第7章蛋白质的分离、纯化和表征

1、第第7 7章蛋白质的分离、纯化章蛋白质的分离、纯化和表征和表征Protein Separation, Purification and CharacterizationOUTLINEnIonization of proteinIonization of proteinnProtein size and shapeProtein size and shapenProteinProteins colloid character and s colloid character and depositiondepositionnPrinciples of Protein purificationPri

2、nciples of Protein purificationnProtein content and purity Protein content and purity determinationdetermination因材施法，有的放矢因材施法，有的放矢Protein Purification and Protein Purification and CharacterizationCharacterization对蛋白质分子进行的各种研究，对蛋白质分子进行的各种研究，要建立在对蛋白质分子本身的性质（特别是区别于其它生要建立在对蛋白质分子本身的性质（特别是区别于其它生物与化学分子的独特的

3、性质）物与化学分子的独特的性质）和各种实验手段的原理和适用性深入了解的基础上。和各种实验手段的原理和适用性深入了解的基础上。蛋白蛋白质质大分大分子子半透半透膜膜小分小分子子小分小分子子Protein Purification and Protein Purification and CharacterizationCharacterizationn分离和纯化蛋白质的分离和纯化蛋白质的各种各种方法主要是利方法主要是利用蛋白质之间各种特性的差异，包括：用蛋白质之间各种特性的差异，包括：n分子的大小和形状分子的大小和形状n酸碱性质酸碱性质n溶解度溶解度n吸附性质吸附性质n对配体分子的特异生物学亲和力

4、对配体分子的特异生物学亲和力Protein Purification and Protein Purification and CharacterizationCharacterizationnThe aim of protein purification is to isolate one particular protein from all the others in the starting material, exploits利用: Solubility Size Charge Hydrophobicity or/and specific binding affinity of th

5、e protein of interestProtein Purification and Protein Purification and CharacterizationCharacterizationn.1 .1 蛋白质的酸碱性质蛋白质的酸碱性质nIonization of proteinIonization of proteinn对某一种蛋白质来说，在某一对某一种蛋白质来说，在某一pHpH，它所带的正，它所带的正电荷和负电荷恰好相等，也即净电荷为零，这电荷和负电荷恰好相等，也即净电荷为零，这一一pHpH称为蛋白质的称为蛋白质的等电点等电点 ( (isoelectric isoelect

6、ric point, pIpoint, pI) )。Ionization of proteinIonization of proteinn蛋白质的滴定曲线形状和等电点，在有中性盐存在下蛋白质的滴定曲线形状和等电点，在有中性盐存在下可以发生明显的变化。可以发生明显的变化。n蛋白质等电点在一定程度上决定于介质中离子的组成。蛋白质等电点在一定程度上决定于介质中离子的组成。n没有其他盐类干扰时，蛋白质质子供体基团解没有其他盐类干扰时，蛋白质质子供体基团解离出来的质子数与质子受体基团结合的质子数离出来的质子数与质子受体基团结合的质子数相等时的相等时的pHpH称为称为等离子点等离子点( (isoionic

7、 pointisoionic point) )。acid excess positive charge Cation exchangerisoelectric pointbalanced positive and negative chargealkalineexcess negative chargeAnion exchanger310pH_+Overall charge on proteinThe overall charge on a protein depends on pHIonization of proteinIonization of proteinn7.2 7.2 蛋白质分子

8、的大小与形状蛋白质分子的大小与形状nProtein size and shapeProtein size and shapen7.2.1 7.2.1 根据化学组成测定最低相对分子质量根据化学组成测定最低相对分子质量 铁的原子量铁的原子量n铁的百分含量铁的百分含量= = 100100 最低相对分子质量最低相对分子质量 铁的原子量铁的原子量n最低相对分子质量最低相对分子质量=100100铁的百分含量铁的百分含量 55.8例如，肌红蛋白相对分子质量=100 0.335 =16700 用其他物理化学法法测得的肌红蛋白Mr与此极为接近，可见肌红蛋白分子中只含一个铁原子。nProtein size and

9、 shapeProtein size and shape7.2.2 7.2.2 渗透压法测定相对分子质量渗透压法测定相对分子质量渗透与渗透压渗透与渗透压n渗透压法测定相对分子质量渗透压法测定相对分子质量n溶剂分子由纯溶剂（或稀溶液）向溶液（或浓溶液）单方向净移动现象称为渗透渗透(osmosis)(osmosis)。n渗透的结果，溶液内的体积增加，液面升高，直至达到一定的静水压力时维持平衡。这时的静水压力就是溶液在平衡浓度时的渗透压渗透压（osmotic pressure)osmotic pressure)。n渗透压渗透压是单位体积内溶质质点数的函数质点数的函数，而与溶质的性质和形状无关。n在浓

