组织培养第十二章

1、第十二章第十二章 种质离体保存种质离体保存超低温保存超低温保存种质保存种质保存低温保存低温保存主要内容主要内容 种质种质是指亲代通过生殖细胞或体细胞传递给是指亲代通过生殖细胞或体细胞传递给子代的遗传物质。子代的遗传物质。 种质保存（种质保存（germ plasm conservation）：）：指指利用天然或人工创造的适宜环境来保存种质资源，利用天然或人工创造的适宜环境来保存种质资源，使个体中所含有的遗传物质保存其遗传完整性使个体中所含有的遗传物质保存其遗传完整性（genetic integrity），有高的活力（），有高的活力（vigor），能），能通过繁殖将其遗传特性传递下去。通过繁殖将其

2、遗传特性传递下去。 传统保存方法有种子保存和种植保存。传统保存方法有种子保存和种植保存。 种质保存方式：种质保存方式：原地保存和异地保存。原地保存和异地保存。 前者通过建立自然保护区和天然公园里实现，前者通过建立自然保护区和天然公园里实现，后者通过植物园、种质园、种子库及离体保存来后者通过植物园、种质园、种子库及离体保存来实现。实现。 具有世界先进水具有世界先进水平的国家种质资平的国家种质资源库源库国家种质资源库内景一角国家种质资源库内景一角国家国家种质种质资源资源库内库内景景保存对象：保存对象：凡能通过种子繁殖维持物种凡能通过种子繁殖维持物种遗传完整性的各类植物种质资源，都可遗传完整性的各类

3、植物种质资源，都可保存到国家种质库，其种子应是耐低温保存到国家种质库，其种子应是耐低温和耐干燥类型，即正常型种子和耐干燥类型，即正常型种子（orthodox seedsorthodox seeds）。）。 江苏镇江桑树圃江苏镇江桑树圃呼和浩特牧草圃呼和浩特牧草圃浙江杭州茶树圃浙江杭州茶树圃国国 家家 种种 质质 圃圃（包括试管苗库）（包括试管苗库）中国野生苎麻种质中国野生苎麻种质基因库在江西建成基因库在江西建成两位市民在江西宜春市中国两位市民在江西宜春市中国野生苎麻种质基因库参观野生苎麻种质基因库参观。 种子保存的优点种子保存的优点 占用空间小；占用空间小； 可以保存多年；可以保存多年； 种子

4、容易干燥和包装，便于运送种子容易干燥和包装，便于运送到引种中心和基因库到引种中心和基因库种子保存的缺点种子保存的缺点 1）随着贮存时间的延长，种子的生活力逐）随着贮存时间的延长，种子的生活力逐渐下降，并常常受到病虫害的侵袭；渐下降，并常常受到病虫害的侵袭； 2）种子一般都是杂合体，繁殖中性状会分）种子一般都是杂合体，繁殖中性状会分离而不稳定，因而除了无融合生殖物种以离而不稳定，因而除了无融合生殖物种以外，难以保存各种来源不同的无性系；外，难以保存各种来源不同的无性系； 3）不适用于营养繁殖作物；）不适用于营养繁殖作物； 4）在苗圃或田间大量保存各种植物基因型，）在苗圃或田间大量保存各种植物基因

5、型，不但成本极高，而且还有受到天灾毁灭的不但成本极高，而且还有受到天灾毁灭的危险。危险。 离体保存：离体保存：将组织和细胞培养中将组织和细胞培养中的外植体或试管苗贮存在使其抑制生的外植体或试管苗贮存在使其抑制生长，缓慢生长或无生长的条件下，达长，缓慢生长或无生长的条件下，达到长期保存的方法。到长期保存的方法。 离体保存的优点：离体保存的优点： 1、解决一些无性繁殖作物种质资源在低温下长、解决一些无性繁殖作物种质资源在低温下长期保存问题，可有效避免资源的丢失。期保存问题，可有效避免资源的丢失。 2、节省土地和劳动力，保存方法简单，花费少，、节省土地和劳动力，保存方法简单，花费少，且能在保存中脱毒

6、。且能在保存中脱毒。 3、在提供利用时，可快速繁殖，也有利于国际、在提供利用时，可快速繁殖，也有利于国际国内种质交换。国内种质交换。 离体保存的一个基本要求是把继代的次数减离体保存的一个基本要求是把继代的次数减少到最低限度。少到最低限度。一、超低温保存一、超低温保存 超低温保存（超低温保存（ultra-low temperature）：）：一般是一般是-196（液氮）的超低温下使保存（液氮）的超低温下使保存的活细胞的物质代谢和生长活动几乎完全的活细胞的物质代谢和生长活动几乎完全停止，在适宜的条件下可迅速繁殖，生出停止，在适宜的条件下可迅速繁殖，生出新的植株，并保持原来的遗传特性。新的植株，并保

7、持原来的遗传特性。1.植物超低温保存的概念及意义植物超低温保存的概念及意义 优点：优点： 1）长期保持种质遗传性的稳定；长期保持种质遗传性的稳定； 2）保持培养细胞形态发生的能力；保持培养细胞形态发生的能力； 3）保存稀有珍贵及濒危植物的种质资源；保存稀有珍贵及濒危植物的种质资源； 4）保存不稳定性的培养物，如单细胞；保存不稳定性的培养物，如单细胞； 5）长期贮存去病毒的种质；长期贮存去病毒的种质； 6）防止种质衰老；防止种质衰老； 7）延长花粉寿命，解决不同开花期和延长花粉寿命，解决不同开花期和异地植物杂交上的困难；异地植物杂交上的困难； 8）便于国际间的种质交换；便于国际间的种质交换； 9

