仅供参考~分子生物学复习

1、第二章 染色体与DNA（一）真核细胞染色体与原核细胞染色体的主要区别：比较项目真核细胞染色体原核细胞染色体数量多一般只有一条位置位于细胞核的核仁位于拟核组成方式真核染色体的DNA与蛋白质完全融合在一起原核染色体外裹着稀疏的蛋白质（二）原核生物与真核生物基因组的特点原核生物：1.结构简练；2.存在转录单元：多顺反子；3.有重叠基因真核生物:1. 含有大量重复序列：不重复序列：只有一个或几个拷贝，多为结构基因，功能基因中度重复序列：重复101000个拷贝，rRNA、tRNA及一些结构基因。高度重复序列：卫星DNA、反向重复序列等，不转录。 2.功能DNA序列大多被非功能DNA所隔开（外显子和内含子

2、）3.存在C值矛盾（三） 染色体的组装1.核小体的组成成分？由核心组蛋白H2A、H2B、H3和H4各两分子生成的八聚体和由200bp的DNA组成。 2.核小体是如何一步一步组装成染色体的？整个过程中的压缩情况如何？ 形成核小体后,其长度被压缩了7倍形成螺线管后,DNA长度又被压缩了6倍由螺线管形成超螺线管后,DNA的长度又被压缩了40倍形成染色单体后,DNA的长度又被压缩了5倍。因此由一条DNA长链,经过多级螺旋化,可以使几厘米长的DNA与组蛋白等物质共同形成几微米长的染色体,其长度总共被压缩了800010000倍。 （四）DNA复制的几个基本原则1.半保留复制：DNA生物合成时，母链DNA双

3、螺旋结构解开而成为单链，各自作为模板，按照碱基互补原则，合成与模板互补的子链。这样子代细胞的DNA双链，其中一股单链是从亲代完整地接受过来的，另一股单链则完全重新合成，两个子细胞的DNA都与亲代DNA碱基序列一致2.半不连续复制：在DNA复制过程中，亲代DNA分子中以3 5方向的母链作为模板指导新的链以5 3 方向连续合成，另一股以5 3 为方向的母链则指导新合成的链以 5 3方向合成10002000个核苷酸长度的许多不连续的片段（岗崎片段），这种复制方式称之为半不连续复制。冈崎片段：DNA复制时，一股以5 3方向的母链作为模板，指导新合成的链沿5 3合成10002000个核苷酸不连续的小片段

4、称之为岗崎片段。岗崎片段由DNA连接酶连成一条完整的新链。前导链：DNA复制时，一股以3 5方向的母链作为模板，指导新合成的链以5 3方向连续合成的链称为前导链。（复制方向与解链方向一致）随从链：DNA复制时，一股以5 3方向的母链作为模板，指导新合成的链沿5 3合成，10002000个核苷酸不连续的小片段的链称为随从链。（复制方向与解链方向相反)3.RNA引物：提供3-OH，减少突变，提高DNA复制的真实性4.复制的真实性的保证：DNA的半保留复制；遵守严格的碱基配对规律；复制出错时有即时的校读功能(3 5外切酶功能）；DNA损伤的修复机制；RNA引物（DNA复制开始时掺入的核苷酸往往容易出

5、错，加在RNA引物中可以被切除，不会影响DNA的准确性 ）（一）DNA复制过程（原核生物为例，掌握过程）（起始、延长、终止）1.确定复制的起始点复制有固定的起始点，称为ori；oriC的跨度为245 bp，有特定的碱基顺序3组串联重复序列识别区；2对反向重复序列AT rich区（容易解链）2.解开双链DNA,提供单链DNA模板DNA解成单链，提供模板形成引发体及合成引物提供3-OH末端解链过程：由拓扑异构酶I的作用下解开负超螺旋，并与解链酶共同作用，在复制起点处解开双链；SSB在一定时间内使复制叉保持适当长度，稳定解开的单链。3.形成复制叉：复制时，双链DNA要解开成两股链分别进行，所以，这个

6、复制起点呈现叉子的形式，被称为复制叉。4.DNA合成的起始和延长：DNA合成的起始：拓扑异构酶松驰螺旋引发体和引物：复制过程需要引物 短链RNA；引发前体与六种蛋白质结合在一起，并与引发酶共同形成引发体。在适当位置上，引物酶依据模板的碱基序列，从5 ® 3 方向催化NTP聚合，生成短链RNA引物DNA-pol 催化下，引物的3-OH末端与新链的第一个dNTP形成磷酸二酯键，开始复制。复制的延长：指在DNA-pol的催化下，以母代单链DNA为模板，按照碱基互补原则，dNTP以dNMP的方式逐个加入而延长子代DNA新链，其化学反应的本质是生成磷酸二酯键。5.形成带有新合成的DNA片段的复