10、度不大时，渗透压与溶质的相对分子量的在浓度不大时，渗透压与溶质的相对分子量的关系为：关系为：n= RT(c/Mr + K c= RT(c/Mr + K c2 2 ) )nMr = RT/ lim/cMr = RT/ lim/cn c0 c0渗透压法测定相对分子质量渗透压法测定相对分子质量n7.2.3 7.2.3 蛋白质的扩散和扩散系数蛋白质的扩散和扩散系数n扩散（扩散（diffusiondiffusion）ndm/dt =-DA dc/dxdm/dt =-DA dc/dxnD D 扩散系数，扩散系数， A A 扩散面积扩散面积n扩散系数随扩散系数随MrMr的增加而降低。的增加而降低。n但扩散系

11、数对但扩散系数对MrMr的变化并不敏感，一般不单独的变化并不敏感，一般不单独用来确定用来确定MrMr。n7.2.4 7.2.4 沉降分析法测定相对分子质量沉降分析法测定相对分子质量n蛋白质溶液在受到蛋白质溶液在受到强大的离心力强大的离心力作用时，如果蛋白质作用时，如果蛋白质的密度大于溶液的密度，蛋白质分子就会沉降。的密度大于溶液的密度，蛋白质分子就会沉降。n沉降的速率与蛋白质分子大小和密度有关，而且与分沉降的速率与蛋白质分子大小和密度有关，而且与分子形状、溶液的密度和粘度有关。子形状、溶液的密度和粘度有关。n沉降速率法沉降速率法n沉降平衡法沉降平衡法沉降分析法测定相对分子质量沉降分析法测定相对

12、分子质量n离心机离心机n转速转速 60 000-80 000rpm60 000-80 000rpm（rotation per rotation per minute minute ）n离心力离心力 400 00- 700 000g400 00- 700 000g沉降分析法测定相对分子质量沉降分析法测定相对分子质量离心力离心力 442 2 v v 2 2 r r F = - F = - g gF :F :离心力，单位以地心引力的倍数离心力，单位以地心引力的倍数g g表示（即表示（即g g 或或g g）g :g :重力加速度，等于重力加速度，等于980.6 cm980.6 cm2 2/s/s2 2

13、. .r : r : 通常指自离心管中轴底部内壁到离心转轴中心之间通常指自离心管中轴底部内壁到离心转轴中心之间的距离（的距离（cmcm）v v : :为转速，即离心机每秒的转数，若以每分钟转数为转速，即离心机每秒的转数，若以每分钟转数（rpmrpm）表示，则上式应为）表示，则上式应为 442 2 v v 2 2 r r F = - F = - （1/601/60）2 2 g gn7.2.4.1 7.2.4.1 沉降速率法沉降速率法n沉降界面沉降界面n当分子颗粒以恒定速度移动时，净离心力与摩擦力的当分子颗粒以恒定速度移动时，净离心力与摩擦力的关系：关系：nF Fc c- F- Fb b= F=

14、Ff fn dx/dt m dx/dt mp p(1-)(1-)n = = n 2 2 f fn dx/dtdx/dtn s= s= n 2 2n单位离心场的沉积速度是个定值，称为单位离心场的沉积速度是个定值，称为沉降系沉降系数数（sedimentation coefficient)sedimentation coefficient)或或沉降常沉降常数数。n蛋白质、核酸、核糖体和病毒的沉降系数介于蛋白质、核酸、核糖体和病毒的沉降系数介于1 11010-13-13 到到20020010 10 - - 1313 秒的范围。秒的范围。n10 10 - - 1313 秒作为一个单位，斯维得贝格单位或沉

15、降系数秒作为一个单位，斯维得贝格单位或沉降系数单位，即单位，即S S。沉降分析法测定相对分子质量沉降分析法测定相对分子质量n7.2.4.2 7.2.4.2 沉降平衡法沉降平衡法n利用沉降平衡法测定相对分子质量是在较低速度利用沉降平衡法测定相对分子质量是在较低速度（8000 -20000r/min8000 -20000r/min）的离心场中进行的。）的离心场中进行的。n蛋白质的沉降平衡蛋白质的沉降平衡（图7-3）沉降分析法测定相对分子质量沉降分析法测定相对分子质量n在时间在时间dtdt内浓度为内浓度为c c的溶液越过横截面的溶液越过横截面A A的溶质量：的溶质量： dm=-cA dx/dt dt

