核酸的体外扩增(PCR)

1、2022-6-121医学分子生物学医学分子生物学盛 德 乔盛 德 乔2022-6-122第十一章第十一章 核酸的体外扩增核酸的体外扩增2022-6-123第一节第一节 聚合酶链式反应聚合酶链式反应polymerase chain reaction PCR2022-6-124一、一、PCR的基本原理的基本原理PCR的基本原理的基本原理变性、复性、半保留复制变性、复性、半保留复制PCR三步曲三步曲 变性变性 9097 退火退火 4555 延伸延伸 72左右左右2022-6-125变性延伸退火90 9540 6070 752022-6-126二、二、PCR引物设计引物设计一对引物，与一对引物，与3端

2、互补端互补长度：长度：1530个核苷酸个核苷酸碱基分布随机碱基分布随机引物内、引物间不应有互补序列引物内、引物间不应有互补序列引物与非特异扩增区无同源性引物与非特异扩增区无同源性3端必须互补端必须互补 5端可游离端可游离2022-6-127三、模板的制备三、模板的制备DNA 从细胞中提取从细胞中提取DNA：血细胞、绒毛、尿血细胞、绒毛、尿样、毛发、精斑、口腔上皮细胞样、毛发、精斑、口腔上皮细胞 固定和包埋的组织标本：脱蜡、蛋白酶固定和包埋的组织标本：脱蜡、蛋白酶K消化消化RNA新鲜组织或细胞新鲜组织或细胞所用器皿和试剂必需经高温灭菌或所用器皿和试剂必需经高温灭菌或DEPC处处理理2022-6-

3、128四、四、PCR的基本反应的基本反应 （一）、以（一）、以DNA为模板的反应：为模板的反应： 10缓冲液缓冲液 10 l 4种种dNTP混合物混合物 各各200 mol/L引物引物 各各10100 pmol模板模板DNA 0.12 gTaq DNA聚合酶聚合酶 2.5 uMg2+ 1.5 mmol/L加双或三蒸水至加双或三蒸水至 100 l 2022-6-129PCR反应五要素反应五要素： 引物、引物、酶酶、dNTP、模板和模板和Mg2+Taq DNA聚合酶聚合酶来自水生栖热菌来自水生栖热菌 Thermusaquaticus良好的耐热性良好的耐热性Mg2+依赖性依赖性无校正功能无校正功能2

4、022-6-1210（二）、以二）、以mRNA为模板的反应为模板的反应mRNA 5 l5 Buffer 4 ldNTP 2 l(10mmol/L)RNasin 1 l(20u)AMV RTase 1 l(10u)Oligo(dT)1218(或下游引物或下游引物) 1 lddH2O 6 l /20 l42水浴水浴1小时，小时，95 水浴水浴10分钟灭活逆转分钟灭活逆转录酶。向上述反应体系中添加如下试剂录酶。向上述反应体系中添加如下试剂：2022-6-121110 Buffer 5 l25mmol/L Mg2+ 3 lTaq酶酶 0.5 l（2.5u）上游引物上游引物 1 lddH2O 20.5

5、l /50 l 按按PCR循环参数进行循环参数进行RT-PCR2022-6-1212（三（三）PCR产物的积累规律产物的积累规律 DNA扩增过程遵循酶促动力学原理。扩增过程遵循酶促动力学原理。 反应初期，目的反应初期，目的DNA片段呈指数形式片段呈指数形式（2n），），随着目的随着目的DNA的积累，在引物的积累，在引物模板与模板与DNA聚合酶达到一定比例时，酶的聚合酶达到一定比例时，酶的催化反应趋于饱和催化反应趋于饱和平台期平台期 。（。（25个循环）个循环）（四）（四）PCR反应的自动化反应的自动化2022-6-1213五、五、PCR反应条件的控制反应条件的控制（一）（一）PCR反应的缓冲溶

