发酵豆粕品质检测方法适用性

1、农业微生物学国家重点实验室农业微生物学国家重点实验室 发酵豆粕价值发酵豆粕价值发酵豆粕：优质的尤其适用于幼小动物的蛋白质饲料。加工过程：以豆粕为原料，通过多菌种发酵转化而来。价值实现：抗营养因子消除 蛋白质“预消化” 微生物代谢产物 微生物菌体益生作用品质检测:除常规营养等检测外，围绕上述作用开展针对性检测。品质检测结果与动物饲喂结果一致性要求。 发酵豆粕作为一种优质的饲料蛋白质，养发酵豆粕作为一种优质的饲料蛋白质，养殖效果得到了广泛的认可和大量应用。殖效果得到了广泛的认可和大量应用。 发酵豆粕品质鉴别及分析方法初步建立，发酵豆粕品质鉴别及分析方法初步建立，仍不完善，方法适用性和结果准确分析仍

2、仍不完善，方法适用性和结果准确分析仍需要进一步明确。需要进一步明确。目目 录录 1、原料组成分析、原料组成分析 2、大豆抗原的分解、大豆抗原的分解 3、大豆低聚糖检测、大豆低聚糖检测 4、大豆多肽分析、大豆多肽分析 5、其他检测指标、其他检测指标1 1、发酵豆粕的原料构成分析、发酵豆粕的原料构成分析 受成本和利益的驱使，少数厂家在发酵豆受成本和利益的驱使，少数厂家在发酵豆粕生产中添加低值低成本的其它原料，严粕生产中添加低值低成本的其它原料，严重下降了发酵豆粕的品质。重下降了发酵豆粕的品质。 通过对通过对大豆异黄酮和氨基酸大豆异黄酮和氨基酸的含量分析，的含量分析，能够判断发酵豆粕中是否添加有非豆

3、粕成能够判断发酵豆粕中是否添加有非豆粕成分和粗略添加比例。分和粗略添加比例。1.11.1豆粕发酵过程中影响大豆异黄酮的因素豆粕发酵过程中影响大豆异黄酮的因素 物理因素影响（加工工艺的影响）物理因素影响（加工工艺的影响） 粉碎、干燥等工艺过程的影响。粉碎也是粉碎、干燥等工艺过程的影响。粉碎也是因为温度而起作用。因为温度而起作用。 化学因素影响（化学因素影响（pH的影响）的影响） 工艺中不添加化学物质，主要是工艺中不添加化学物质，主要是pH的影响。的影响。 生物因素影响（发酵菌株的影响）生物因素影响（发酵菌株的影响） 微生物及其酶的作用微生物及其酶的作用1.1.11.1.1加工工艺（温度）对发酵豆

4、粕大豆异黄加工工艺（温度）对发酵豆粕大豆异黄酮的影响酮的影响 110热处理对大豆异黄酮的影响热处理对大豆异黄酮的影响 0h 1h 3h 5h 7h 9h 12h 14h 16h0.97 0.95 0.96 0.98 0.95 0.99 0.97 1.03 1.00 加热处理不会破坏大豆异黄酮。加热处理不会破坏大豆异黄酮。1.1.2 1.1.2 微生物发酵菌株对发酵豆粕大豆异黄微生物发酵菌株对发酵豆粕大豆异黄酮的影响酮的影响 菌株对大豆异黄酮的影响菌株对大豆异黄酮的影响 CK 枯草枯草 地衣地衣 短小短小 乳杆菌乳杆菌 1 乳酸菌乳酸菌2 乳酸菌乳酸菌30.97 1.15 1.08 1.083

5、0.99 0.98 0.94100% 98 102 97 98 98 101 酵母菌酵母菌1 酵母菌酵母菌2 混菌发酵混菌发酵 黑曲霉黑曲霉 根霉根霉 毛霉毛霉1.00 0.99 1.13 1.23 1.03 1.05 99 98 100 97 99 97 微生物发酵菌株不会破坏大豆异黄酮微生物发酵菌株不会破坏大豆异黄酮1.1.3 pH1.1.3 pH的影响的影响发酵豆粕的酸度不会破坏大豆异黄酮。发酵豆粕的酸度不会破坏大豆异黄酮。CK3.54.04.55.05.56.00.97 0.94 0.98 0.95 0.99 0.97 0.99不同不同pH对大豆异黄酮的影响对大豆异黄酮的影响 异黄酮检