16、dm=-cA dx/dt dtn因此扩散作用沿相反方向越过横截面因此扩散作用沿相反方向越过横截面A A的溶质量：的溶质量： dmdm=- DA dc/dx dt=- DA dc/dx dt沉降沉降分析分析法测法测定相定相对分对分子质子质量量n当净离心力与扩散力平衡时，在离心池内从液当净离心力与扩散力平衡时，在离心池内从液面到液底形成一个由低到高的恒定浓度梯度，面到液底形成一个由低到高的恒定浓度梯度，因此：因此：n 2RTdln(c2 / c1)nMr = n (1-) 2(x22-x12)沉降分析法测定相对分子质量沉降分析法测定相对分子质量n7.2.5 7.2.5 凝胶过滤法测定相对分子质量凝

17、胶过滤法测定相对分子质量nGel filtration chromatographyGel filtration chromatographyn凝胶过滤法的原理凝胶过滤法的原理Gel filtration chromatographyGel filtration chromatographynSize exclusion chromatography n Molecular sieve（筛子）（筛子） chromatography Molecules are separated on the basis of their size and shape. The protein sample i

18、n a small volumes is applied to the top of a column of porous(有孔的有孔的) beads that are made of an insoluble but highly hydrated （亲水的亲水的）polymer such as polyacrylamide (Bio-Gel) or the carbohydrates dextran （葡聚糖（葡聚糖 ）(Sephadex) or agarose (琼脂糖琼脂糖) (Sepharose) Small molecules can enter the pores in the

19、beads whereas larger or more elongated molecules cannot. The smaller molecules therefore have a larger volume of liquid accessible （可达到的，可接近（可达到的，可接近的）的） to them; both the liquid surrounding the porous heads and that inside the beads. In contrast, the larger molecules have only the liquid surroundin

20、g the beads accessible to them, and thus move through the column faster, emerging out of the bottom (eluting洗脱洗脱) first. The smaller molecules move more slowly through the column and elute later.层析柱的洗脱体积与分子量的关系：层析柱的洗脱体积与分子量的关系：Ve=K1-K2lgM凝凝胶胶过过滤滤法法测测定定相相对对分分子子质质量量lgn7.2.6 SDS7.2.6 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定聚丙烯

21、酰胺凝胶电泳法测定 相对分子质量相对分子质量SDSSDS， 有效变性剂，带负电荷有效变性剂，带负电荷巯基乙醇，巯基乙醇，打开二硫键打开二硫键蛋白质亚基在电场中的行为只与分子大小有关。蛋白质亚基在电场中的行为只与分子大小有关。nR Rf f = = K K1 1- -K K2 2 lg lg M MMarkerElectrophoresis of ProteinnIn polyacrylamide( (聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺) ) gel electrophoresis (PAGE) proteins are applied to a porous(可渗透的，多孔的可渗透的，多孔的) polyac

22、rylamide gel and separated in an electric field on the basis of their net negative charge and their size. nSmall/more negatively-charged proteins migrate further through the gel than larger/less negatively-charged proteinsn7.3 7.3 蛋白质的胶体性质蛋白质的胶体性质 与蛋白质的沉淀与蛋白质的沉淀ProteinProteins colloid character and

23、depositions colloid character and deposition n7.3.1 7.3.1 蛋白质的胶体性质蛋白质的胶体性质n蛋白质溶液是一个分散系统蛋白质溶液是一个分散系统n分散相质点 100nm的为悬浊液，n 介于1-100nm的为胶体溶液。Protein colloid character and depositionProtein colloid character and depositionn胶体系统的稳定条件：胶体系统的稳定条件：n1 1 分散相质点的大小分散相质点的大小n2 2 分散相质点带有同种电荷分散相质点带有同种电荷n3 3 分散相质点能与溶剂形成

24、溶剂化层分散相质点能与溶剂形成溶剂化层+ + + +n每克蛋白质分子能结合每克蛋白质分子能结合0.3-0.50.3-0.5克水。克水。n蛋白质溶液具有：丁达尔效应，布朗运动及蛋白质溶液具有：丁达尔效应，布朗运动及 不能通过半透膜的性质。不能通过半透膜的性质。Protein colloid character and depositionProtein colloid character and depositionThe hydrophobic and hydrophilic parts on the surface of proteinProtein colloid character an

