Q10第十章聚合酶链式反应技术20161013

1、第十章第十章 聚合酶链式反应技术Chapter 10 Technology of Chapter 10 Technology of Polymerase Chain Reaction, (PCR)Polymerase Chain Reaction, (PCR)内容PCR的概念及技术的创建PCR的基本原理及特点PCR的反应体系和条件优化PCR产物分析PCR常用技术和应用Kary B Mullis (1944-)l 1983 年年发明了发明了PCRPCR技术技术l 19931993年度获得诺贝尔化学奖年度获得诺贝尔化学奖DNA的体内复制：的体内复制：原料：原料： template DNA（geno

2、mic DNA ），），RNA primer，dNTPs酶：酶： 解旋酶，引物酶，解旋酶，引物酶， DNA聚合酶，聚合酶，连接酶连接酶反应条件：反应条件：胞液环境，胞液环境，37 反应过程：反应过程： 起始（模板起始（模板DNA解链、形成引发体）、解链、形成引发体）、延长、终止延长、终止（三阶段）（三阶段）产物：产物：模板模板DNA （基因组基因组DNA）拷贝数增加拷贝数增加一倍一倍PCR：template DNA（genomic DNA ，cDNA）, a pair of specific oligonucleotide primer，dNTPsDNA polymerasebuffer，三种

3、，三种变化的温度变化的温度（94，50-70，72 ），），cycles（25-35）denaturation、 annealing 、extension （三阶段，（三阶段，多循环多循环）目的目的DNA（特异性）（特异性）拷贝数增加拷贝数增加 倍倍PCRPCR技术的基本原理技术的基本原理属于无细胞的分子克隆，属于无细胞的分子克隆，在微量离心管中在微量离心管中, ,加入适量的加入适量的缓冲液缓冲液, , 微量的微量的模板模板DNA,DNA,四种脱氧单核苷酸四种脱氧单核苷酸, ,耐热性多聚耐热性多聚酶酶, , 一对合成一对合成DNADNA的的引物引物, ,通过高温通过高温变性变性、低温、低温退火

4、退火和中温和中温延伸延伸三个阶段为一三个阶段为一个循环个循环, ,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍倍, ,一般样品是经过一般样品是经过3030次循环次循环, ,最终使基因放大了数最终使基因放大了数百万倍百万倍; ; 扩增了特异区段的扩增了特异区段的DNADNA带。带。 Denaturing95CAnnealingTm-5CExtension72CPCR的原理的原理PCR的过程的过程（1）第一步）第一步 变性（变性（denature）94-95 oC下下5分钟，模板分钟，模板DNA双链双链完全变性成单链。完全变性成单链。（2）第二步）第二步 复性（复

5、性（anneal）50-60 oC下下1分钟，引物与模板复性。分钟，引物与模板复性。 引物的浓度高，引物的浓度高， 引物的链短。引物的链短。94 oC下下1分钟，新合成的分钟，新合成的DNA双双链又变性成单链模板。链又变性成单链模板。（4）第四步）第四步 变性（变性（denature）72 oC下下1-2分钟，分钟，Taq DNA聚合酶聚合酶在引物的在引物的3端上加上核苷酸。端上加上核苷酸。（3）第三步）第三步 延伸（延伸（extend）（5）第五步）第五步 重复（重复（repeat）PCR反应条件反应条件变性变性 95 5min变性变性 95 1min退火退火 55 1min延伸延伸 72

6、1min延伸延伸72 1min35 cycles变性变性95 延伸延伸72 退火退火Tm-5PCRPCR PrinciplePrincipletemplate denaturatationPrimer annealingPrimer extensionPCR反应的特点反应的特点 特异性强特异性强 引物与模板结合的特异性及聚合酶的忠实性引物与模板结合的特异性及聚合酶的忠实性 灵敏度高灵敏度高 指数增长指数增长，从从pg (10pg (10-12-12) )可扩增至可扩增至 mg (10mg (10-6-6) )水平水平 简便、快速简便、快速 2 24 4 小时完成扩增小时完成扩增 对标本的纯度要