8、）经过超低温保存后的再生植株，有经过超低温保存后的再生植株，有可能产生高抗寒性的新材料；可能产生高抗寒性的新材料； 10）用于超低温保存的设备较简单，不用于超低温保存的设备较简单，不需要大量的基本建设投资需要大量的基本建设投资2.超低温保存的原理超低温保存的原理 超低温保存时，超低温保存时，降温冷冻降温冷冻和和化冻化冻过过程最易引起植物材料的伤害。程最易引起植物材料的伤害。 在降温冷冻过程中，植物遭受冻害在降温冷冻过程中，植物遭受冻害的原因：的原因：1）细胞内部结冰；细胞内部结冰；2）细胞内细胞内溶质的浓缩。溶质的浓缩。 因此在降温冷冻过程中创造适宜的因此在降温冷冻过程中创造适宜的条件，使植物

9、材料发生保护性脱水。条件，使植物材料发生保护性脱水。 1）在溶液中产生强烈的水合作用，提高溶液的）在溶液中产生强烈的水合作用，提高溶液的黏滞性，从而可在温度下降的同时降低冰晶形成黏滞性，从而可在温度下降的同时降低冰晶形成和增长的速度；和增长的速度； 2）增加细胞膜透性，加速细胞内的水流到细胞）增加细胞膜透性，加速细胞内的水流到细胞外结冰，从而防止细胞内结冰的伤害；外结冰，从而防止细胞内结冰的伤害； 3）在冷冻过程中减少冰的形成，从而减少组织）在冷冻过程中减少冰的形成，从而减少组织内溶质数量的迅速升高。内溶质数量的迅速升高。 4）糖类物质（如海藻糖）对膜也具有一定的保）糖类物质（如海藻糖）对膜也

10、具有一定的保护作用。护作用。防冻剂在低温下对植物起保护作用的原因防冻剂在低温下对植物起保护作用的原因 一种防冻剂难以同时具备所有防冻特一种防冻剂难以同时具备所有防冻特性，在实践中往往采用多种防冻剂配合性，在实践中往往采用多种防冻剂配合使用，以便取得更好的效果。使用，以便取得更好的效果。 化冻时还要防止细胞内次生结冰，多化冻时还要防止细胞内次生结冰，多数情况下采用快速化冻方法，即在数情况下采用快速化冻方法，即在3440温水浴中化冻。温水浴中化冻。3.超低温保存主要设备和基本操作程序超低温保存主要设备和基本操作程序 主要仪器设备：主要仪器设备：1）用于细胞和组织培养的）用于细胞和组织培养的全套设备

11、；全套设备；2）普通冰箱；）普通冰箱；3）-70 ，-20 低低温冰箱；温冰箱；4）程序降温仪；）程序降温仪；5）盛装材料的玻璃或）盛装材料的玻璃或塑料试管，且封盖严密；塑料试管，且封盖严密；6）液氮罐；）液氮罐；7）光学显）光学显微镜和分光光度计，紫外荧光显微镜。微镜和分光光度计，紫外荧光显微镜。超低温保存的主要环节超低温保存的主要环节 材料的准备材料的准备（选择适宜年龄与生长状态的植物器官、组（选择适宜年龄与生长状态的植物器官、组织、细胞和原生质体等）织、细胞和原生质体等） 预处理预处理（加速继代、提高培养基渗透压、低温锻炼、（加速继代、提高培养基渗透压、低温锻炼、ABAABA处理等）处理

12、等） 加入冷冻保护剂（加入冷冻保护剂（0 0左右或室温左右或室温） 干燥法干燥法 缓慢降温法缓慢降温法 两步降温法两步降温法 快冻法快冻法 逐级降温法逐级降温法 包埋脱水法包埋脱水法 种质保存（种质保存（-196-196） 快速解冻（快速解冻（34 34 40 40）、洗涤）、洗涤 再培养（细胞生长、植株再生、遗传稳定性鉴定）再培养（细胞生长、植株再生、遗传稳定性鉴定）（1）冰冻保护剂）冰冻保护剂 渗透型抗冻剂：渗透型抗冻剂：二甲亚砜（二甲亚砜（DMSO）、乙二）、乙二醇、乙酰胺、丙二醇、甘油。醇、乙酰胺、丙二醇、甘油。 特点：特点：多属低分子中性物质，在溶液中易结多属低分子中性物质，在溶液中

13、易结合水分子，发生水合作用，使溶液的的粘性增合水分子，发生水合作用，使溶液的的粘性增加而减少水的结晶过程，达到保护的目的。加而减少水的结晶过程，达到保护的目的。 非渗透型抗冻剂：非渗透型抗冻剂：聚乙烯吡咯烷酮（聚乙烯吡咯烷酮（pvp）、）、蔗糖、葡聚糖、聚乙二醇等为非渗透型抗冻剂蔗糖、葡聚糖、聚乙二醇等为非渗透型抗冻剂 特点：特点：可溶于水，但不能进入细胞，可在特定可溶于水，但不能进入细胞，可在特定的温度下降低溶质（电解质）浓度，从而起到的温度下降低溶质（电解质）浓度，从而起到保护作用。保护作用。（2）保存液）保存液组成部分：组成部分：电解质平衡盐溶液电解质平衡盐溶液 高渗溶液：高渗溶液：选用