25、d depositionProtein colloid character and depositionn7.3.2 7.3.2 蛋白质的沉淀蛋白质的沉淀n沉淀蛋白质的方法沉淀蛋白质的方法 ：n1 1）盐析法）盐析法n 盐析一般不引起蛋白质的变性盐析一般不引起蛋白质的变性n2 2）有机溶剂沉淀法）有机溶剂沉淀法 脱去水化层及降低介电常数脱去水化层及降低介电常数( (酒精，丙酮酒精，丙酮) )n3 3）重金属盐沉淀法）重金属盐沉淀法 生成不溶性的复合物生成不溶性的复合物n4 4）生物碱试剂和某些酸类沉淀法）生物碱试剂和某些酸类沉淀法 单宁酸，三氯醋酸，磺基水杨酸和硝酸单宁酸，三氯醋酸，磺基水杨酸

26、和硝酸n5 5）加热变性沉淀法）加热变性沉淀法n7.4 7.4 蛋白质分离纯化的一般原则蛋白质分离纯化的一般原则nPrinciples of Protein purificationPrinciples of Protein purification n蛋白质分离纯化的程序包括：蛋白质分离纯化的程序包括：n1 1）前处理）前处理n2 2）粗分级分离）粗分级分离n3 3）细分级分离）细分级分离n4 4）结晶）结晶n7.5 7.5 蛋白质的分离纯化方法蛋白质的分离纯化方法nMethods of Protein Purification Methods of Protein Purification

27、 n根据蛋白质在溶液中性质的分离纯化方法：根据蛋白质在溶液中性质的分离纯化方法：n1 1）分子大小）分子大小n2 2）溶解度）溶解度n3 3）电荷）电荷n4 4）吸附性质）吸附性质n5 5）对配体分子的生物学亲和力）对配体分子的生物学亲和力n7.5.1 7.5.1 根据分子大小不同的纯化方法根据分子大小不同的纯化方法n7.5.1.1 7.5.1.1 透析和超过滤透析和超过滤n常用的半透膜是玻璃纸或称赛璐玢纸。n透析装置透析装置n利用压力和离心力的超过滤装置利用压力和离心力的超过滤装置Methods of Protein PurificationMethods of Protein Purifi

28、cationMethods of Protein PurificationMethods of Protein Purification大分子大分子膜膜小分子小分子小分子小分子蛋蛋白白质质的的分分离离纯纯化化方方法法n密度梯度（区带）离心法密度梯度（区带）离心法n蛋白质颗粒的沉降不仅决定于它的大小大小，而且也决定于它的密度密度。Methods of Protein PurificationMethods of Protein PurificationMethods of Protein PurificationMethods of Protein Purification凝胶过滤凝胶过滤 ge

29、l filtration chromatographygel filtration chromatography1903-1906，M. Tswett 将叶将叶绿 素 的 石 油 醚 溶 液 通 过绿 素 的 石 油 醚 溶 液 通 过CaCO3管柱，并继续以石油管柱，并继续以石油醚淋洗，由于醚淋洗，由于CaCO3对叶绿对叶绿素中各种色素的吸附能力不素中各种色素的吸附能力不同，色素被逐渐分离，在管同，色素被逐渐分离，在管柱中出现了不同颜色的谱带，柱中出现了不同颜色的谱带，所以称色谱图。所以称色谱图。Methods of Protein PurificationMethods of Protei

30、n PurificationnGel Filtration ChromatographyGel Filtration Chromatographyn也称：也称： 凝胶过滤层析 分子排阻层析 凝胶渗透层析 分子筛层析Gel Filtration ChromatographyGel Filtration Chromatographyn常使用的凝胶有：常使用的凝胶有：n交联葡聚糖（交联葡聚糖（Sephadex）n聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶(Bio-gel P)n琼脂糖琼脂糖 (Sepharose Bio-gel A)n凝胶的交联度和孔度（网孔大小）决定了凝胶的分离分级范围nGel Filtrati

31、on ChromatographyGel Filtration Chromatographyn凝胶过滤的原理：凝胶过滤的原理：n当不同分子大小的蛋白质流经凝胶层析柱时，当不同分子大小的蛋白质流经凝胶层析柱时，比凝胶孔径大的分子比凝胶孔径大的分子不能进入珠内网状结构，不能进入珠内网状结构，而被排阻在凝胶珠之外随着溶剂在凝胶珠之间而被排阻在凝胶珠之外随着溶剂在凝胶珠之间的空隙向下移动并最先流出柱外的空隙向下移动并最先流出柱外n比网孔小的分子比网孔小的分子能不同程度地自由出入凝胶珠能不同程度地自由出入凝胶珠的内外的内外n这样由于不同大小分子所经过的路径不同而得这样由于不同大小分子所经过的路径不同而得