6、测结结果：异黄酮检测结结果：样品中存在非豆粕成分样品中存在非豆粕成分氨基酸的对比氨基酸的对比 豆粕发酵后，微生物的生物量在豆粕发酵后，微生物的生物量在100-200亿每克，亿每克，100克产品中微生物菌体蛋白质含克产品中微生物菌体蛋白质含量为量为0.5-1克，发酵后不会显著改变原有氨克，发酵后不会显著改变原有氨基酸的组成，发酵产品氨基酸对豆粕氨基基酸的组成，发酵产品氨基酸对豆粕氨基酸的增加值与粗蛋白的增加值相当，变异酸的增加值与粗蛋白的增加值相当，变异幅度在幅度在10%左右，可以根据这一规律判断左右，可以根据这一规律判断发酵豆粕的原料组成。发酵豆粕的原料组成。氨基酸含量分析：氨基酸含量分析：

7、氨基酸含量通过日立氨基酸含量通过日立835-50835-50氨基酸自动检测仪来氨基酸自动检测仪来测定。测定。 氨基酸种类氨基酸种类 发酵前豆粕（）发酵前豆粕（） 发酵后豆粕（）比值发酵后豆粕（）比值 苏氨酸苏氨酸(Thr) 1.945 (Thr) 1.945 2.237 1.152.237 1.15 丝氨酸丝氨酸(Ser)(Ser) 2.153 2.153 2.808 1.302.808 1.30 谷氨酸谷氨酸(Glu) 7.231 (Glu) 7.231 9.534 1.329.534 1.32 甘氨酸甘氨酸(Gly) 2.287 (Gly) 2.287 2.702 1.182.702 1.

8、18 丙氨酸丙氨酸(Ala) 2.350 (Ala) 2.350 2.693 1.152.693 1.15 缬氨酸缬氨酸(Val ) 2.522 (Val ) 2.522 3.144 1.203.144 1.20 蛋氨酸蛋氨酸(Met) 0.568 (Met) 0.568 0.670 1.180.670 1.18 异亮氨酸异亮氨酸(Ile) 2.356 (Ile) 2.356 2.543 1.082.543 1.08续表：续表：氨基酸种类氨基酸种类 发酵前豆粕（）发酵前豆粕（） 发酵后豆粕（）发酵后豆粕（） 比值比值亮氨酸亮氨酸(Leu) 4.098 (Leu) 4.098 4.459 1.0

9、9 4.459 1.09 苯丙氨酸苯丙氨酸(Phe) 2.310 (Phe) 2.310 2.799 1.202.799 1.20赖氨酸赖氨酸(Lys) 2.910 (Lys) 2.910 3.978 1.363.978 1.36总氨基酸含量总氨基酸含量 44.770 44.770 55.115 1.2355.115 1.23粗蛋白粗蛋白 46 56 1.2246 56 1.22 发酵后粗蛋白由发酵后粗蛋白由46%46%提高到提高到56%56%，增加，增加22%22%，各单个氨，各单个氨基酸含量较发酵前都有相应增加；总氨基酸较发酵前提基酸含量较发酵前都有相应增加；总氨基酸较发酵前提高了高了23

10、23。 2 2、大豆抗原的分解、大豆抗原的分解原理：利用原理：利用7S与与11S蛋白抗原的蛋白抗原的SDS-PAGE电电泳图谱直接展示。根据电泳图谱的颜色及大小泳图谱直接展示。根据电泳图谱的颜色及大小定性判断抗原的分解程度。定性判断抗原的分解程度。 SDS-PAGE电泳展示的是溶解的蛋白质，电泳展示的是溶解的蛋白质，因此影响蛋白质溶解的工艺过程，如高温干燥因此影响蛋白质溶解的工艺过程，如高温干燥工艺，发酵添加物，人工酸化以及使用陈化豆工艺，发酵添加物，人工酸化以及使用陈化豆粕都将影响蛋白质溶解率，使电泳图变浅变小，粕都将影响蛋白质溶解率，使电泳图变浅变小，出现分解好的假性结果。出现分解好的假性