7、求低对标本的纯度要求低不需要纯化，甚至可以直接用细菌。已固定不需要纯化，甚至可以直接用细菌。已固定或包埋的组织切片也可以直接用于作模板。或包埋的组织切片也可以直接用于作模板。PCR仪仪PCR反应标准的标准的PCRPCR反应体系反应体系 10扩增缓冲液扩增缓冲液 10ul 4种种dNTP混合物混合物 各各200umol/L 引物引物 10100pmol 模板模板DNA 0.12ug Taq DNA聚合酶聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L 加双或三蒸水至加双或三蒸水至 100ul自从自从H.A. Erilish分离出耐高温的分离出耐高温的Taq DNA聚合聚合酶，代替大肠杆菌酶，代替大

8、肠杆菌DNA聚合酶聚合酶Klenow片断片断（37 oC )，PCR技术才进入实用阶段。技术才进入实用阶段。（1）Taq DNA聚合酶聚合酶 PCR体系组成体系组成Taq DNA聚合酶的最大特点是热稳定性，耐高聚合酶的最大特点是热稳定性，耐高温，非常适合温，非常适合PCR过程的反复高温变性要求。过程的反复高温变性要求。 热稳定性热稳定性最适温度：最适温度： 72-78 oC 延伸速度：延伸速度： 约约1000nt/min酶分子酶分子 最长延伸长度：最长延伸长度：6.7kb 最适温度高最适温度高 Taq酶的功能与缺点酶的功能与缺点具有具有53聚合酶活性和聚合酶活性和53外切酶活外切酶活性，但没有

9、性，但没有3 5外切酶活性。外切酶活性。 合成超过合成超过600bp长度的长度的DNA就有可能出现就有可能出现错配，用于克隆基因时必须测序。错配，用于克隆基因时必须测序。金属离子敏感（尤其是金属离子敏感（尤其是Mg2+ ）。）。 当当dNTP（能结合（能结合Mg2+）的浓度为）的浓度为0.7-0.8mmol/L时，时，MgCl2的最佳浓度应是的最佳浓度应是2.0mmol/L。 Taq DNA聚合酶的激活剂聚合酶的激活剂 50mmol/L KCl也能激活也能激活Taq DNA聚合酶的活性。聚合酶的活性。与待扩增的模板与待扩增的模板DNA区段的两区段的两3端端序列互补（序列互补（ 5端相同）的短端

10、相同）的短DNA。（2）引物（）引物（primer) 位置位置3 3 即即2.75 1011 bp的基因组中有一次的基因组中有一次完全与完全与19个核苷酸的序列相同的个核苷酸的序列相同的机会（或机会是约机会（或机会是约210- -11）。）。引物的长度引物的长度理论计算：理论计算：419=2.75 1011。一般引物设计为长一般引物设计为长15-30bp。引物的碱基序列引物的碱基序列 5端根据需要可设计成某个内切酶的切点端根据需要可设计成某个内切酶的切点顺序、顺序、RNA聚合酶识别序列、突变位点或聚合酶识别序列、突变位点或生物素标记等，方便与以后操作。生物素标记等，方便与以后操作。5ATGCA

11、GAAACTGATCGATCGATCGAT3 3GCTAGCTACTTAAG5 3端必须与模板正确配对，端必须与模板正确配对，5端可以不配对。端可以不配对。templateprimer尽可能提高尽可能提高G+C含量，以提高引物含量，以提高引物与模板的结合力与模板的结合力引物的碱基组成引物的碱基组成避免连续相同碱基排列或内部回文序列避免连续相同碱基排列或内部回文序列. 5GGCAGTCTGCCAGTCTAC3 CTGCCAGTCTAC3 GACGG5 T发卡结构发卡结构1）2）3）避免形成引物二聚体（避免形成引物二聚体（dimer）两个引物之间不能有两个以上的两个引物之间不能有两个以上的连续碱基

12、序列互补。连续碱基序列互补。5GGTCTGCCAGTCTAC3 3CAGGACTTAGTCACT5 primer1primer2Upstream primer vs Downstream primerSense primer vs Antisense primerPrimer1 vs Primer2Forward primer vs Reverse primer引物的引物的Tm值值Tm=（G+C) 4 + (A+T) 2当引物中的（当引物中的（G+C）含量低于）含量低于50%时，复性温度低于时，复性温度低于55 oC。适当提高复性温度可以提高引物与模板结适当提高复性温度可以提高引物与模板结合的