32、到分离到分离凝凝胶胶过过滤滤柱层析的基本装置柱层析的基本装置ColumnColumn 蛋蛋白白质质的的分分离离纯纯化化方方法法 层析柱通常是玻璃层析柱通常是玻璃的。总的说来，长的。总的说来，长柱分辨率高。但大柱分辨率高。但大量物质的处理则用量物质的处理则用粗的柱比较适宜。粗的柱比较适宜。ColumnColumn蛋蛋白白质质的的分分离离纯纯化化方方法法n凝胶过滤的术语:V Vt t 凝胶柱床的总（床）体积凝胶柱床的总（床）体积V Ve e 洗脱体积洗脱体积V V0 0 孔隙体积，外水体积孔隙体积，外水体积V Vi i 内水体积内水体积V Vm m 凝胶基质体积凝胶基质体积 V Vt = t =

33、V Vi i +V+V0 0 + + V Vm m蛋蛋白白质质的的分分离离纯纯化化方方法法Gel Filtration ChromatographyGel Filtration Chromatographyn7.5.2 7.5.2 利用溶解度差别的纯化方法利用溶解度差别的纯化方法n7.5.2.1 7.5.2.1 等电点沉淀和等电点沉淀和pHpH控制控制蛋蛋白白质质的的分分离离纯纯化化方方法法利用溶解度差别的纯化方法利用溶解度差别的纯化方法n7.5.2.2 7.5.2.2 蛋白质的盐溶和盐析蛋白质的盐溶和盐析n盐溶：少量盐促进蛋白质溶解的现象盐溶：少量盐促进蛋白质溶解的现象n盐析：大量盐使得蛋白

34、质沉淀的现象盐析：大量盐使得蛋白质沉淀的现象n盐析作用盐析作用n 大量中性盐的加入使水的活度降低，原来溶液中的大部分甚至全部的自由水转变为盐离子的水化水n 那些被迫与蛋白质表面的疏水基团接触并掩盖它们的水分子成为下一步最自由地可利用的水分子，因此被移去以溶剂化盐离子，留下暴露出来的疏水基团n 随着盐浓度的增加，蛋白质疏水表面进一步暴露，由于疏水作用蛋白质聚集而沉淀n 最先聚集的蛋白质是表面上疏水残基最多的蛋白质。蛋蛋白白质质的的分分离离纯纯化化方方法法n利用溶解度差别的纯化方法利用溶解度差别的纯化方法n7.5.2.3 7.5.2.3 有机溶剂分级分离法有机溶剂分级分离法n与水互溶的有机溶剂（如

35、甲醇，乙醇和丙酮等）与水互溶的有机溶剂（如甲醇，乙醇和丙酮等）能使蛋白质在水中的溶解度显著降低。室温下，能使蛋白质在水中的溶解度显著降低。室温下，有机溶剂不仅能引起蛋白质沉淀，而且伴随着变有机溶剂不仅能引起蛋白质沉淀，而且伴随着变性。性。n控制有机溶剂浓度也可以分离纯化蛋白质。控制有机溶剂浓度也可以分离纯化蛋白质。n有机溶剂引起蛋白质沉淀的主要原因之一是改变有机溶剂引起蛋白质沉淀的主要原因之一是改变了介质的介电常数。了介质的介电常数。n介电常数的降低将增加两个相反电荷之间的引力。介电常数的降低将增加两个相反电荷之间的引力。蛋蛋白白质质的的分分离离纯纯化化方方法法利用溶解度差别的纯化方法利用溶解

36、度差别的纯化方法n7.5.2.4 温度对蛋白质溶解度的影响温度对蛋白质溶解度的影响n在一定温度范围内，约在一定温度范围内，约 0-40 0-40 之间，大部分之间，大部分球状蛋白的溶解度随温度升高而增加。球状蛋白的溶解度随温度升高而增加。n人的血红蛋白从人的血红蛋白从0-250-25，溶解度随温度上升而上升，溶解度随温度上升而上升。蛋蛋白白质质的的分分离离纯纯化化方方法法利用溶解度差别的纯化方法利用溶解度差别的纯化方法脲或盐酸胍的变性作用脲或盐酸胍的变性作用n7.5.3 根据电荷不同的纯化方法根据电荷不同的纯化方法n7.5.3.1 电泳电泳 ElectrophoresisElectrophor