7、制泡6.复制的终止：去除RNA引物DNA聚合酶的小片段5 3外切酶补充空缺DNA聚合酶的大片段3 5外切酶； 5 3聚合酶连接DNA连接酶 （二）解开成单链的过程中，拓扑异构酶、解旋酶和单链结合蛋白分别起什么作用？ 1拓扑异构酶I：切断DNA单链和解旋后或再螺旋后连接，作用是松解负超螺旋。主要集中在活性转录区，与转录有关。 拓扑异构酶II：切断DNA双链和解旋后或再螺旋后连接，作用是将负超螺旋引入DNA分子，同复制有关。2解旋酶：解开DNA双链，每个bp消耗2个ATP3单链结合蛋白（SSB）：与单链DNA结合,维持单链状态 ，使其不受核酸酶水解，避免单链DNA自身发夹螺旋形成，使前端螺旋易解开

8、。复制叉：复制时，双链DNA要解开成两股链分别进行，所以，这个复制起点呈现叉子的形式，被称为复制叉复制子：DNA的复制是由固定的起始点开始的。一般把生物体的复制单位称为复制子。一个复制子只含一个复制起点。无论是原核生物还是真核生物，DNA的复制主要是从固定的起始点以双向等速复制方式进行的。 线性DNA双链的复制和环状DNA双链的复制的常见复制类型 （三）大肠杆菌的DNA聚合酶I和III的特点DNA聚合酶IDNA聚合酶III多功能酶 53外切酶53外切酶53聚合酶多功能酶53聚合酶 35外切酶单链多肽大小二个片段不对称二聚体切除RNA引物，填补空缺损伤后修复DNA 复制的主要酶高续进性高聚合酶活

9、性高产物真实性端粒： 位于真核生物染色体末端（一条链的3¢-OH），由蛋白质和DNA（人类：“TTAGGG”重复序列）紧密结合的结构。特征: 3端是由数百个串联重复G丰富的6个核苷酸组成端粒酶（唯一携带RNA模板的逆转录酶）：防止端粒缩短的酶，能不断地延长染色体末端已缩短的端粒，由蛋白质(DNA聚合酶)+RNA(合成端粒DNA的模板)组成。端粒复制过程：本身提供RNA模板，再逆转录，延长母链，然后反皱-爬行模型（四）DNA的损伤修复1. DNA损伤原因：复制错误、DNA重组、物理化学因子损伤部位：碱基、戊糖或是磷酸二酯键2DNA损伤修复的类型：错配修复、碱基切除修复、核苷酸切除修复、

10、DNA直接修复DNA转座：一段DNA顺序可以从原位上单独复制或断裂下来，环化后插入另一位点，并对其后的基因起调控作用，此过程称转座。这段序列称跳跃基因或转座子。麦克林托克(B. McClintock)因首先在玉米中发现转座因子而获得了1983年诺贝尔医学奖。转座子的种类：插入序列、类插入序列、复合转座子、 TnA家族 第三章 生物信息的传递(上) 转录（从DNA-RNA）基本概念：转录：生物体以DNA的一条链为模板，按照碱基配对原则，在依赖DNA的RNA聚合酶的作用下合成一条与DNA链的一定区段互补的RNA链，这个过程称为转录。编码链：与RNA序列相同的那条DNA链，又称正(+) 链、有意义链

11、模板链：指导RNA合成的DNA链称，又称负(-)链 、反意义链不对称转录：在多基因的双链DNA分子中，每个基因的模板不是全在同一条链上，也就是在双链DNA分子中的一条链，对于某基因是有义链，但对另一个基因则可能是反义链。这就是我们所说的不对称转录，即模板链并非永远在同一条单链上。不对称转录。它有两方面含义：一是在DNA双链分子上，相对某基因来说，一股链可转录，另一股链不转录；其二是模板链并非永远在同一单链上一、几种类型的RNA：含量及作用1，信使RNA(mRNA)：它占全部RNA的5%左右。大肠杆菌中占总RNA的2%。2，转移RNA(tRNA)：tRNA在全部RNA中约占15%，种类在40种以

12、上3，核糖体RNA(rRNA)： rRNA一般与核糖体蛋白质结合在一起形成核糖体。在大肠杆 菌中，rRNA占细胞总RNA的75%85% 。除了上述3种主要的RNA外，还有一些类型的RNA 二、转录与DNA复制的异同 相同：模板，新链延伸方向，碱基的加入原则。相异：引物。信息全保留与信息半保留。底物、与T配对的碱基模板的数量（一条与两条）。所需要的酶，及酶的外切活性的有无。三、大肠杆菌RNA聚合酶的组成1，E. coli RNA聚合酶的核酶：由2 组成。作用：参与转录的全过程，但不能精确起始2. E. coli RNA聚合酶的全酶：核酶因子因子负责模板链的选择与转录的起始。不仅能增加聚合酶对启动

13、子的亲和力，还降低它对非专一位点的亲和力。 功能 2个亚基 决定哪些基因被转录 核心酶 1个亚基 结合底物，形成磷酸二酯间（催化）全酶 1个亚基 结合模板（开链）1个亚基 识别起始点启动子(延长是脱落) RNA聚合酶与DNA聚合酶的区别 RNA聚合酶DNA聚合酶大小(M)大，4.8×105dol小，1.09×105dol引物无有产物较短，游离较长，与模板以氢键相连作用方式一条链的某一段两条链同时进行外切酶活性无5 33 5校对合成能力无有修复能力无有相关概念：启动子：位于结构基因5，端上游的一段DNA序列，能被RNA聚合酶识别,结合并启动基因转录的一段DNA序列