14、葡萄糖、甘露醇、蔗选用葡萄糖、甘露醇、蔗糖等作为高渗剂。糖等作为高渗剂。 营养液：营养液：氨基酸、核甘类、葡萄糖。氨基酸、核甘类、葡萄糖。 （3）材料的预备和预处理）材料的预备和预处理材料的生长状态和年龄的选择材料的生长状态和年龄的选择培养细胞处于旺盛的对数分裂期培养细胞处于旺盛的对数分裂期液体悬浮培养细胞以液体悬浮培养细胞以57天天 抗冻能力强，抗冻能力强，固体培养的愈伤组织以固体培养的愈伤组织以912天为宜天为宜 存活率高存活率高野外生长的植物的芽（冬天低温锻炼）野外生长的植物的芽（冬天低温锻炼）预培养：预培养：在冰冻保存前的预培养中加入提在冰冻保存前的预培养中加入提高抗寒力的物质如：梨糖

15、醇、脱落酸等，或高抗寒力的物质如：梨糖醇、脱落酸等，或将培养基的糖浓度提高，这样可以提高存活将培养基的糖浓度提高，这样可以提高存活率。率。冰冻保护剂：冰冻保护剂：由于一些冰冻保护剂的成分由于一些冰冻保护剂的成分有毒性，冰冻保护剂预处理必须在有毒性，冰冻保护剂预处理必须在0 下进下进行处理时间不能太长，一般不超过行处理时间不能太长，一般不超过1h。4.超低温保存材料的类型超低温保存材料的类型1）芽及茎尖分生组织）芽及茎尖分生组织 芽的超低温保存是保存无性繁殖植物芽的超低温保存是保存无性繁殖植物种质的简便途径。种质的简便途径。 分生组织作为超低温保存的材料的优越性：分生组织作为超低温保存的材料的优

16、越性： A.在某些情况下，愈伤组织很难再生完整植在某些情况下，愈伤组织很难再生完整植株，而分生组织相对会容易很多；株，而分生组织相对会容易很多； B.分生组织遗传上更稳定；分生组织遗传上更稳定； C.更快的营养繁殖方式；更快的营养繁殖方式； D.产生无病植株；产生无病植株； E.细胞培养物一般需要控制冷冻速度，而分细胞培养物一般需要控制冷冻速度，而分生组织则可经受突然的冷冻。生组织则可经受突然的冷冻。2）幼胚及胚状体）幼胚及胚状体 A.顽拗型种子由于对温度及湿度极其敏感，常导顽拗型种子由于对温度及湿度极其敏感，常导致胚的退化，因而无法长期保存。而通过分离出致胚的退化，因而无法长期保存。而通过分

17、离出胚或片段进行低温保存，是解决这一难题的有效胚或片段进行低温保存，是解决这一难题的有效途径。途径。 B.体细胞胚能迅速大量繁殖，是人工种子的核心，体细胞胚能迅速大量繁殖，是人工种子的核心，它的超低温保存为人工种子的长期保存奠定了基它的超低温保存为人工种子的长期保存奠定了基础。础。 C.不亲和种的杂种胚常在早期败育，因此可不亲和种的杂种胚常在早期败育，因此可切下幼胚，进行超低温保存，在需要时解冻切下幼胚，进行超低温保存，在需要时解冻培养。培养。 D.单倍体细胞极不稳定，短期内就可转变为单倍体细胞极不稳定，短期内就可转变为二倍体，通过花粉胚的超低温保存可维持其二倍体，通过花粉胚的超低温保存可维持

18、其稳定性。稳定性。3）悬浮培养细胞及愈伤组织）悬浮培养细胞及愈伤组织 冷冻材料应选取处于指数生长期的细胞；冷冻材料应选取处于指数生长期的细胞； 加入冷冻保护剂前，可先对材料进行预培加入冷冻保护剂前，可先对材料进行预培养以提高其抗寒力；养以提高其抗寒力； 适当的保护剂及浓度是成功的关键；适当的保护剂及浓度是成功的关键； 冷冻后必须快速化冻；冷冻后必须快速化冻； 解冻后，为防止渗透冲击对细胞造成的伤解冻后，为防止渗透冲击对细胞造成的伤害，可用缓慢扩散的方法除去保护剂；害，可用缓慢扩散的方法除去保护剂； 在细胞转入正常培养条件下恢复生长之前，在细胞转入正常培养条件下恢复生长之前，常需在半固体培养基上

19、培养一周或二周；常需在半固体培养基上培养一周或二周； 恢复生长所用的培养基成分需做适当改变。恢复生长所用的培养基成分需做适当改变。4）原生质体）原生质体 没有细胞壁，排除了冷冻期间细胞中产生的没有细胞壁，排除了冷冻期间细胞中产生的张力，所以受伤害较少，同时能筛选抗逆性强，张力，所以受伤害较少，同时能筛选抗逆性强，生长处于优势的细胞系。生长处于优势的细胞系。 同时操作复杂，技术难度大，限制了应用。同时操作复杂，技术难度大，限制了应用。5）花粉）花粉 可延长花粉寿命，解决花期不遇和异可延长花粉寿命，解决花期不遇和异地植物杂交困难等问题，建立起花粉种地植物杂交困难等问题，建立起花粉种质库，为国际间的