37、esis n在外电场作用下，带电颗粒，如不处于等电在外电场作用下，带电颗粒，如不处于等电点的蛋白质分子，将向着与其电性相反的电点的蛋白质分子，将向着与其电性相反的电极移动，这种现象称为电泳极移动，这种现象称为电泳蛋蛋白白质质的的分分离离纯纯化化方方法法ElectrophoresisElectrophoresisn区带电泳(zone electrophoresis)可分四类：na 滤纸电泳和薄膜电泳；nb 粉末电泳；nc 细丝电泳；nd 凝胶电泳，适于分离蛋白质和多核苷酸、核 酸。v电泳装置主要包括两个部分：电源电泳装置主要包括两个部分：电源( (电泳仪）和电电泳仪）和电泳槽。泳槽。v电源提供直

38、流电，在电泳槽中产生电场，驱动带电电源提供直流电，在电泳槽中产生电场，驱动带电分子的迁移。分子的迁移。ElectrophoresisElectrophoresis蛋蛋白白质质的的分分离离纯纯化化方方法法蛋蛋白白质质的的分分离离纯纯化化方方法法ElectrophoresisElectrophoresisn7.5.3.2 7.5.3.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳nPolyacrylamide Gel ElectrophoresisPolyacrylamide Gel Electrophoresisn(PAGE)(PAGE)n有时用不连续的胶（浓缩胶与分离胶）有时用不连续的胶（浓缩胶与分

39、离胶）n不连续的聚丙烯酰胺凝胶电泳有不连续的聚丙烯酰胺凝胶电泳有3 3种物理作用：种物理作用： 1.1.样品的浓缩效应样品的浓缩效应 2.2.分子筛效应分子筛效应 3.3.电荷效应电荷效应蛋蛋白白质质的的分分离离纯纯化化方方法法 n孔径不连续性n缓冲体系离子成分及pH值的不连续性（前导离子CI-,尾随离子Gly）n电位梯度的不连续性浓缩效应：浓缩效应：Polyacrylamide Gel Electrophoresis Polyacrylamide Gel Electrophoresis (PAGE)(PAGE)nThe greater the net charge the faster th

40、e molecule will move.n In PAGE the electrophoretic separation is carried out in a gel which serves as a molecular sieve.n Small molecules move readily through the pores in the gel, whereas larger molecules are retarded.nThe pore sizes in the gel can be controlled by choosing appropriate concentratio

41、ns of acrylamide（丙烯酰胺）（丙烯酰胺） and the cross-linking reagent, methylene bisacrylamide（甲叉双丙烯酰胺）（甲叉双丙烯酰胺）.nThe higher the concentration of acrylamide used , the smaller the pores size in the final gel.SDS-PAGE原理原理蛋蛋白白质质的的分分离离纯纯化化方方法法Acrylamid 丙烯酰胺丙烯酰胺N,Nmethylenebisacrylamide N，N-甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺v聚丙烯酰胺凝胶的

42、孔径可以通过改变丙烯酰胺和甲叉聚丙烯酰胺凝胶的孔径可以通过改变丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的浓度来控制，丙烯酰胺的浓度可以在双丙烯酰胺的浓度来控制，丙烯酰胺的浓度可以在3 33030之间。之间。v低浓度的凝胶具有较大的孔径，如低浓度的凝胶具有较大的孔径，如3-43-4的聚丙烯酰胺的聚丙烯酰胺凝胶对蛋白质没有明显的阻碍作用，可用于等电聚焦凝胶对蛋白质没有明显的阻碍作用，可用于等电聚焦或作为或作为PAGEPAGE电泳的浓缩胶，也可以用于分离电泳的浓缩胶，也可以用于分离DNADNA。v高浓度凝胶具有较小的孔径，对蛋白质有分子筛的作高浓度凝胶具有较小的孔径，对蛋白质有分子筛的作用，用， 可以用于根据蛋白质

43、的分子量进行分离的电泳中，可以用于根据蛋白质的分子量进行分离的电泳中，如如10102020的凝胶常用于的凝胶常用于PAGEPAGE电泳的分离胶。电泳的分离胶。SDS-PAGESDS-PAGE原理原理蛋蛋白白质质的的分分离离纯纯化化方方法法SDS-PAGESDS-PAGEnIn sodium dodecyl sulfate (SDS)-PAGE, the proteins are denatured and coated with an overall negative charge (due to bound SDS) and thus the basis for their separati