11、结果。 目前这一方法存在较大局限性，不易作为品质分目前这一方法存在较大局限性，不易作为品质分析指标析指标。7S7S与与11S 11S 球蛋白的球蛋白的SDS-PAGESDS-PAGE电泳电泳 从图中可以看出：从图中可以看出：CK中存在中存在7S球蛋白的三个亚基球蛋白的三个亚基与与11S球蛋白两个亚基。球蛋白两个亚基。Ck Ck 为发酵前豆粕中为发酵前豆粕中提取的球蛋白。提取的球蛋白。M为低分子蛋白质标为低分子蛋白质标准，分子量为准，分子量为14.4KD97.4KD。2.12.1发酵豆粕酸溶性蛋白（小肽）及其在碱性条件下发酵豆粕酸溶性蛋白（小肽）及其在碱性条件下的变化的变化将样品在碱性下（pH8

12、.8）提蛋白，离心所得上清。 原豆粕编号（Y） 在pH调至6.85，发酵豆粕编号（7）pH调至6.05时开始出现明显沉淀 。 原豆粕编号（Y） 和发酵豆粕编号（7）pH调至4.5时酸溶性蛋白（小肽）沉淀状况 。 2.22.2陈化豆粕与大豆分离蛋白的陈化豆粕与大豆分离蛋白的SDS-PAGESDS-PAGE电泳结果电泳结果 样品浓度 mg/ml 2010年豆粕(A) 1.83 2012年豆粕(B) 2.38 大豆分离蛋白(C) 2.66随着豆粕存放时间延长，碱溶性蛋白质下降， A B C随着存放时间的延长，肽链的空间结构有紧缩的趋势2.22.2添加金属盐的影响添加金属盐的影响低低 较低较低 中中

13、高高 CKA盐2.22.2添加金属盐的影响添加金属盐的影响B盐和C盐注：1、2、3和4分别为B盐的低、较低、中、高剂量，5、6、7、8分别为C盐的低、较低、中、高剂量。2.32.3加热处理豆粕的加热处理豆粕的SDS-PAGESDS-PAGE电泳结果电泳结果0h0h、1h1h、3h3h、5h5h、9h9h、15h15h为原豆粕经为原豆粕经115115处理时间处理时间2.4 酸处理豆粕的酸处理豆粕的SDS-PAGE电泳结果电泳结果方法：方法：HCl配成配成0%、1%、2%、3%、4%、5%浓度，按浓度，按50%的的量添加到原豆粕中，量添加到原豆粕中，35烘干。烘干。0%、1%、2%、3%、4%、5

14、%为加缓冲液提取，但不调为加缓冲液提取，但不调p H0%、1%、2%、3%、4%、5%为加缓冲液提取，调为加缓冲液提取，调p H8.8 不同发酵豆粕样品碱性可溶性蛋白浓度不同发酵豆粕样品碱性可溶性蛋白浓度 样品编号蛋白浓度 （mg/ml） CK 2.42 A 2.42 C 1.85 Y2 2.23 S1 1.75 2 3.85 7 3.66 理论上碱溶性蛋白浓度在25mg/ml,实际上在1.753.85mg/ml之间，提取蛋白质仅占蛋白质7%15%。不同发酵豆粕绝对上样量相同电泳图不同发酵豆粕绝对上样量相同电泳图浓缩胶浓度5%，分离胶浓度15% 7 2 S1 Y2 C A CK 结合上面分析结