20、种质交换提供便利。质库，为国际间的种质交换提供便利。5.超低温保存的方法与技术超低温保存的方法与技术 1）常规超低温保存）常规超低温保存 2）玻璃化法超低温保存）玻璃化法超低温保存 3）包埋脱水法超低温保存）包埋脱水法超低温保存 4）干燥冷冻法超低温保存）干燥冷冻法超低温保存 5）其他方法）其他方法1）常规超低温保存）常规超低温保存 （1）预培养和低温处理提高组织细胞）预培养和低温处理提高组织细胞的抗寒力。的抗寒力。 （2）冷冻保护剂处理：将保护剂预冷）冷冻保护剂处理：将保护剂预冷至至0 ，等体积与培养基混合，静置，等体积与培养基混合，静置303060min。 （3）降温冷冻）降温冷冻 A.快

21、速冷冻法：快速冷冻法： 适用于培养物细胞体能小，胞质浓、适用于培养物细胞体能小，胞质浓、含水量低、液泡化程度低的材料。将植物含水量低、液泡化程度低的材料。将植物材料从材料从0或其他预处理温度直接投入液氮或其他预处理温度直接投入液氮罐中，降温速度为罐中，降温速度为1000/min以上。这种以上。这种快速降温可使细胞内的水在迅速越过快速降温可使细胞内的水在迅速越过-140这一冰晶形成的危险温度期后，细胞这一冰晶形成的危险温度期后，细胞内的水形成内的水形成“玻璃化玻璃化”状态，不会对细胞状态，不会对细胞产生破坏作用。产生破坏作用。 B.慢速冷冻法：慢速冷冻法： 适用于含有大液泡的成熟细胞，这适用于含

22、有大液泡的成熟细胞，这种细胞含水量高，在慢速降温过程中，种细胞含水量高，在慢速降温过程中，可以使细胞内的水有充足的时间不断地可以使细胞内的水有充足的时间不断地渗到细胞外结冰而避免在细胞内结冰。渗到细胞外结冰而避免在细胞内结冰。 将植物材料以将植物材料以0.110/min的降温的降温速度从速度从0降到降到-100左右，而后立即浸左右，而后立即浸入液氮罐中或以同样的速度连续降温至入液氮罐中或以同样的速度连续降温至-196。 C.2步冷冻法：步冷冻法： 第第1步用慢速降温法降到步用慢速降温法降到-50-30，使，使细胞达到保护性脱水状态；第细胞达到保护性脱水状态；第2 2步投入液氮步投入液氮中迅速冷

23、冻。中迅速冷冻。 D.逐级冷冻法：逐级冷冻法： 保存材料经冷冻保护剂在保存材料经冷冻保护剂在0预处理后，预处理后，逐步通过不同的温度，样品在每级温度上逐步通过不同的温度，样品在每级温度上停留一定时间（停留一定时间（4 46min），然后浸入液氮。），然后浸入液氮。 化冻操作化冻操作快速化冻：快速化冻：在在35354040温水中化冻温水中化冻慢速化冻：慢速化冻：在在0 0，2 23 3或室温下进行化冻或室温下进行化冻注意事项：注意事项：1、操作轻，避免组织和细胞的机械损伤、操作轻，避免组织和细胞的机械损伤2、将冰冻样品试管插入温水浴中时，注意避、将冰冻样品试管插入温水浴中时，注意避免管口污染；免

24、管口污染；3、试管内的冰一旦化冻后，要立即将试管移、试管内的冰一旦化冻后，要立即将试管移到到20- -25的水浴中，并立即迅速进行洗涤和再培的水浴中，并立即迅速进行洗涤和再培养。养。 2）玻璃化法超低温保存）玻璃化法超低温保存 （1）玻璃化法保存的原理）玻璃化法保存的原理 玻璃化法：生物材料经高浓度玻璃化玻璃化法：生物材料经高浓度玻璃化保护剂处理后，快速投入液氮保存，保护剂处理后，快速投入液氮保存，使保护剂和细胞内水分来不及形成冰使保护剂和细胞内水分来不及形成冰晶或冰晶没有足够的时间生长，从而晶或冰晶没有足够的时间生长，从而进入一种人工的完全玻璃化状态。进入一种人工的完全玻璃化状态。（2）玻璃

25、化的特点）玻璃化的特点 部分玻璃化：胞内玻璃化部分玻璃化：胞内玻璃化 完全玻璃化：受高浓度保护剂作用后完全玻璃化：受高浓度保护剂作用后的细胞连同保护剂本身在快速降温中的细胞连同保护剂本身在快速降温中都进入玻璃化。都进入玻璃化。（3）玻璃化法的基本）玻璃化法的基本环节及技术要点环节及技术要点 预培养和低温锻炼预培养和低温锻炼保护剂加前过保护剂加前过渡或逐级添加渡或逐级添加保护剂成分及保护剂保护剂成分及保护剂处理时间和温度处理时间和温度被冻体积、降温方被冻体积、降温方式式化冻和洗涤化冻和洗涤活性检测和恢复培活性检测和恢复培养。养。 玻璃化法因材料不同略有差异。保玻璃化法因材料不同略有差异。保护剂的