14、转录起点：指RNA开始转录的第一个碱基，此点通常用+1表示上游：转录起点的左侧，用负的数码表示 下游：转录起点右侧（转录区），用正的数码表示 转录单元(transcription unit)：一段从启动子开始至终止子结束的DNA序列.在细菌中，一个转录单元可以是一个基因，也可以是几个基因。 足迹法与启动子: 启动子是RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA序列。利用DNase 足迹法和DNA测序法可以确定启动子的序列结构。DNase 足迹法的基本原理与DNA 化学测序法有些相似. 首先将待测双链DNA 片段中一条单链的一端选择性地进行末端标记, 然后加入恰当浓度的DNase , 使在DNA

15、 链上随机形成缺口, 经变性后电泳分离, 放射自显影, 即可形成以相差一个核苷酸为梯度的DNA 条带. 但当DNA 片段与相应的序列特异性DNA 结合蛋白结合后, DNA 结合蛋白可保护相应的DNA 序列不受DNase 的攻击, 因而在放射自显影图谱上, DNA 梯度条带在相应于DNA 结合蛋白的结合区域中断, 从而形成一空白区域, 恰似蛋白质在DNA 上留下的足迹,因而被形象地称作足迹法. 如果同时进行DNA 化学测序, 即可判断出结合区的精确顺序。原核生物启动子基本结构：原核生物中经对启动子的比较，它们有共有序列：在上游10bp处为TATAAT，又称为Pribnow盒在上游35bp处为TT

16、GACA，又称为sextama盒典型原核启动子的结构RNA聚合酶 主要接触位点 -35区-10区 TTGACA16-17bpTATAAT5-9bp转录起始位点 决定启动子的强度 保守序列 AT含量多，有利于DNA双链解链原核启动子保守区的功能：1，sextama box(-35区)：RNA聚合酶识别位点，该序列提供了RNA聚合酶识别的信号。 亚基识别-35序列，为转录选择模板。这一序列的核苷酸结构在很大程度上决定了启动子的强度。2，Pribnow box（-10区）： RNA聚合酶牢固结合位点，此处AT含量多，有助于DNA局部双链解开。是使起始复合物由关闭状态转变成启动状态的特定序列-10区序

17、列对转录的效率影响:TATAATAATAAT，转录效率下降,称为下降突变（down mutation）。TATGTTTATATT，转录效率上升，为上升突变（up mutation）。由于碱基的改变可能导致DNA双链的双螺旋发生改变，最终导致酶与DNA结合所需要的自由能增加或者降低，从而使转录的效率上升或者下降四、转录的基本过程：1.启动子的识别 2.转录起始 3.RNA链的延伸 4.终止启动子识别、转录的起始：1.全酶与模板的DNA接触，生成非专一的,不稳定的复合物在模板上移动。2. 起始识别：全酶与35序列结合，产生封闭的酶-启动子二元复合物。3.全酶紧密地结合在-10序列处，模板DNA局部

18、变性，形成开放的启动子二元复合体；4. 酶移动到起点，第一和二个NTP相连，因子释放,形成酶-启动子-NTP三元复合物转录的延伸：延伸的过程中，RNA聚合酶沿着转录泡（DNA双链解开而形成，约18碱基对）向前移动。转录泡：在转录延长过程中，由局部打开的DNA双链、RNA聚合酶核心酶及新生成的RNA三者结合在一起的复合体，为空泡状结构，又称转录复合。转录的终止：1不依赖于(rho)因子 的终止（强终止子）结构特点：(1) 有富含GC的二重对称区；(2)茎的区域富内含G-C；(3) 强终止子3端上有poly(U) ，一般为6个强终止子终止转录的机制：（1）发夹结构改变RNA聚合酶构象，使酶停止移动

19、；（2）DNA、RNA各自形成自身双链使杂交体不稳定而分离；（3）3´端一连串U，UA配对最不稳定，易从模板上脱落。2依赖于因子的终止结构特点：(1)转录的RNA也具有发夹结构，但发夹结构后无poly(U)；(2)形成的发夹结构较疏松，茎环上不富含GC；(3)终止需要因子的参与；（4）与不依赖于因子的终止一样，终止信号存在于新生的RNA链上而非DNA链上。五、真核生物的转录和原核转录的不同点：（1） 原核只有一种RNA聚合酶，而真核细胞有三种聚合酶；（2）启动子的结构特点不同，真核有三种不同的启动子和有关的元件；（3） 真核的转录有很多蛋白质因子的介入。真核生物启动子的基本结构：-8

20、0-110区 75区 -25区 +1 GC box CAAT box TATA box 起始位点1核心启动子：指保证RNA聚合酶转录正常起始所必需的，最少的DNA序列，包括转l录起始位点及起始位点上游的TATA盒。核心启动子单独起作用时，只能确定转录起始位点并产生基础水平的转录起始位点： mRNA的第一个碱基倾向A TATA框： 其一致序列是T85A97T93A85A63A83A50，TATA框的作用：(1) 选择正确的转录起始位点，保证精确起始，故也称为选择子。(2) 影响转录的速率。2真核生物的上游启动子元件包括通常位于75 bp 附近的CAAT box（相当于原核启动子的sextama

