种不同变异存在，其中有些是可以遗传的变异，被称为体细胞无性系变异。中有些是可以遗传的变异，被称为体细胞无性系变异。细胞水平的变异：细胞水平的变异：分子水平的变异分子水平的变异一、细胞无性系细胞水平的变异一、细胞无性系细胞水平的变异（一）

5、染色体数目变化（一）染色体数目变化整倍体变异：姊妹染色体分离与细胞分裂不同步。非整倍体变异：姊妹染色体进入相同的细胞。1. 1. 有丝分裂失败或进行无丝分裂有丝分裂失败或进行无丝分裂2. 2. 核内有丝分裂，染色体复制而细胞并不分裂核内有丝分裂，染色体复制而细胞并不分裂3. 3. 核内核内DNADNA复制而染色体并不复制，导致二分染色体和多复制而染色体并不复制，导致二分染色体和多线染色体的形成，二者恢复为正常染色体则也可能形成多线染色体的形成，二者恢复为正常染色体则也可能形成多倍体细胞。倍体细胞。4. 4. 有丝分裂时出现多极纺锤体，分裂完成后产生有丝分裂时出现多极纺锤体，分裂完成后产生3 3

6、个以上细胞。个以上细胞。细胞有丝分裂过程Plant CellAnimal Cell多倍体细胞的产生（二）染色体结构变化染色体断裂后经过修复和重新联结所形成的易位、倒位、缺失和重复是造成无性系变异的真正原因。二、分子水平的变化（一）核基因突变（一）核基因突变基因突变是指基因序列中碱基发生了改变，导致由一种遗传状态转变为另一种遗传状态。Brettell 等（1986）从645株玉米杂种胚培养的再生植株中发现了一个表现稳定的Adh1（乙醇脱氢酶）位点变异体。由单碱基突变引起的：编码106位的赖氨酸（AAG）突变为终止密码子（TAG）。（二）DNA总量和DNA重复序列拷贝数的变异在水稻中，用DNA重复

7、序列进行的研究发现，一些重复序列在组织培养中有显著的选择性扩增，愈伤组织的DNA重复序列与叶片相比有5-70倍的拷贝数差异，而不同品种叶子间的差异只有2-3倍。亚麻的卫星DNA小麦的rRNA(三）DNA甲基化有些植物细胞经过离体培养后，基因组中的碱基会发生某种化学修饰，如甲基化，从而影响基因的表达。一般来说甲基化的程度与基因的表达呈负相关。对对DNADNA甲基化，一般采用甲基化，一般采用CCGGCCGG位点的特异性限制内位点的特异性限制内切酶切酶Hpa II/Msp I Hpa II/Msp I 来进行研究。来进行研究。Hpa II Hpa II 识别并切割未识别并切割未甲基化的甲基化的CCG

8、GCCGG序列，但对甲基化的序列，但对甲基化的CGCG不起作用；不起作用；Msp I Msp I 识别并切割所有的识别并切割所有的CCGGCCGG序列。序列。（四）转座子（四）转座子（transposible elements) transposible elements) 的活化的活化能够进行自我复制、在染色体上能够进行随机插入的能够进行自我复制、在染色体上能够进行随机插入的DNADNA片段。片段。植物细胞组培过程中转座子可能被激活而发生转座和插入，引植物细胞组培过程中转座子可能被激活而发生转座和插入，引起体细胞无性变异。起体细胞无性变异。芭芭拉麦克林托克(McClintock B.，190

9、21992)“转座因子”的概念麦克林托克早在1938年就已提出直到1976年，在美国冷泉港召开的“DNA插入因子、质粒和游离基因”专题讨论会上，与会科学家才明确地承认可以用麦克林托克的术语“转座因子”1983年，瑞典皇家科学院诺贝尔奖金评定委员会终于把这一年度的诺贝尔生理学或医学奖授予了这位81岁高龄、不屈不挠的女科学家，麦克林托克也由此成为遗传学研究领域第一位独立获得诺贝尔奖的女科学家。决定被子植物花各个器官发育的基因共分为A、B、C三类。A类基因决定花的萼片和花瓣；B类基因决定花的花瓣和雄蕊；C类基因决定花的雄蕊和雌蕊。A A基因突变基因突变B B基因突变基因突变C C基因突变基因突变正常

10、拟南芥花正常拟南芥花A A类基因突变，形成了如右图的雌蕊类基因突变，形成了如右图的雌蕊 - - 雄蕊雄蕊 - - 雄蕊雄蕊 - - 雌蕊的异常花。雌蕊的异常花。B B类基因突变，形成如右图的萼片类基因突变，形成如右图的萼片 - - 萼片萼片 - - 雌蕊雌蕊 - - 雌蕊的异常花。雌蕊的异常花。C C类基因突变，形成如右图的萼片类基因突变，形成如右图的萼片 - - 花瓣花瓣 - - 萼片萼片 - - 花瓣的异常花。花瓣的异常花。（五）细胞质基因突变离体培养条件可以使一些植物线粒体离体培养条件可以使一些植物线粒体DNADNA环状构象和分子环状构象和分子结构发生变化，以及花药愈伤组织再生植株的叶绿