26、毒性及渗透损伤程度与保护剂护剂的毒性及渗透损伤程度与保护剂的浓度及处理时间和温度有关。化冻的浓度及处理时间和温度有关。化冻后的洗涤非常重要。后的洗涤非常重要。3）包埋脱水法超低温保存）包埋脱水法超低温保存（1）包埋脱水法（）包埋脱水法（encapsulation-dehydration method）原理）原理 包埋脱水法：将包含有样品的褐藻酸包埋脱水法：将包含有样品的褐藻酸钠溶液滴向高钙溶液，因褐藻酸钙的钠溶液滴向高钙溶液，因褐藻酸钙的生成而固化成球状颗粒，同时辅以高生成而固化成球状颗粒，同时辅以高浓度蔗糖预处理样品，使样品获得高浓度蔗糖预处理样品，使样品获得高的抗冻力和抗脱水力后，结合适当

27、的的抗冻力和抗脱水力后，结合适当的脱水和降温方式，液氮下保存。脱水和降温方式，液氮下保存。 玻璃化法采用高浓度的复合玻璃化玻璃化法采用高浓度的复合玻璃化保护剂脱水样品，减轻了两步法保存保护剂脱水样品，减轻了两步法保存过程中的机械损伤和溶液效应；而包过程中的机械损伤和溶液效应；而包埋脱水法采用高浓度蔗糖预处理样品，埋脱水法采用高浓度蔗糖预处理样品，避免二甲基亚砜和甘油的化学毒性。避免二甲基亚砜和甘油的化学毒性。 蔗糖可能是通过水替代作用保护质蔗糖可能是通过水替代作用保护质膜完整性和蛋白质构型。其目的是提膜完整性和蛋白质构型。其目的是提高胞质浓度，即使样品获得高的抗冻高胞质浓度，即使样品获得高的抗

28、冻力和抗脱水力，有不至于引起样品太力和抗脱水力，有不至于引起样品太多的高渗损伤，促进降温过程中玻璃多的高渗损伤，促进降温过程中玻璃化的形成。化的形成。（2）包埋脱水法的优点）包埋脱水法的优点 不需要昂贵、复杂的降温设备，降不需要昂贵、复杂的降温设备，降温过程不甚严格；同时避免了玻璃化温过程不甚严格；同时避免了玻璃化法中二甲基亚砜等高浓度保护剂对材法中二甲基亚砜等高浓度保护剂对材料可能造成的损害；样品易于操作，料可能造成的损害；样品易于操作，被保存样品体积可以比较大；样品可被保存样品体积可以比较大；样品可获得较高的抗冻力，提高保存效果，获得较高的抗冻力，提高保存效果，使保存后的样品不经愈伤组织直

29、接成使保存后的样品不经愈伤组织直接成苗，降低了遗传变异的可能。苗，降低了遗传变异的可能。（3）包埋脱水法的主）包埋脱水法的主要环节及技术要点要环节及技术要点 A.包埋方法：样品先用高浓度蔗糖预包埋方法：样品先用高浓度蔗糖预培养后再包埋，或者包埋后用高浓度培养后再包埋，或者包埋后用高浓度蔗糖培养处理。蔗糖培养处理。 B.褐藻酸钠和蔗糖的浓度及处理时间：褐藻酸钠和蔗糖的浓度及处理时间：常用褐藻酸钠常用褐藻酸钠3%，氯化钙浓度，氯化钙浓度100mmol/L，保证固化完成的维持时间，保证固化完成的维持时间30min。包埋脱水法保存时蔗糖浓度一。包埋脱水法保存时蔗糖浓度一般为般为0.30.75mol/L

30、，其中，其中0.75mol/L更更常用。常用。 C.保存前脱水：包埋后的样品在保存保存前脱水：包埋后的样品在保存前绝大多数采用干燥空气脱水，也有前绝大多数采用干燥空气脱水，也有将包埋后蔗糖预处理的样品用二步法将包埋后蔗糖预处理的样品用二步法或玻璃化法做进一步的脱水保存。或玻璃化法做进一步的脱水保存。 D.再培养：一般不必除去褐藻酸钙等再培养：一般不必除去褐藻酸钙等包裹物，直接将其接种在固体培养基包裹物，直接将其接种在固体培养基上恢复生长即可。上恢复生长即可。4）干燥冷冻法超低温保存）干燥冷冻法超低温保存（1）干燥冷冻法（）干燥冷冻法（dissication freezing method）原理

31、及优点）原理及优点 一般是将植物材料经无菌风、真空、硅一般是将植物材料经无菌风、真空、硅胶或赶浓度蔗糖等进行干燥预处理，适度胶或赶浓度蔗糖等进行干燥预处理，适度脱水，通过控制脱水速度和脱水程度以增脱水，通过控制脱水速度和脱水程度以增强植物的抗冻性，然后液氮保存。强植物的抗冻性，然后液氮保存。 干燥冷冻法不需要昂贵的仪器设备，操干燥冷冻法不需要昂贵的仪器设备，操作简便，因此是一种切实可行的超低温保作简便，因此是一种切实可行的超低温保存方法。存方法。（2）干燥冷冻法的关）干燥冷冻法的关键环节及技术键环节及技术 A.直接干燥脱水：不以任何冷冻保护直接干燥脱水：不以任何冷冻保护剂处理，直接在层流橱（剂