21、box）和GC box作用：控制转录起始的频率，基本不参与起始位点的确定六、真核mRNA前体的加工真核生物的mRNA转录后加工步骤：（1）加帽5端：m7GpppGpN帽子（甲基化的鸟苷酸）的类型：在末端鸟苷的第7位上存在单个甲基化位点的称O型帽子在次末端核苷酸的核糖上的2-0H位点上还有一个甲基位点的称1型帽子此外，在第三个核苷酸的核糖上（2-0H）有甲基化位点的称2型帽子 这三种帽子都有特殊面对面核苷酸结构 帽子结构的功能：(1)有助于mRNA越过核膜，进入胞质；(2)保护5'不被酶降解；(3)翻译时供IF（起始因子）和核糖体识别。（2）加尾3端：polyA尾巴过程：1.特殊组分(C

22、PSF)识别AAUAAA并指导其它的活性2.剪切因子(CF)在加尾位点 AAUAAA下游1130nt 处剪切RNA；3.末端腺苷转移酶poly(A)聚合酶合成poly(A)尾巴；4.PBP（poly A结合蛋白）与poly(A)结合，反应停止。尾巴的功能：1.PolyA是mRNA由核进入胞质所必需的形式。2.PolyA大大提高mRNA在胞质中的稳定性。 （3）mRNA前体的剪接剪除内含子，连接外显子选择性剪接：基因的初始转录物通过不同的剪接方式而实现的外显子的选择性使用。选择性剪接可以利用同一初级转录物得到不同的mRNA，翻译成不同的蛋白质。在人类基因中大约有的基因具有选择性剪接的形式选择性剪

23、接的意义：1，选择性剪接极大地增加了蛋白质的多样性和基因表达的复杂程度2，性别决定与发育：选择性剪接可以调节决定性别及发育相关蛋白的表达3，许多疾病与mRNA前代选择性剪接有关RNA编辑：是指转录后的RNA在编码区发生碱基的加入，丢失或转换等现象。它导致了DNA所编码的遗传信息的改变。形式：，单碱基突变，尿苷酸的缺失和添加原核生物和真核生物mRNA的不同比较类别原核生物真核生物转录发生的场所类核/拟核核内转录的形式多顺反子，有操纵子单顺反子，无操纵子转录所需要蛋白质RNA聚合酶聚合酶加大量辅助因子转录后是否需要加工不需加工与翻译相偶联需加工故与翻译相分离mRNA的寿命短较长第四章 生物信息的传

24、递（下）1，翻译：以mRNA为模板，按照mRNA分子上的三个核苷酸决定一种氨基酸的规则（三联体密码）合成具有特定氨基酸顺序的蛋白质。包括翻译的起始、肽链的延伸、肽链的终止与释放。2，核糖体是蛋白质合成的场所，mRNA是蛋白质合成的模板，转移RNA（tRNA）是模板与氨基酸之间的接合体。此外，在合成的各个阶段还有许多蛋白质、酶和其他生物大分子参与。实验证实三联子密码（遗传学证据）：1、mRNA模板中插入、删除一个核苷酸后，该密码子后面的氨基酸序列全部改变。2、同时插入、删除一个不同核苷酸后，后续蛋白质不变。3、同时删除三个核苷酸后，翻译减少一个氨基酸，序列没有变化。 烟草花叶病毒外壳蛋白亚基由4

25、00个氨基酸组成，而相应的RNA片段长约1200个核苷酸实验破译三联子密码：一，以均聚物、随机共聚物和特定序列的共聚物为模板指导多肽的合成二，核糖体结合技术/三联体结合实验原理及实验操作： 以人工合成的三核苷酸如UUU、UCU、UGU等为模板，在含核糖体、AA-tRNA的适当离子强度的反应液中保温，然后使反应液通过硝酸纤维素滤膜。游离的AA-tRNA因相对分子质量小能自由通过滤膜，加入三核苷酸模板可以促使其对应的AA-tRNA结合到核糖体上，体积超过膜上的微孔而被滞留，这样就能把已结合到核糖体上的AA-tRNA与未结合的AA-tRNA分开。（一）遗传密码的性质一、遗传密码的简并性：1 简并：个

26、氨基酸有多个密码子的现象或多个密码子为1个氨基酸编码。 2编码同一种氨基酸的密码子称同义密码子 3 简并性减少变异对生物的影响二、密码子的普遍性与特殊性：遗传密码无论在体内还是体外，也无论是对病毒、细菌、动物还是植物而言都是适用的，所以，密码子具有普遍性。已经查明，在支原体中，终止密码子UGA被用来编码色氨酸；在嗜热四膜虫中，另一个终止密码子UAA被用来编码谷氨酰胺。密码子具有特殊性。三、密码子的变偶性： 即在密码子与反密码子配对时，前面两对碱基严格按碱基配对原则，而第三时碱基允许有一定的自由度摆动假说，变偶假说。 密码子的第三位碱基比前三个碱基具有较小的专一性。四、密码子无标点、不重叠（二）