13、特异性，减少非特异产物的出现。合的特异性，减少非特异产物的出现。实际复性温度选择实际复性温度选择低于低于Tm值值5 oC。手工计算：手工计算：一般估计：一般估计：引物的浓度引物的浓度一般使用终浓度各一般使用终浓度各0.2 mol/L。简并引物简并引物如果引物的序列是从基因产物蛋白质的如果引物的序列是从基因产物蛋白质的氨基酸氨基酸序列反推序列反推出来的，就必须考虑密码的简并性。出来的，就必须考虑密码的简并性。 需要合成多种序列的引物，彼此间只有一个或需要合成多种序列的引物，彼此间只有一个或几个碱基差异。这样的混合引物称简并引物。几个碱基差异。这样的混合引物称简并引物。设计多组引物，结合位点依次位

14、于前一组设计多组引物，结合位点依次位于前一组引物之间。增加扩增产物的特异性。引物之间。增加扩增产物的特异性。引物设计现在多用专业软件引物设计现在多用专业软件 套嵌引物（套嵌引物（nested primers)1324如如Primer6.0等等dNTP呈颗粒状， 保存不当易变性分解dNTP溶液呈酸性，使用时应小量分装，-20冰冻保存，多次冻融会使dNTP降解在PCR反应中，dNTP应为50200umol/L，浓度过低会降低PCR产物的产量dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性（3） dNTP（4）模模板板DNA但不能有蛋白质变性剂、但不能有蛋白质变性剂、DNA

15、酶、酶、Mg2+的的螯合剂等影响螯合剂等影响DNA聚合酶的活性。聚合酶的活性。 模板的量：模板的量： 不能太多，不能太多，100 l反应体系中反应体系中100ng足够。足够。 纯度：纯度：PCR对模板对模板DNA的纯度要求不高。的纯度要求不高。（5） PCRPCR反应条件优化反应条件优化 反应温度（变性、退火、延伸）反应温度（变性、退火、延伸）反应时间（变性、退火、延伸）反应时间（变性、退火、延伸）循环次数（循环次数（PCRPCR效率及产物量）效率及产物量）1 1、温度、温度 变性温度：变性温度：9494- -97 97 退火温度：低于引物退火温度：低于引物TmTm 5 5 左右，一般左右，一

16、般55-60 温度过高：降低扩增效率；温度过高：降低扩增效率； 温度过低：增加非特异性扩增温度过低：增加非特异性扩增延伸温度：延伸温度：72 72 ，此时，此时TaqTaq酶具有较高的酶促活性酶具有较高的酶促活性2 2、时间、时间 第一次变性应给予足够时间（第一次变性应给予足够时间（5 5- -7 7分钟）分钟） 每一个步骤所需时间取决于扩增片段的长度，一般为每一个步骤所需时间取决于扩增片段的长度，一般为复性时间：复性时间：303060sec60sec 延伸时间：延伸时间：1Kb1Kb以内的以内的DNADNA片段，延伸时间片段，延伸时间1min1min 3-4Kb 3-4Kb的的DNADNA片

17、段，延伸时间片段，延伸时间3-4min3-4min 10Kb 10Kb的的DNADNA片段，延伸时间片段，延伸时间15min15min3 3、循环次数、循环次数 重复次数一般设为重复次数一般设为25253535个循环个循环 扩增反应的平台效应：扩增反应的平台效应： 理论上，理论上，PCRPCR反应产物呈指数性增长，但这种增长反应产物呈指数性增长，但这种增长形式在扩增形式在扩增25-2525-25个循环以后便放慢直至停止，达到个循环以后便放慢直至停止，达到反应平台，此时扩增产物量不再随循环次数的增加而反应平台，此时扩增产物量不再随循环次数的增加而呈指数增长呈指数增长PCR反应曲线PCR 产物分析

18、产物分析Analysis of PCR productsGel analysis (琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳/聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 ) : PCR 产物电泳，产物电泳，EB（溴乙锭）染色，（溴乙锭）染色， 紫外仪下观察，紫外仪下观察，初步判断产物的特异性。初步判断产物的特异性。Restriction-endonuclease digestion analysis：酶切、电泳分离。酶切、电泳分离。产物的鉴定，基因分型，研究变异性。产物的鉴定，基因分型，研究变异性。Hybridization ： (Southern blot/dot blot )Sequence analysi