32、处理，直接在层流橱（laminar flow cabinet）等无菌空气流、真空等干燥）等无菌空气流、真空等干燥脱水。脱水。 B.高浓度蔗糖预处理：关键是保存不高浓度蔗糖预处理：关键是保存不同种质培养基的蔗糖浓度及处理时间。同种质培养基的蔗糖浓度及处理时间。 C.高浓度蔗糖预处理，再用无菌空气高浓度蔗糖预处理，再用无菌空气或硅胶等干燥脱水。或硅胶等干燥脱水。5）其他方法）其他方法 热振动（热振动（37 处理处理2h） 超低温冰箱（超低温冰箱（-150 ）中保存）中保存至少至少1个月个月 家用冰箱（家用冰箱（-20 ）中预处理）中预处理24h6.冻后细胞活力、存活冻后细胞活力、存活率及遗传性检测

33、率及遗传性检测 超低温保存植物种质，目的是超低温保存植物种质，目的是要长期保持植物具有高的活力，要长期保持植物具有高的活力，存活率及遗传完整性，能通过繁存活率及遗传完整性，能通过繁殖将其遗传特性传递下去。殖将其遗传特性传递下去。1）TTC法（氯化三苯基四氮唑）法（氯化三苯基四氮唑） A.0.05mol/L磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液，pH7.5； B.TTC溶液；溶液； C.称取称取100200mg化冻洗涤后的样品，加入化冻洗涤后的样品，加入3mlTTC溶液。溶液。 D.22 培育反应培育反应1218h； E.吸去吸去TTC，用蒸馏水洗涤；，用蒸馏水洗涤； F.收集细胞加入收集细胞加入95%酒精

34、酒精3ml，60水浴水浴10min10min，抽提酶活性反应产物；抽提酶活性反应产物； G.G.冷却后冷却后95%95%酒精定容到酒精定容到3ml； H.摇匀，用分光光度计测吸收值；摇匀，用分光光度计测吸收值； I.与对照材料相比较。与对照材料相比较。2）FDA染色法（二醋染色法（二醋酸酯荧光素染色法）酸酯荧光素染色法） FDA本身不发光，只有当它渗入本身不发光，只有当它渗入活细胞内后，通过酯酶的脱脂化作活细胞内后，通过酯酶的脱脂化作用生成荧光素，该荧光素在紫外光用生成荧光素，该荧光素在紫外光的激发下才产生荧光。因此，它可的激发下才产生荧光。因此，它可以作为活细胞的一种鉴定方法。以作为活细胞的

35、一种鉴定方法。方法方法 往载玻片上滴一滴化冻后的细胞往载玻片上滴一滴化冻后的细胞悬浮液，然后滴悬浮液，然后滴1滴滴FDA溶液与之溶液与之混合。静置混合。静置510min后，盖上盖玻后，盖上盖玻片，放于紫外光荧光显微镜下观察。片，放于紫外光荧光显微镜下观察。3）色谱分析法）色谱分析法 通过色谱来分析冷冻组织产生通过色谱来分析冷冻组织产生的挥发性碳氢化合物，并且不破的挥发性碳氢化合物，并且不破坏材料。坏材料。4）再培养）再培养 细胞的再生长是最终检验细胞活力细胞的再生长是最终检验细胞活力的唯一可靠方法。的唯一可靠方法。 化冻和洗涤后，立即将保存材料转化冻和洗涤后，立即将保存材料转移到新鲜培养基上进

36、行再培养。在再移到新鲜培养基上进行再培养。在再培养过程中，观测组织的复活情况、培养过程中，观测组织的复活情况、存活率、生长速度、组织块大小和重存活率、生长速度、组织块大小和重量的变化，以及分化产生植株的能力量的变化，以及分化产生植株的能力和各种遗传性状的表达。和各种遗传性状的表达。 存活率存活率=重新生长细胞（或器官）数重新生长细胞（或器官）数目目/解冻的细胞（或器官）数目解冻的细胞（或器官）数目 100% 在培养初期一般有在培养初期一般有1个生长停滞期。个生长停滞期。停滞期的长短可能取决于损伤程度，停滞期的长短可能取决于损伤程度，也可能与植物基因型有关。有两个因也可能与植物基因型有关。有两个

37、因素可以导致停滞期的产生：一是修复素可以导致停滞期的产生：一是修复损伤；二是一些抑制生长的物质作用。损伤；二是一些抑制生长的物质作用。5）细胞学变化）细胞学变化 在恢复过程中，对细胞学的变化及在恢复过程中，对细胞学的变化及恢复可能性的认识有助于提高存活率。恢复可能性的认识有助于提高存活率。 变化：变化：A.线粒体、质体膨胀；线粒体、质体膨胀；B.高尔高尔基体膨胀；基体膨胀；C.内质网和核膜分离；内质网和核膜分离；D.多核糖体解体。多核糖体解体。 许多细胞学变化遇合适条件可许多细胞学变化遇合适条件可以恢复，因此解冻或洗涤后的处以恢复，因此解冻或洗涤后的处理不应忽视。理不应忽视。6）生化稳定性）生