27、tRNA(第二遗传密码)tRNA在蛋白质合成中处于关键地位，它不但为每个三联密码子翻译成氨基酸提供了接合体，还为准确无误地将所需氨基酸运送到核糖体上提供了运送载体。1 tRNA的三叶草型二级结构：五臂四环tRNA的三级结构：L型2 tRNA的功能：识别mRNA链上的密码子；转移氨基酸作用3 tRNA的分类：（1）起始tRNA和延伸tRNA：能特异地识别mRNA模板上起始密码子的tRNA叫起始tRNA，其他tRNA统称为延伸tRNA。原核生物起始tRNA携带甲酰甲硫氨酸（fMet），真核生物起始tRNA携带甲硫氨酸（Met）。（2）同工tRNA：代表同一种氨基酸的tRNA称为同工tRNA，同工t

28、RNA既要有不同的反密码子以识别该氨基酸的各种同义密码，又要有某种结构上的共同性，能被AA- tRNA合成酶识别。（3）校正tRNA：分为无义突变及错义突变校正tRNA 。无义突变：在蛋白质的结构基因中，一个核苷酸的改变可能使代表某个氨基酸的密码子变成终止密码子（UAG、UGA、UAA），使蛋白质合成提前终止，合成无功能的或无意义的多肽，这种突变就称为无义突变。错义突变：是由于结构基因中某个核苷酸的变化使一种氨基酸的密码变成另一种氨基酸的密码。错义突变的校正tRNA通过反密码子区的改变把正确的氨基酸加到肽链上，合成正常的蛋白质。校正tRNA在进行校正过程中必须与正常的tRNA竞争结合密码子。无

29、义突变的校正tRNA必须与释放因子竞争识别密码子；错义突变的校正tRNA必须与该密码的正常tRNA竞争，都会影响校正的效率。（三）核糖体核糖核蛋白的结构：1 由大小二亚基组成 2 给位（P位，肽位）： 起始时， tRNAimet结合于核糖体的肽位延长成肽后，肽链转到此位。3 受位（A位，氨基酰位）：延长成肽时，氨基酰tRNA就加入此位。核糖核蛋白的种类(胞质中)4 游离的核糖核蛋白-合成细胞固有蛋白 5 与粗面内质网结合的核糖核蛋白-合成带有信号肽的分泌性蛋白质原核与真核生物中核糖体的组成分别怎样？原核生物核糖体：由2/3的RNA及1/3蛋白质组成，核糖体的大小为70S，可分为30S小亚基和5

30、0S大亚基。真核生物核糖体：由3/5的RNA及2/5蛋白质组成，核糖体的大小为80S，可分为40S小亚基和60S大亚基。（四）蛋白质合成的生物学机制1 氨基酸的活化与转运酶tRNA合成酶绝对专一性 1个A.A1个氨基酰tRNA合成酶催化反应活化A.A-活化“-COOH”消耗2个ATP活化A.A+tRNA 氨基酰tRNA2 肽链合成的起始原核生物的起始tRNA是fMet-tRNAfMet，而真核生物是Met-tRNAiMet。原核生物中30S小亚基首先与mRNA模板相结合，再与fMet-tRNAfMet结合，最后与50S大亚基结合。而在真核生物中，40S小亚基首先与Met-tRNAMet相结合，

31、再与模板mRNA结合，最后与60S大亚基结合生成80S·mRNA·Met-tRNAMet起始复合物。起始复合物的生成除了需要GTP提供能量外，还需要Mg2+、NH4+及3个起始因子（IF-1、IF-2、IF-3）。 真核生物蛋白质生物合成的起始机制与原核生物基本相同，其差异主要是核糖体较大，有较多的起始因子参与，其mRNA具有m7GpppNp帽子结构，Met-tRNAMet不甲酰化，mRNA分子5' 端的“帽子”和3' 端的多聚A都参与形成翻译起始复合物。3 肽链的延伸生成起始复合物，第一个氨基酸（fMet/Met-tRNA）与核糖体结合以后，肽链开始伸长。

32、按照mRNA模板密码子的排列，氨基酸通过新生肽键的方式被有序地结合上去。肽链延伸由许多循环组成，每加一个氨基酸就是一个循环，每个循环包括AA-tRNA与核糖体结合、肽键的生成和移位、无负载的tRNA 的脱落。 肽链延伸的具体过程：1）后续AA-tRNA与核糖体结合（进位）、2）肽键的生成(转肽)、3）移位、4）脱落4 肽链的终止  肽链的延伸过程中，当终止密码子UAA、UAG或UGA出现在核糖体的A位时，没有相应的AA-tRNA能与之结合，而释放因子能识别这些密码子并与之结合，水解P位上多肽链与tRNA之间的二酯键。接着，新生的肽链和tRNA从核糖体上释放，核糖体大、小亚基解体，蛋白