15、果，不同产品虽然电泳结果存在较大差异，但它不能真正说明谁优谁劣。 综合来看，影响蛋白质肽链空间结构（或松散或紧密），电荷多少的条件，如存放时间、干燥温度、干燥时间、盐种类、盐浓度等都影响电泳结果，且经多重加工后，碱溶性提取蛋白质不到全部蛋白质的20%。因此，电泳胶的结果不能科学客观反映蛋白质降解状况。因此，因此，SDS-PAGESDS-PAGE电泳结果在直观认识大豆蛋白质特电泳结果在直观认识大豆蛋白质特点、组成时是有意义的，在当前技术条件下，不能点、组成时是有意义的，在当前技术条件下，不能作为发酵豆粕质量的判别依据。作为发酵豆粕质量的判别依据。3 3、大豆低聚糖检测、大豆低聚糖检测 在豆粕中低

16、聚糖主要为在豆粕中低聚糖主要为水苏糖、棉籽糖和蔗糖水苏糖、棉籽糖和蔗糖。它们在干基含量分别为它们在干基含量分别为4 4、2 2、5 5。 棉籽糖棉籽糖是半乳糖以是半乳糖以（1 1，6 6）糖苷键与葡萄糖）糖苷键与葡萄糖基连接。基连接。 水苏糖水苏糖是半乳糖以是半乳糖以（1 1，6 6）糖苷键与棉籽糖）糖苷键与棉籽糖中半乳糖基连接。中半乳糖基连接。 液相色谱可以进行准确定量，一般不具备检测液相色谱可以进行准确定量，一般不具备检测条件；薄层层析简单，直观，企业可进行分析。条件；薄层层析简单，直观，企业可进行分析。 3.1 大豆低聚糖大豆低聚糖标准品棉籽糖与水苏糖的液相色谱图标准品棉籽糖与水苏糖的液

17、相色谱图保留时间：棉籽糖保留时间：棉籽糖 7.462min 水苏糖水苏糖 12.002 min发酵前原豆粕中棉籽糖与水苏糖的液发酵前原豆粕中棉籽糖与水苏糖的液相色谱图相色谱图保留时间：棉籽糖保留时间：棉籽糖 7.447min 水苏糖水苏糖 11.917 min峰高：水苏糖峰高：水苏糖 2.10cm水水苏苏糖糖棉棉籽籽糖糖3.23.2薄层层析薄层层析 4.4.大豆多肽大豆多肽大豆多肽定义：大豆多肽定义： 以大豆，豆粕或大豆蛋白为主要原料，以大豆，豆粕或大豆蛋白为主要原料，用酶解法或微生物发酵法生产的，分子用酶解法或微生物发酵法生产的，分子量分布在量分布在10000Da以下的肽称为大豆多以下的肽称

18、为大豆多肽。肽。能够指示豆粕蛋白质的水解状态。能够指示豆粕蛋白质的水解状态。4.14.1大豆多肽分析方法大豆多肽分析方法 由于精确分析难度大，一般以三氯由于精确分析难度大，一般以三氯乙酸乙酸-可溶性氮指数可溶性氮指数 (TCA-SNI)和水和水解度解度(DH)表示。表示。对蛋白质水解由于存在内切酶和外对蛋白质水解由于存在内切酶和外切酶的差距，上述方法不能完全准切酶的差距，上述方法不能完全准确预示一个混合蛋白质或饲料原料确预示一个混合蛋白质或饲料原料蛋白质水解状况。蛋白质水解状况。 4.1.1三氯乙酸-可溶性氮指数 (TCA-SNI)的测定 将发酵豆粕水溶液与浓度为将发酵豆粕水溶液与浓度为10%

19、的三氯的三氯乙酸以乙酸以1: 1比例混合，比例混合，4500 r/min离心离心10 min后取上清液用凯氏定氮法测定。后取上清液用凯氏定氮法测定。 4.1.2水解度(DH)的测定 蛋白质水解度蛋白质水解度 (DH) 的定义为水解过程中的定义为水解过程中打开的肽键占蛋白质肽键总数的百分比，打开的肽键占蛋白质肽键总数的百分比，采用甲醛法测定采用甲醛法测定 。温度对温度对DHDH和和TCA-SNITCA-SNI的影响的影响 大豆蛋白质肽链分子量主要分布在大豆蛋白质肽链分子量主要分布在40000-70000之间，平均约为之间，平均约为55000。以。以此推算，氨基酸残基数约为此推算，氨基酸残基数约为