38、化稳定性 很多培养物，尤其是悬浮细胞很多培养物，尤其是悬浮细胞和愈伤组织，既有重要和特殊的和愈伤组织，既有重要和特殊的生化合成能力。冷冻保存后是否生化合成能力。冷冻保存后是否保持这种能力，也是衡量贮藏成保持这种能力，也是衡量贮藏成败的重要指标。败的重要指标。7）遗传性分析）遗传性分析 A.细胞全能性的保存，形态发生能力的表细胞全能性的保存，形态发生能力的表达情况；达情况； B.对保存材料的形态特征及生长发育的观对保存材料的形态特征及生长发育的观察；察； C.后代染色体结构和数目的分析；后代染色体结构和数目的分析； D.蛋白质和同工酶谱的分析；蛋白质和同工酶谱的分析； E.细胞特异产物的分析；细

39、胞特异产物的分析； F.抗逆性的分析；抗逆性的分析； G.借助分子标记技术进行遗传稳定性鉴定。借助分子标记技术进行遗传稳定性鉴定。7.提高冷冻后细胞或组提高冷冻后细胞或组织存活率的方法织存活率的方法 液氮的稳定供应、不同物种和不同液氮的稳定供应、不同物种和不同种类材料种质、细胞、组织和器官等种类材料种质、细胞、组织和器官等耐脱水能力不同、冷冻过程中如何防耐脱水能力不同、冷冻过程中如何防止冰晶的形成、理想的冷冻保护剂组止冰晶的形成、理想的冷冻保护剂组分及浓度、保存材料冷冻前及冷冻后分及浓度、保存材料冷冻前及冷冻后的遗传稳定性及保存后的再生能力。的遗传稳定性及保存后的再生能力。1）材料的选择）材料

40、的选择 超低温保存前应选择合适的材超低温保存前应选择合适的材料，综合考虑植物材料的大小、料，综合考虑植物材料的大小、基因型、抗冻性、年龄、形态结基因型、抗冻性、年龄、形态结构和生理状态等。构和生理状态等。2）冷冻前预处理）冷冻前预处理 （1）悬浮培养或继代培养）悬浮培养或继代培养 使细胞分裂分化同步化，增加指数使细胞分裂分化同步化，增加指数生长期的细胞生长期的细胞 （2）预培养可增加组织细胞保存后的）预培养可增加组织细胞保存后的存活率。存活率。 增加培养基中蔗糖浓度，提高渗透增加培养基中蔗糖浓度，提高渗透压，或者在预培养基中加入诱导抗寒压，或者在预培养基中加入诱导抗寒力的物质或冷冻保护剂。力的

41、物质或冷冻保护剂。 蔗糖：相对分子量小，十分易溶于蔗糖：相对分子量小，十分易溶于水，在生理水，在生理pH范围内不带电荷，易进范围内不带电荷，易进入细胞作为优良的渗透调节和碳源，入细胞作为优良的渗透调节和碳源，无毒性，不危及材料遗传完整性。无毒性，不危及材料遗传完整性。 DMSO：冰点低，进入细胞后不仅：冰点低，进入细胞后不仅降低材料含水量，而且可降低细胞结降低材料含水量，而且可降低细胞结冰点。冰点。 （3）低温锻炼可激活植物体内的抗寒）低温锻炼可激活植物体内的抗寒机制。让植物在较低温度下接受机制。让植物在较低温度下接受1周到周到几周的低温，并给予短日照或用化合几周的低温，并给予短日照或用化合物

42、处理，可使植物产生抗寒性。物处理，可使植物产生抗寒性。3）超低温保存方法的选择）超低温保存方法的选择 从各种材料的保存技术体系中找出从各种材料的保存技术体系中找出一定的规律，按照材料的基因型及生一定的规律，按照材料的基因型及生理状态的不同，分别建立与之相适应理状态的不同，分别建立与之相适应的保存模式，寻求最佳的保存方法。的保存模式，寻求最佳的保存方法。 液泡小、含水量少的细胞可采液泡小、含水量少的细胞可采用快速降温冷冻方法；液泡大、用快速降温冷冻方法；液泡大、含水量高的细胞一般需要采用慢含水量高的细胞一般需要采用慢速降温法。速降温法。4）冷冻保护剂）冷冻保护剂 特点：特点：易溶于水，在适当质量

43、分数下易溶于水，在适当质量分数下对细胞是无毒的，化冻后易从组织细对细胞是无毒的，化冻后易从组织细胞中清除。胞中清除。 常用冷冻保护剂：常用冷冻保护剂：二甲基亚砜二甲基亚砜（DMSO）、甘油、脯氨酸、糖类、）、甘油、脯氨酸、糖类、乙二醇、二甘油、乙酰胺、福美氧化乙二醇、二甘油、乙酰胺、福美氧化剂等剂等 在进行各种处理时，应把冷冻保护在进行各种处理时，应把冷冻保护剂溶解于含糖或不含糖的冰中，或是剂溶解于含糖或不含糖的冰中，或是溶解在培养基中。溶解在培养基中。 为了保护细胞不受渗透压变动的影为了保护细胞不受渗透压变动的影响，保护剂应当在响，保护剂应当在3060min的一段时的一段时间内逐渐加入。注意