44、on is only their massSDS-PAGESDS-PAGEnThe protein mixture is first treated with a reducing agent such as 2-mercaptoethanol（巯基乙醇）巯基乙醇） or dithiothreitol（二硫叔糖醇）（二硫叔糖醇） to break all the disulfide bonds. nThe strong anionic detergent SDS is then added which disrupts nearly all the noncovalent interactio

45、ns in the protein, unfolding the polypeptide chain.SDS-PAGESDS-PAGEnApproximately one molecule of SDS binds via its hydrophobic alkyl（烷基）（烷基） chain to the polypeptide backbone for every two amino acid residues, which gives the denatured protein a large net negative charge that is proportional(成比成比例例

46、 的的) to its mass 蛋蛋白白质质的的分分离离纯纯化化方方法法n7.5.3.3 7.5.3.3 毛细管电泳毛细管电泳 Capillary ElectrophoresisCapillary Electrophoresisn电泳是在微内径管（一般为电泳是在微内径管（一般为50um50um内径和内径和300um300um外径）内进行的外径）内进行的. .n一般管长一般管长5050100 cm100 cm，电压，电压101050 kV50 kV，时间，时间101030 min30 min。蛋蛋白白质质的的分分离离纯纯化化方方法法Capillary ElectrophoresisCapill

47、ary Electrophoresisn虽然被分析样品因电泳迁移而分离，然而虽然被分析样品因电泳迁移而分离，然而电电渗作用渗作用(electroendosmosis)(electroendosmosis)使他们向负使他们向负极移动。由于电渗流很强，其速度一般比样品极移动。由于电渗流很强，其速度一般比样品的电泳速度大，因此所有的正、负离子和中性的电泳速度大，因此所有的正、负离子和中性分子都被推向负极。分子都被推向负极。/ 蛋蛋白白质质的的分分离离纯纯化化方方法法蛋蛋白白质质的的分分离离纯纯化化方方法法Capillary ElectrophoresisCapillary Electrophores

48、isn7.5.3.4 7.5.3.4 等电聚焦等电聚焦n（isoelectric focusing, IEFisoelectric focusing, IEF）n等电聚焦或称电聚焦等电聚焦或称电聚焦(electric focusing,EF)(electric focusing,EF) 两性电解质两性电解质 pHpH梯度梯度蛋蛋白白质质的的分分离离纯纯化化方方法法The principle of isoelectric focusingThe principle of isoelectric focusing 在在IEFIEF的电泳中，具有的电泳中，具有pHpH梯度的介质其分布是从阳极到阴极，

49、梯度的介质其分布是从阳极到阴极，pHpH值逐渐增大。值逐渐增大。 蛋白质分子具有两性解离及等电点的特征，这样在碱性区域蛋白质分子具有两性解离及等电点的特征，这样在碱性区域蛋白质分子带负电荷，向阳极移动，直至某一蛋白质分子带负电荷，向阳极移动，直至某一pHpH位点时失去电荷位点时失去电荷而停止移动，此处介质的而停止移动，此处介质的pHpH恰好等于聚焦蛋白质分子的等电点。恰好等于聚焦蛋白质分子的等电点。 同理，位于酸性区域的蛋白质分子带正电荷向阴极移动，直同理，位于酸性区域的蛋白质分子带正电荷向阴极移动，直到它们的等电点上聚焦为止。到它们的等电点上聚焦为止。 在电场内经过一定时间后，等电点不同的蛋

50、白质混合物的各在电场内经过一定时间后，等电点不同的蛋白质混合物的各组分将分别聚焦在各自等电点相应的组分将分别聚焦在各自等电点相应的pHpH位置上，形成分离的蛋白位置上，形成分离的蛋白质区带。质区带。 蛋蛋白白质质的的分分离离纯纯化化方方法法The principle of isoelectric focusingThe principle of isoelectric focusing蛋蛋白白质质的的分分离离纯纯化化方方法法The apparatus of isoelectric focusingThe apparatus of isoelectric focusing蛋蛋白白质质的的分分离离

51、纯纯化化方方法法Application of Application of isoelectric focusingisoelectric focusing1 1分离等电点不同的蛋白质。分离等电点不同的蛋白质。2 2测定某个未知蛋白质的等电点。测定某个未知蛋白质的等电点。3 3研究蛋白质微观不均一性。研究蛋白质微观不均一性。4 4. . 蛋白质纯化制备。蛋白质纯化制备。 5 5用于用于IEF/SDS-PAGEIEF/SDS-PAGE双向电泳。双向电泳。 蛋蛋白白质质的的分分离离纯纯化化方方法法The principle of isoelectric focusingThe principle