20、458（氨基酸（氨基酸平均分子量取平均分子量取120），有），有457个肽键，若个肽键，若水解度为水解度为10%，即有，即有45个肽键被分解，个肽键被分解，产生产生46个分子，其平均分子量为个分子，其平均分子量为55000/46=1195，其水溶性指数理论上是，其水溶性指数理论上是100%，与上述，与上述40%相差甚远。相差甚远。4.1.3 4.1.3 酸溶性氮指数法酸溶性氮指数法1 1、发酵豆粕水溶（蒸馏水，一般按、发酵豆粕水溶（蒸馏水，一般按1 1：5 5），）， 调调至至pH=4.5pH=4.5，并于，并于12000rpm12000rpm离心离心10min10min（或过滤），（或过滤）

21、，取上清检测。取上清检测。2 2、采用凯式定氮法检测上清中氮的含量（、采用凯式定氮法检测上清中氮的含量（a a）：）：3 3、直接取上清液（不消化）检测无机氮（主要是、直接取上清液（不消化）检测无机氮（主要是铵态氮）铵态氮） （b b）；）；4 4、样品中多肽量的计算、样品中多肽量的计算多肽量多肽量= =（a-ba-b）* *蛋白质换算系数蛋白质换算系数4.24.2发酵豆粕多肽含量发酵豆粕多肽含量液体酶解条件下，在底物（大豆蛋白）和蛋液体酶解条件下，在底物（大豆蛋白）和蛋白酶都过量情况下，大豆多肽含量最高在白酶都过量情况下，大豆多肽含量最高在6.5%-7.0%。固体发酵由于受到水分限制，发酵豆

22、粕产品固体发酵由于受到水分限制，发酵豆粕产品的多肽含量理论上不会超过的多肽含量理论上不会超过10%。有些产品超过有些产品超过10%，是非蛋白氮较高，或者，是非蛋白氮较高，或者加入氨基酸生产废液废渣。加入氨基酸生产废液废渣。底物浓度与多肽含量的关系底物浓度与多肽含量的关系5 5、胰蛋白酶抑制剂的测定（、胰蛋白酶抑制剂的测定（GB/T 21498-2008GB/T 21498-2008） 原理原理：胰蛋白酶抑制剂能够和胰蛋白酶结合，通过测：胰蛋白酶抑制剂能够和胰蛋白酶结合，通过测定底物（定底物（BAPABAPA）被未结合的胰蛋白酶酶解生成的）被未结合的胰蛋白酶酶解生成的产物产物对硝基苯胺溶液的吸光

23、度，然后以它和对硝基苯胺溶液的吸光度，然后以它和未加抑制剂的标准吸光度之差来表示被抑制的胰未加抑制剂的标准吸光度之差来表示被抑制的胰蛋白酶活性。蛋白酶活性。6 6、植酸含量的测定、植酸含量的测定 原理原理：用分光光度法测定用过量的：用分光光度法测定用过量的FeFe3+3+与植酸反与植酸反应后的上清液中剩余应后的上清液中剩余FeFe3+3+，从而间接测定植酸含，从而间接测定植酸含量。量。、7 7、脂肪氧化酶活性的测定、脂肪氧化酶活性的测定原理原理：利用豆粕中的脂肪氧化酶与不饱和脂肪酸：利用豆粕中的脂肪氧化酶与不饱和脂肪酸亚油酸反应，测定反应物的吸光值大小来表亚油酸反应，测定反应物的吸光值大小来表示酶活的大小。示酶活的大小。、 9 9、 脲酶活性的测定脲酶活性的测定 原理原理：将粉碎的豆粕与中性尿素缓冲溶液混合：将粉碎的豆粕与中性尿素缓冲溶液混合, ,在在3030保持保持30min, 30min, 尿素酶催化尿素水解产生氨的反尿素酶催化尿素水解产生氨的反应。用过量盐酸中和所产生的氨应。用过量盐酸中和所产生的氨, ,再用氢氧化钠标再用氢氧化钠