44、温度、时间等，间内逐渐加入。注意温度、时间等，防止产生毒害。防止产生毒害。 对植物来说，对植物来说，DMSO是最好的保护是最好的保护剂，其次是甘油。剂，其次是甘油。 在许多情况下，两三种或更多冷冻在许多情况下，两三种或更多冷冻保护剂混合使用可减低药剂的毒性，保护剂混合使用可减低药剂的毒性，同时提高细胞的存活率。同时提高细胞的存活率。5）材料的冷冻降温方法）材料的冷冻降温方法 快速冷冻法快速冷冻法 慢速冷冻法慢速冷冻法 两步冷冻法两步冷冻法 逐级冷冻法逐级冷冻法6）化冻和洗涤）化冻和洗涤 采取合适的化冻方法，以避免采取合适的化冻方法，以避免在化冻过程中产生细胞内的次生在化冻过程中产生细胞内的次生

45、结冰，并应防止在化冻吸水过程结冰，并应防止在化冻吸水过程中渗透冲击对细胞膜体系的破坏。中渗透冲击对细胞膜体系的破坏。 采用何种化冻方法与保存植物材料采用何种化冻方法与保存植物材料的性质有关。的性质有关。 大多数植物材料采用快速化冻，即大多数植物材料采用快速化冻，即将液氮保存后的材料直接在将液氮保存后的材料直接在3440的的温水浴中化冻。温水浴中化冻。 细胞含水较低的物种和材料适合用细胞含水较低的物种和材料适合用慢速化冻，即将超低温保存材料先置慢速化冻，即将超低温保存材料先置于于00低温下，然后逐渐升至室温，让低温下，然后逐渐升至室温，让其缓慢化冻。其缓慢化冻。 化冻速度还与降温冷冻速度有关。化

46、冻速度还与降温冷冻速度有关。一般而言，冷冻速度超过一般而言，冷冻速度超过-15/min/min，化冻时宜采用快速化冻，否则采用慢化冻时宜采用快速化冻，否则采用慢速化冻。速化冻。 化冻方式还影响材料的发育。化冻方式还影响材料的发育。 化冻过程中应小心操作，避免机械化冻过程中应小心操作，避免机械损伤。试管内的冰一旦溶解后，要立损伤。试管内的冰一旦溶解后，要立即将试管转移到即将试管转移到2020的水浴室中，的水浴室中，并立即进行洗涤和再培养，以避免热并立即进行洗涤和再培养，以避免热伤害。伤害。7）再培养）再培养 植物材料化冻洗涤后，应转到培养植物材料化冻洗涤后，应转到培养基上先暗培养，以避免光对超低

47、温保基上先暗培养，以避免光对超低温保存后已有不同程度伤害材料的光抑制存后已有不同程度伤害材料的光抑制等不良影响，利于材料恢复生长。对等不良影响，利于材料恢复生长。对于悬浮培养细胞或愈伤组织，在细胞于悬浮培养细胞或愈伤组织，在细胞转入正常培养条件下恢复生长之前，转入正常培养条件下恢复生长之前，常需在半固体培养基上培养常需在半固体培养基上培养12周。周。 选择冻存后合适的培养基成分是成选择冻存后合适的培养基成分是成功的关键。功的关键。8）抗冻蛋白与种质保存）抗冻蛋白与种质保存 AFP能和冰晶作用，改变冰晶的结构、能和冰晶作用，改变冰晶的结构、大小和数目；大小和数目；AFP能和细胞膜作用，能和细胞膜

48、作用，封闭离子通道，阻止溶质渗漏，保护封闭离子通道，阻止溶质渗漏，保护膜完整性。膜完整性。二、低温保存二、低温保存1.低温保存概况低温保存概况 将外植体所再生的试管苗在低温条将外植体所再生的试管苗在低温条件下，结合某些特定的培养基如增加件下，结合某些特定的培养基如增加蔗糖浓度、添加甘露醇、山梨醇、脱蔗糖浓度、添加甘露醇、山梨醇、脱落酸等生长延缓因子，辅以培养环境落酸等生长延缓因子，辅以培养环境的调控，从而抑制或延缓生长，延长的调控，从而抑制或延缓生长，延长寿命，达到保存种质的目的。寿命，达到保存种质的目的。主要研究内容主要研究内容 在低于正常培养所需光照、温度条在低于正常培养所需光照、温度条件

49、下，筛选合适的生长延缓因子极其件下，筛选合适的生长延缓因子极其浓度，探讨保存材料最长保存时间极浓度，探讨保存材料最长保存时间极其存活率和再生率，分析其遗传稳定其存活率和再生率，分析其遗传稳定性，以优化最佳的保存条件。性，以优化最佳的保存条件。2.低温保存方法与技术低温保存方法与技术1）控制培养环境温度）控制培养环境温度 （1）常温）常温(255 5) 生长较缓慢和冷生长较缓慢和冷敏感植物种质采用的保存方法。敏感植物种质采用的保存方法。 （2）常低温）常低温(015)和低温和低温(-800) 很多植物种质都可用常低温保存。很多植物种质都可用常低温保存。2）改良培养基中某些）改良培养基中某些营养物质的浓度营养物质的浓度 从培养基中减去一两种营养元素，从培养基中减去一两种营养元素，或者降低某些营养物质的浓度，或或者降低某些营养物质的浓度，或者略微改变培养基成分，使培养植者略微改变培养基成分，使培养植株处于最小生长阶段。株处于最小生长阶段。3）提高培养基渗透压）