52、of isoelectric focusingnIsoelectric focusing electrophoretically separates proteins on the basis of their relative content of positively and negatively charged groups. When a protein is at its pI, its net charge is zero and hence it will not move in an electric fieldThe principle of isoelectric focu

53、singThe principle of isoelectric focusingnIn isoelectric focusing, a polyacrylamide gel is used which has large pores and contains a mixture of polyampholytes (small multicharged polymer that have many pI values). If an electric field is applied to the gel, the polyampholytes migrate and produce a p

54、H gradient. Each protein will migrate through the gel until it reaches a position at which the pH is its pI .双向电泳（双向电泳（2-DE2-DE）与蛋白质组学）与蛋白质组学Two-dimensional gel electrophoresis Two-dimensional gel electrophoresis and proteomicsand proteomics蛋白质组学蛋白质组学不是一个封闭的、概念化的、稳定的不是一个封闭的、概念化的、稳定的知识体系知识体系,而是一个领域。而

55、是一个领域。它旨在阐明生物体全部蛋白质的它旨在阐明生物体全部蛋白质的表达模式表达模式及及功能功能模式模式，其内容包括蛋白质的定性鉴定、定量检测、，其内容包括蛋白质的定性鉴定、定量检测、细胞内定位、相互作用研究等，是连接基因组细胞内定位、相互作用研究等，是连接基因组序列与基因功能之间的桥梁。序列与基因功能之间的桥梁。 蛋蛋白白质质的的分分离离纯纯化化方方法法双向电泳（双向电泳（2-DE）低氧蛋白质组的低氧蛋白质组的2-D电泳图电泳图 蛋蛋白白质质的的分分离离纯纯化化方方法法n7.5.3.6 7.5.3.6 离子交换层析离子交换层析（Ion Exchange Chromatography，IEC）

56、蛋蛋白白质质的的分分离离纯纯化化方方法法Ion Exchange ChromatographynIn ion exchange chromatography, proteins are separated on the basis of their overall (net) charge.nIf a protein has a net negative charge at pH7,it will bind to a column containing positively-charged beads, whereas a protein with no charge or a net pos

57、itive charge will not bind nThe negatively-charged proteins bound to such a column can then be eluted by washing the column with an increasing gradient (increasing concentration) of a solution of sodium chloride (Na+ Cl- ions) at the appropriate pH.Ion Exchange ChromatographynThe Cl- ion compete wit

58、h the protein for the positively-charged groups on the columnnProteins having a low density of negative charge elute first, followed by those with a higher density of negative charge.Ion Exchange Chromatography 离子交换层析是以离子交换层析是以离子交换剂离子交换剂为为固定相固定相，依据流动相中的依据流动相中的不同带电组分不同带电组分与交换剂上的平与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的能力的

59、差别（与离子衡离子进行可逆交换时的能力的差别（与离子交换剂结合力的差别）而进行分离的一种层析交换剂结合力的差别）而进行分离的一种层析方法。方法。 离子交换层析是生物化学领域中常用的离子交换层析是生物化学领域中常用的一种层析方法，广泛的应用于各种生化物质如一种层析方法，广泛的应用于各种生化物质如氨基酸、蛋白、糖类、核苷酸氨基酸、蛋白、糖类、核苷酸等的分离纯化。等的分离纯化。蛋蛋白白质质的的分分离离纯纯化化方方法法Ion Exchange Chromatographyn纤维素离子交换剂纤维素离子交换剂n交联葡聚糖离子交换剂交联葡聚糖离子交换剂n盐浓度的微小变化就会直接影响它对蛋白质电盐浓度的微小变

60、化就会直接影响它对蛋白质电荷吸附容量。荷吸附容量。 因此，蛋白质混合物的分离可以由改变溶液因此，蛋白质混合物的分离可以由改变溶液中的盐离子强度和中的盐离子强度和pHpH来完成。来完成。 梯度混合器梯度混合器蛋蛋白白质质的的分分离离纯纯化化方方法法Ion Exchange Chromatography离子交换层析的原理n离子交换层析是依据各种离子或离子化合物与离子交换剂离子交换层析是依据各种离子或离子化合物与离子交换剂的结合力不同而进行分离纯化的。的结合力不同而进行分离纯化的。n离子交换层析的固定相是离子交换剂，它是由一类不溶于离子交换层析的固定相是离子交换剂，它是由一类不溶于水的惰性高分子聚合