11、体基因结构发生变化，以及花药愈伤组织再生植株的叶绿体基因部分丢失。部分丢失。雄性不育烟草小麦白化苗（六）DNA多态性的变化RAPD(random amplified polymorphic DNA)即随机扩增多态性DNA标记，其基本原理与PCR技术一致。RAPD 技术是建立在PCR (Polymerase Chain Reaction)基础之上的一种可对整个未知序列的基因组进行多态性分析的分子技术。其以基因组DNA为模板, 以单个人工合成的随机多态核苷酸序列( 通常为10 个碱基对) 为引物,在热稳定的DNA 聚合酶( Taq 酶) 作用下, 进行PCR 扩增。扩增产物经琼脂糖或聚丙烯酰胺电泳

12、分离、溴化乙锭染色后,在紫外透视仪上检测多态性。扩增产物的多态性反映了基因组的多态性。RAPD 技术现已广泛的应用于生物的品种鉴定、系谱分析及进化关系的研究上植物细胞经过组培形成的愈伤组织往往存在RAPD. 说明DNA发生了组成的变化。第三节：细胞突变体的诱导和筛选植物的遗传改良、遗传研究和遗传资源的拓宽一、细胞突变体筛选的意义突变、重组10-4在细胞水平上可以通过选择压力，对培养细胞进行定向诱发突变，使突变体的筛选在细胞水平上进行，更为可控，诱变数量大，诱变几率高，重复性和稳定性好。抗病性、抗逆性、抗除草剂、抗氨基酸和氨基酸类似物突变体。抗病性、抗逆性、抗除草剂、抗氨基酸和氨基酸类似物突变体

13、。二、细胞突变体筛选的原理筛选的原理建立在有区别地杀死正常型细胞的基础上。筛选的原理建立在有区别地杀死正常型细胞的基础上。正筛选法、负筛选法、正筛选法、负筛选法、“绿岛绿岛”法法（一）筛选原理（一）筛选原理1. 1. 正筛选法正筛选法 把细胞群体置于某种选择剂或选择条件下，细胞突把细胞群体置于某种选择剂或选择条件下，细胞突变体可以正常生长，正常型细胞不能生存而死亡，从而达到分离变体可以正常生长，正常型细胞不能生存而死亡，从而达到分离目的的一种选择方法。目的的一种选择方法。一步筛选法：筛选单基因突变细胞多步筛选法：筛选多基因突变细胞2. 2. 负筛选法负筛选法先控制培养基营养成分，使正常型细胞生

14、长，而突变的细胞处于抑先控制培养基营养成分，使正常型细胞生长，而突变的细胞处于抑制不分裂状态，然后用一种能毒害细胞生长而对不分裂细胞无害的制不分裂状态，然后用一种能毒害细胞生长而对不分裂细胞无害的药物淘汰正常细胞。药物淘汰正常细胞。亚砷酸盐、某些核苷酸类似物营养缺陷性突变体3.3.“绿岛绿岛”法法在整体的植株水平上，用某在整体的植株水平上，用某种化学物质作用于植株叶片，种化学物质作用于植株叶片，使细胞发生突变，叶片局部使细胞发生突变，叶片局部呈现绿色斑点，切下这部分呈现绿色斑点，切下这部分细胞进行组织培养，通过培细胞进行组织培养，通过培养细胞的再分化，使抗性细养细胞的再分化，使抗性细胞分化成完

15、整植株。胞分化成完整植株。（二）一般筛选程序（二）一般筛选程序1. 1. 确定选择剂的浓度确定选择剂的浓度 使90%以上培养物致死2. 2. 致死浓度筛选致死浓度筛选3. 3. 逐步筛选逐步筛选三、细胞突变体的筛选与利用三、细胞突变体的筛选与利用（一）富含氨基酸和氨基酸类似物细胞突变体（一）富含氨基酸和氨基酸类似物细胞突变体大豆缺失甲硫氨酸、玉米缺失赖氨酸和色氨酸、小麦缺失赖氨大豆缺失甲硫氨酸、玉米缺失赖氨酸和色氨酸、小麦缺失赖氨酸和苏氨酸、水稻缺失赖氨酸。酸和苏氨酸、水稻缺失赖氨酸。通过采用氨基酸和氨基酸类似物选择抗性细胞突变体，达到改通过采用氨基酸和氨基酸类似物选择抗性细胞突变体，达到改良

16、人类食物营养品质需要的目的。良人类食物营养品质需要的目的。高浓度的氨基酸或氨基酸类似物可以通过反馈性抑制与高浓度的氨基酸或氨基酸类似物可以通过反馈性抑制与氨基酸生物合成的关键酶作用，而抑制植物细胞的正常氨基酸生物合成的关键酶作用，而抑制植物细胞的正常生长。生长。高赖氨酸玉米、高甲硫氨酸沙打旺、芦笋等。（二）抗病细胞突变体（二）抗病细胞突变体在离体条件下直接以毒素为选择压力筛选抗病细胞突变体，由这些在离体条件下直接以毒素为选择压力筛选抗病细胞突变体，由这些突变细胞进一步再生出抗病植株。突变细胞进一步再生出抗病植株。马铃薯晚疫病马铃薯晚疫病烟草野火病烟草野火病（三）抗除草剂细胞突变体（三）抗除草剂细胞突变体用含除草剂的培养基进行筛选。用含除草剂的培养基进行筛选。（四）抗逆细胞突变体（四）抗逆细胞突变体耐盐、耐高温、低温、耐干旱、耐重金属。耐盐、耐高温、低温、耐干旱、耐重金属。（五）单倍体细胞突变体（五）单倍体细胞突变体（六）其他性状的选择（六）其他性状的选择高产、品质好、生长势强等优良性状。高产、品质好