33、质合成结束。释放因子RF具有GTP酶活性，它催化GTP水解，使肽链与核糖体解离。     细菌细胞内存在三种不同的终止因子（或称释放因子，RF1，RF2，RF3），RF1能识别UAG和UAA，RF2识别UGA和UAA。一旦RF与终止密码相结合，它们就能诱导肽基转移酶把一个水分子而不是氨基酸加到延伸中的肽链上。RF3可能与核糖体的解体有关。真核细胞只有一个（RF）终止因子。 (五)蛋白质前体的加工新生的多肽链大多数是没有功能的，必须经过加工修饰才能转变为有活性的蛋白质。 1N端fMet或Met的切除2二硫键的形成3特定氨基酸的修饰4切除新生肽链中非功能片段蛋白质合成

34、抑制剂：    蛋白质生物合成的抑制剂主要是一些抗生素，如嘌呤霉素、链霉素、四环素、氯霉素、红霉素等，此外，如5-甲基色氨酸、环已亚胺、白喉毒素、蓖麻蛋白和其他核糖体灭活蛋白等都能抑制蛋白质的合成。1 链霉素是一种碱性三糖，能干扰fMet-tRNA与核糖体的结合，从而阻止蛋白质合成的正确起始，也会导致mRNA的错读。 2 嘌呤霉素是AA-tRNA的结构类似物，能结合在核糖体的A位上，抑制AA-tRNA的进入，嘌呤霉素是通过提前释放肽链来抑制蛋白质合成的 蛋白质运转机制：一般说来，蛋白质运转可分为两大类：翻译运转同步机制:蛋白质的合成和运转同时发生的翻译后运转机制：

35、蛋白质从核糖体上释放后才发生运转。 第5-6章分子生物学的研究法（一）限制性核酸内切酶: 是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸水解酶。（只催化非甲基化的DNA的水解，不兼有甲基化酶的活性，修饰由其他酵素进行）1.限制性核酸内切酶的分类根据限制性核酸内切酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性，可分为、型三类。其中型较重要，主要特征是主要特征型限制修饰单功能（专一）蛋白结构同源三聚体（单一的亚基）辅助因子反应需要Mg2+识别序列48bp回文序列切割为点识别序列内或附近特异切割。功能：型限制性核酸内切酶有严格的识别、切割顺序，识别序列一般为48个

36、碱基对，具有迴文结构。它以核酸内切方式水解DNA链中的磷酸二酯键，产生的DNA片段5端为P，3端为OH。限制性核酸内切酶切割双链DNA产生3种不同的切口（5粘性末端、3粘性末端和平头末端）。2.II型限制性核酸内切酶酶切反应操作大部分II型限制性核酸内切酶需要相似反应条件： Tris-HCl 50mmol/L pH7.5 MgCl2 10mmol/L NaCl 0-100mmol/L DTT 1mmol/L Volume 20-100L Temperature Time 1-1.5h1个单位限制性核酸内切酶：在建议使用的缓冲液及温度下，在50L反应液中反应1h，使1g标准DNA完全消化所需的酶

37、量。3.限制性核酸内切酶的星活性：指由于反应条件改变，酶切的核酸序列不同于它特定的识别序列,即酶切反应的特异性发生了改变。星活性产生的原因如下：反应体系中甘油的浓度大于5%。 酶用量过大，大于100U/微克DNA。 低离子强度，小于25mmol/L。 高pH，大于8.0。 含有机剂，如乙醇、二甲基亚砜、二甲基乙酰胺等。 Mn2+、Cu2+、Co2+、Zn2+等非Mg2+的二价离子的存在。 常发生星活性的内切酶有：EcoRI、Hind、KpnI、PstI、SalI、HinfI等。 （二）DNA分子的连接DNA连接酶能催化双链DNA切口处的5-磷酸根和3-羟基生成磷酸二酯键。这种反应需要能量。大肠

38、杆菌和其他细菌的DNA连接酶以NAD+作为能量来源，动物细胞和噬菌体的连接酶则以ATP作为能量来源。粘性末端：用DNA连接酶连接 平头末端：用T4-DNA连接酶连接（三）细菌转化：是指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株的DNA而导致遗传性状特征发生改变的生命过程。提供转化DNA的菌株叫作供体菌株，接受转化DNA的细菌菌株则被称为受体菌株。处于能够接受外源DNA状态的细胞称为感受态细胞。步骤：1.将快速生长中的大肠杆菌置于经低温（0）预处理的低渗氯化钙溶液中，便会造成细胞膨胀（形成原生质球）。2.外源DNA粘附在细胞表面,形成复合物。3.立即将该体系转移到42下做短暂的热刺激，复合物便会被

39、细胞所吸收。4.在全培养基中生长一段时间使转化基因实现表达、细胞活性恢复5. 涂布于选择性培养基中分离转化子。（四）核酸的凝胶电泳1.基本原理：一种带电分子被放置到电场中，它就会以一定的速度移向适当的电极。我们把这种电泳分子在电场作用下的迁移速度，叫做电泳的迁移率，它与电场强度、电泳分子本身所携带的净电荷数、分子大小、形状、电泳介质孔径大小以及缓冲液粘度等有关系。 在一般情况下，核酸分子的糖-磷酸骨架中的磷酸基团，是呈离子化状态的，所以，DNA和RNA多核苷酸链又被称为多聚阴离子，把这些核酸分子放置在电场当中，它们就会向正电极的方向迁移。2.凝胶电泳方法及其分辨力：琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范