6、液反应的缓冲溶液提供合适的酸碱度和某些离子提供合适的酸碱度和某些离子1050mmol/L Tris-HCl缓冲液缓冲液50mmol/L KClBSA或明胶或明胶（二）镁离子浓度（二）镁离子浓度Taq酶活性需要酶活性需要Mg2+ ，Mg2+浓度过高导致非特异扩增。浓度过高导致非特异扩增。一般常用一般常用1.5mmol/L2022-6-1214（三）底物浓度（三）底物浓度dNTP浓度在浓度在20200 mol/L四种四种dNTP必须浓度相等必须浓度相等（四）（四） Taq DNA聚合酶聚合酶Taq DNA聚合酶在聚合酶在7080具有最高聚合活具有最高聚合活性性2022-6-1215（五）引物（五）

7、引物引物浓度一般为引物浓度一般为0.1 0.5 mol/L（六）反应温度和循环次数六）反应温度和循环次数变性温度和时间变性温度和时间 95/30 60s退火温度和时间退火温度和时间 4555/30 60s延伸温度和时间延伸温度和时间 72循环次数循环次数 2530 不超过不超过352022-6-1216六、六、PCR中应注意的事项中应注意的事项PCR反应中可能出现的问题反应中可能出现的问题：假阴性，不出现扩增条带假阴性，不出现扩增条带假阳性假阳性出现非特异扩增带出现非特异扩增带2022-6-1217（一）防止污染（一）防止污染试剂小量分装试剂小量分装吸头及吸头及EP管一次性使用管一次性使用器皿

8、及工作区域要分开，无菌操作器皿及工作区域要分开，无菌操作（二）设立对照二）设立对照：阳性对照：阳性对照： 阳性模板阳性模板阴性对照：阴性对照： 阴性模板阴性模板试剂对照：试剂对照： 除模板外的所有组分除模板外的所有组分注意的事项注意的事项：2022-6-1218七、七、PCR技术的主要类型技术的主要类型 筑巢筑巢PCR 彩色彩色PCR 多重多重PCR 原位原位PCR 不对称不对称PCR 定量定量PCR 共享引物共享引物PCR 差异显示差异显示PCR 锚定锚定PCR 重组重组PCR2022-6-1219PCR反应的特点反应的特点特异性强特异性强：灵敏度高灵敏度高：PCR产物的生成量是以指数方式产

9、物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克增加的，能将皮克(pg=10- 12)量级的起始待量级的起始待测模板扩增到微克测模板扩增到微克( g=-6)水平水平简便、快速简便、快速：PCR反应一般在反应一般在24 小时完小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广一定要用同位素，无放射性污染、易推广。2022-6-12204.对标本的纯度要求低对标本的纯度要求低：不需要分离病毒或细菌及培养细胞，不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及总粗制品及总RNA均可作为扩增模板。均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、

10、洗嗽可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测。扩增检测。2022-6-1221第二节第二节 连接酶链反应连接酶链反应Ligase chain reaction LCR2022-6-1222一、一、LCR的基本原理的基本原理LCR是以是以DNA连接酶将某一连接酶将某一DNA链的链的5磷磷酸与另一相邻链的酸与另一相邻链的3羟基连接为基础的羟基连接为基础的循环反应。循环反应。2022-6-12232022-6-1224二、二、LCR产物的检测产物的检测标记引物：标记引物： 放射性标记放射性标记 荧光素标记荧光素标记 地高辛标记地高

11、辛标记2022-6-1225三、影响三、影响LCR的重要因素的重要因素 引物引物基因的突变位点基因的突变位点长度足够长度足够 LCR的反应条件的反应条件2022-6-1226第三节第三节 RNA的体外扩增的体外扩增RNAPCR2022-6-1227转录依赖的扩增系统(transcript-based amplification system, TAS)自主维持序列扩增或再生式序列复制（self-sustained sequence replication,3SR)核酸序列的扩增（nucleic acid sequence-based amplification, NASBA）2022-6-1228 一、基本原理一、基本原理以以RNA为模板在体外大量扩增为模板在体外大量扩增RNA非循环相非循环相逆转录逆转录转录转录循环相循环相聚合酶链式反应聚合酶链式反应反应体系温度均一反应体系温度均一RNA产物以产物以10的指数方式增加的指数方式增加2022-6-12292022-6-1230酶酶：逆转录酶，逆转录酶，RNase H, T7RNA聚合酶聚合酶引物引物：引物引物A与与RNA3端互补，端互补，5 端含启动子端