19、s：是检测是检测PCR产物特异性的产物特异性的 最可靠方法。最可靠方法。常用常用PCR技术技术原位原位PCR (in situ PCR)多重多重PCR（multiplex PCR）长距离长距离PCR (Long-range PCR)逆转录逆转录PCR（reverse transcription PCR，RT-PCR）荧光定量荧光定量PCR（fluorescent quantitative PCR）巢式巢式PCR（nesting PCR）-4条引物条引物 原位聚合酶链式反应（原位聚合酶链式反应（In situIn situ PCR PCR）是由）是由HaaseHaase等于等于19901990年

20、首创。它是利用完整的细胞作年首创。它是利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段, ,在不破坏细胞的前提下在不破坏细胞的前提下, ,利用一些特定的检测手利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。段来检测细胞内的扩增产物。 直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行扩增。可进行细胞内定位。细胞中进行扩增。可进行细胞内定位。 适用于检测病理切片中含量较少的靶序列适用于检测病理切片中含量较少的靶序列 12341234RT-PCRRT-PCR（reverse transcription-PCR）T

21、emin,H.发现反转录酶，发现反转录酶， 1975诺贝尔奖诺贝尔奖技术关键：技术关键：利用利用逆转录酶逆转录酶，把，把mRNAmRNA反转录成反转录成cDNA，再以再以cDNA为模板进行为模板进行PCR扩增。扩增。RNA template3 5 下游引物下游引物cDNA first strand3 5 上游引物上游引物cDNA first strandcDNA second strand3 5 3 5 反转录酶反转录酶Taq酶酶PCRReverse transcription (RT)下游引物下游引物上游引物上游引物Taq酶酶PCR-RFLP(Restriction Fragment Len

22、gth Polymorphism，RFLP)限制性限制性 片段长度多态性片段长度多态性 1. 分析已知突变分析已知突变 。 2. 突变碱基涉及酶切位点的变化。突变碱基涉及酶切位点的变化。 PCR- 酶切酶切- 电泳电泳PCR-RFLP5 CCACGG 33 GGTGCC 5*5 CCATGG 33 GGTACC 5*Resistance to NcoI DigestionSusceptible to NcoI DigestionHomozygous Homozygous MutantMutantHomozygous Homozygous Wild-typeWild-typeHeterozygo

23、teHeterozygoteDirection of ElectrophoresisPCR-RFLPSSCPPCRPCRATCGWildWildAmplify region of interestedDenature samples in Formamide or HeatATCGMutantMutantDenature samples in Formamide and HeatATCGATCGDNA molecules conformation depends on their sequenceRun on a Non-denaturing gel and look for mobility

24、 differencesWildWildMutanMutantSSCP点突变点突变 位于酶切位点上的点突变：位于酶切位点上的点突变：限制性酶切片段分析法限制性酶切片段分析法 不在酶切位点上的点突变：不在酶切位点上的点突变：单链构象多态性分析法单链构象多态性分析法(PCR-SSCP) 致病基因上的未知点突变：致病基因上的未知点突变： PCR-SSCP （单核苷酸多态性，（单核苷酸多态性，SNP）实时荧光定量PCR (Real-time PCR)常规定量PCR技术： 对PCRPCR扩增反应的终产物进行定量 重复性差 半定量实时定量PCR技术： 对PCRPCR扩增反应中每一个循环的产物进行 定量 实

25、时荧光定量PCR原理l在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。Ct 值是荧光定量PCR技术的一个很重要的概念 C代表Cycle，t代表threshold(荧光域值)。含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。 荧光化学 荧光定量荧光定量PCRPCR所使用的荧光化学可分为两种：所使用的荧光化学可分为两种： 荧光探针荧光探针 荧光染料荧光染料TaqMan荧光探针l与目标序列互补的与目标序列互补的寡核苷酸探针寡核苷酸探针l两端分别标记一个两端分别标记一个报告荧光基团报告荧光基团( (荧光素荧光素) )和一个和一个淬灭荧光淬灭荧光基团基团( (淬灭剂淬灭剂) )。l探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；lPCRPCR扩增时，扩增时，TaqTaq酶的酶的5 53 3外切酶外切酶活性将探针酶切降解，活