40、围为0.250kb之间 （琼脂糖是从海藻中提取的一种线状高聚物）。 聚丙烯酰胺凝胶电泳其分辨范围为1个碱基对到1000个碱基对之间 凝胶的分辨能力同凝胶的类型和浓度有关，凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。反之，浓度降低，孔隙就增大，其分辨能力也就随之减弱。 （五）PCR(聚合酶链式反应)及其应用 概念：在引物指导下由酶催化的对特定DNA序列进行的体外扩增反应。由多个循环组成。每个循环包括了变性（95oC 20-30秒）、退火（温度由引物长度和GC含量决定）以及延伸（70-75oC）三个阶段。能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩

41、增至十万乃至百万倍。标准的PCR反应体系4种dNTP混合物各200umol/L引物各10100pmol模板DNA0.12ugTaq DNA聚合酶 2.5uMg2+ 1.5mmol/LPCR中应注意的事项（一）防止污染试剂小量分装吸头及EP管一次性使用器皿及工作区域要分开，无菌操作（二）设立对照：阳性对照： 阳性模板阴性对照： 阴性模板试剂对照： 除模板外的所有组分（六）基因克隆技术基因克隆：通过体外重组技术,将一段目的DNA经切割、连接插入适当载体,并导入受体细胞，进行永久保存和复制的过程。具体流程：（一）目的基因的获取（二）克隆载体的选择和构建（三）外源基因与载体的连接（四）重组DNA导入受

42、体菌（五）重组体的筛选基因克隆技术具体过程（1）目的基因的获取方法 1. 化学合成法（要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列，由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列） 2.基因组DNA文库(genomic DNA library)：存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合。 3. cDNA文库(cDNA library)：某种生物基因组转录的全部mRNA经反转录产生的cDNA片段分别与克隆载体重组，储存于某种受体菌中，该群体就称该生物基因组的cDNA文库。 将带poly(A)的mRNA经酶促反应转变为双链DNA，再与原核载体连接 制备用于克隆cDNA的mRNA cDN

43、A 的合成和克隆()cDNA 第一链的合成: 利用真核mRNA分子所具有的poly(A)尾巴的特性，加入12-20个脱氧胸腺嘧啶核苷组成的oligo(dT)短片段，由反转录酶合成cDNA的第一链。 自身引导合成法 (）双链 cDNA 的合成(第二条链的合成)： 置换合成法 自身引导合成法 ：单链cDNA的3端能够形成发夹状的结构作为引物，在大肠杆菌聚合酶I Klenow的作用下，合成cDNA的第二链。 缺点：在以S1核酸酶切割cDNA的发夹状结构时，会导致对应于mRNA 5端的地方的序列出现缺失和重排。 S1核酸酶的纯度不够时，会偶尔破坏合成的双链cDNA分子。置换合成法：以RNA酶H在第一链

44、合成产物cDNA：mRNA杂交体的mRNA链上造成切口和缺口，产生一系列RNA引物，在大肠杆菌DNA聚合酶I 的作用下合成cDNA的第二链。 优点：a）合成cDNA的效率高 b）直接利用第一链的反应产物，不需纯化 c）避免使用S1核酸酶来切割双链cDNA （）双链cDNA分子与载体进行连接：将合成的双链重组到质粒载体或噬菌体载体上，转化大肠杆菌寄主细胞增殖。 RACE技术获取全长cDNA序列。（RACE技术（rapid amplification of cDNA ends）是一项在已知cDNA序列的基础上克隆5端或3端缺失序列的技术。） （）基因文库的筛选：通过某种特殊方法从基因文库中鉴定出含

45、有所需重组DNA分子的特定克隆过程。（如核酸杂交法、PCR筛选法、免疫筛选法）P176 4. 分离克隆差别表达的基因：根据表达特性的差异可将高等真核生物的基因分为两大类：一类叫做看家基因，以其组成型表达模式维持细胞的基本代谢活动；另一类叫做发育调控基因，以其时空特异性表达模式完成个体的正常生长、发育与分化，我们将不同基因在生物个体发育的不同阶段，或是在不同的组织或细胞中发生的按时间、空间进行有序表达的方式称为基因的差别表达。操作:(a）从不同发育阶段或不同类型的细胞群体中分离mRNA，并以3'锚定引物作为反转录的引物，合成第一键cDNA； （b）用5'随机引物和某个3'

46、端锚定引物对扩增第一链(掺入32P-dNTP)； (c) DNA变性测序胶分离扩增产物，X光片曝光后检测差别条带；(d）回收特异性差别条带；(e）用同一引物对扩增已回收的DNA条带；(f）用Northern，Southern及测序法分析所得的条带；(g）以该DNA片段做探针，筛选全长cDNA。（2）克隆载体的选择和构建1.载体的功能运送外源基因高效转入受体细胞为外源基因提供复制能力为外源基因的扩增提供必要的条件 2.载体特点 1) 至少有一个复制起点，因而至少可在一种生物体中自主复制。2) 至少应有一个克隆位点，以供外源DNA插入。3) 至少应有一个遗传标记基因，以指示载体

47、或重组DNA分子是否进入宿主细胞 3.载体类型l 质粒载体l 噬菌体载体l cosmid克隆载体l 噬菌粒载体l 酵母人工染色体载体l 细菌人工染色体载体分子克隆载体是一类可供外源DNA插入并携带重组DNA分子进入适当宿主细胞的DNA分子（3）外源基因与载体的连接1. 粘性末端连接方式：(1)同一限制酶切位点连接、(2)不同限制酶切位点连接2. 平端连接：适用于：限制性内切酶切割产生的平端、粘端补齐或切平形成的平端3. 同聚物加尾连接： 在末端转移酶的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。任何两条DNA分子，只要分别获得poly（dA）和poly（dT）尾巴，

48、就会彼此连接起来。4. 人工接头(linker)连接：由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。 （4）重组DNA导入受体菌受体菌条件：安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷 处于感受态(competent) （5）重组体的筛选 标记基因筛选法 (利用标记基因指示外源DNA分子（载体或重组分子）是否进入宿主细胞) 根据重组子结构特征的筛选法1）PCR法 2）限制性核酸内切酶酶切法 3）DNA测序法 (六) 酵母双杂交系统的基本原理 蛋白质之间或蛋白质与核酸的相互作用是功能的基础。酵母杂交就是研究相互作用的方法。基本原理：酵母双杂交系统巧妙地利用了真核生物转录调控因子的组件式结

49、构（modular）特征，酵母转录因子GAL4 的DNA结合结构域BD 和转录激活结构域AD是转录激活因子发挥功能所必须的。只有当他们在空间上接近时才能行使激活转录的功能。将编码待测蛋白的基因分别与编码BD及编码AD基因构成融合基因，并导入酵母细胞中。如果待测蛋白间存在相互作用，则转录因子GAL4发挥作用，促使报告基因表达；如果待测蛋白间不存在相互作用，则转录因子GAL4不能发挥作用，报告基因不表达。 用途：1）已知蛋白之间相互作用的检测：2）蛋白质的功能域研究：通过对其中某一个蛋白质作缺失或定点突变，再用此系统检测是否还存在相互作用，可阐明其功能域或关键氨基酸；3）克隆新基因和新蛋白：将感兴

50、趣的蛋白质基因与BD基因构建成“诱饵”表达质粒，将某一器官或组织的cDNA文库与AD基因构建成“猎物”基因库，共转化酵母细胞，可筛到与感兴趣蛋白质相互作用的蛋白质的cDNA序列，并推测其蛋白质序列。（八）核酸杂交技术 1.Southern Blot 原理：将待检测的DNA分子经限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小

51、。用途：检测DNA样品中的基因及其含量，了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等。 操作步骤：DNA 琼脂糖电泳 印迹转移 杂交（变性探针） 洗膜 放射自显影或显色2.Northern Blot 原理：在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同Southern Blot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。用途：检测RNA样品中是否含有基因的转录产物（mRNA）及其含量。 操作过程：mRNA提取 甲醛变性电泳 印迹转移 杂交（变性探针） 洗膜 放射自显影或化学发光（九）RNA 干扰 RNA干扰是与靶基因序列同源的双链RNA所诱导的一种特异性的转录后基因沉默现象。 RNA

52、i可以作为一种简单、有效的基因沉默工具，因而在医药开发、基因治疗和功能基因组研究等方面的应用得到飞速发展。 原理： RNAi具有特异性和高效性。是一个依赖ATP的过程，一种称为Dicer的核酸酶负责将dsRNA酶切转化为3端有23nt突出、长2123bp 的小分子双链RNA ，这种RNA称为小干扰RNA（siRNA）。siRNA形成之后，与一系列特异性蛋白结合形成siRNA诱导干扰复合体(RISC)，此复合物通过碱基互补配对识别靶mRNA 并使其降解，从而导致特定基因沉默。（十）基因组：1.基因组：生物所具有的携带遗传信息的遗传物质的总和。真核生物基因组：核基因组、线粒体基因组、叶绿体基因组原

53、核生物基因组：染色体、质粒2. 基因组作图：简单来说，就是把一些分子标记在基因组上的位置标记出来。分子标记是具有特征性的DNA序列。（1）遗传图与物理图 ：遗传作图：采用遗传学分析方法将基因或其它DNA顺序标定在染色体上构建连锁图。这一方法包括杂交实验，家系分析等。物理作图：采用分子生物学技术直接将DNA分子标记、基因或克隆标定在基因组实际位置。（2）常用的物理作图方法： 由于遗传图的局限，须用物理图对其进行验证，校正和补充。l 限制性作图（将限制酶的酶切位点标定在DNA分子的相对位置） l 荧光原位杂交（Fluorescent in situ hybridization, FISH）作图l 顺序标签位点（Sequence tagged site, STS）作图 序列标记位点（STS）作图· 目前最有效的物理作图技术，也是能对大基因组作