生物工业下游技术__细胞破碎

1、生物工业下游技术的一般流程生物工业下游技术的一般流程第四章 细胞破碎 细胞壁的结构与组成细胞壁的结构与组成 细胞破碎技术细胞破碎技术 破碎率的测定破碎率的测定 破碎技术的研究方向破碎技术的研究方向 基因工程包涵体的纯化方法基因工程包涵体的纯化方法概述 微生物细胞和植物细胞外层均为细胞壁，细胞壁微生物细胞和植物细胞外层均为细胞壁，细胞壁里面是细胞膜，细胞膜和它所包围的细胞浆合称里面是细胞膜，细胞膜和它所包围的细胞浆合称原生质体原生质体。动物细胞没有细胞壁，仅有细胞膜。动物细胞没有细胞壁，仅有细胞膜。通常细胞壁较坚韧，细胞膜脆弱，易受渗透压冲通常细胞壁较坚韧，细胞膜脆弱，易受渗透压冲击而破碎，因此

2、细胞破碎的阻力主要来自于击而破碎，因此细胞破碎的阻力主要来自于细胞细胞壁壁。 基于遗传和环境等因素，不同类型生化物质其细基于遗传和环境等因素，不同类型生化物质其细胞壁的结构和组成不完全相同，故细胞壁的机械胞壁的结构和组成不完全相同，故细胞壁的机械强度不同，细胞破碎的难易程度也就不同。此外，强度不同，细胞破碎的难易程度也就不同。此外，不同的生化物质其稳定性有较大差别，在破碎过不同的生化物质其稳定性有较大差别，在破碎过程中应防止变性和被胞内的酶水解，因此，破碎程中应防止变性和被胞内的酶水解，因此，破碎方法的选择和操作条件的优化是十分必要的。方法的选择和操作条件的优化是十分必要的。细胞壁的结构与组成

3、细胞壁的结构与组成 革兰氏阳性菌革兰氏阳性菌 革兰氏阴性菌革兰氏阴性菌 酵母菌酵母菌 霉菌霉菌肽聚糖的结构肽聚糖的结构几乎所有细菌的细胞壁都是由几乎所有细菌的细胞壁都是由肽肽聚糖聚糖（peptidoglycan）组成，它）组成，它是难溶性的是难溶性的聚糖链聚糖链（glycan chain）（）（N-乙酰葡萄糖胺和乙酰葡萄糖胺和N-乙乙酰胞壁酸交替重复地通过酰胞壁酸交替重复地通过-1-1，4 4糖苷键连接而成），糖苷键连接而成），借助短肽交借助短肽交联而成的网状结构，包围在细胞联而成的网状结构，包围在细胞周围，使细胞具有一定的形状和周围，使细胞具有一定的形状和强度。强度。短肽一般由四或五个氨基酸

4、组成，短肽一般由四或五个氨基酸组成，如如L-丙氨酰丙氨酰-D-谷氨酰谷氨酰-L-赖氨酰赖氨酰-D-丙氨酸。而且短肽中常有丙氨酸。而且短肽中常有D-氨氨基酸与二氨基庚二酸存在。基酸与二氨基庚二酸存在。细菌 虽然几乎所有的细菌都含虽然几乎所有的细菌都含有肽聚糖的网状结构，但有肽聚糖的网状结构，但是是革兰氏阴性菌革兰氏阴性菌的细胞壁的细胞壁结构与结构与革兰氏阳性菌革兰氏阳性菌有很有很大不同。大不同。 革兰氏阴性菌比阳性菌复革兰氏阴性菌比阳性菌复杂，在电子显微镜超薄切杂，在电子显微镜超薄切片观察，可见革兰氏阳性片观察，可见革兰氏阳性菌细胞壁较厚，具有菌细胞壁较厚，具有202080nm80nm的肽聚糖层

5、，约占细的肽聚糖层，约占细胞壁成分的胞壁成分的40409090，此，此外细胞壁还含有大量磷壁外细胞壁还含有大量磷壁酸酸(eichoic acid)(eichoic acid)。(a) 革兰氏阳性菌细胞壁结构模式图革兰氏阳性菌细胞壁结构模式图膜磷壁酯壁磷壁酯2080 nm细菌 而革兰氏阴性菌的肽聚糖而革兰氏阴性菌的肽聚糖层较薄，仅层较薄，仅23nm，占，占细胞壁成分的细胞壁成分的10左右，左右，由于肽聚糖之间仅由四肽由于肽聚糖之间仅由四肽侧链直接连接，缺乏五肽侧链直接连接，缺乏五肽桥，故层较疏松，而且肽桥，故层较疏松，而且肽聚糖居于细胞壁最内层，聚糖居于细胞壁最内层，紧贴在细胞膜上，在紧贴在细胞

6、膜上，在肽聚肽聚糖层外面还有一较厚的外糖层外面还有一较厚的外壁层壁层(约约810nm)，主要，主要成分为脂蛋白、脂多糖和成分为脂蛋白、脂多糖和其它脂类其它脂类，因此，革兰氏因此，革兰氏阴性菌细胞壁中脂类含量阴性菌细胞壁中脂类含量较高。较高。810 nm23 nm细菌细菌(b) 革兰氏阴性菌细胞壁结构模式图革兰氏阴性菌细胞壁结构模式图(a) 革兰氏阳性菌细胞壁结构模革兰氏阳性菌细胞壁结构模式图式图膜磷壁酯壁磷壁酯2080 nm810 nm23 nm细菌破碎细菌的主要阻力破碎细菌的主要阻力 破碎细菌的主要阻力是来自于肽聚糖的网状结构，其网结构的致密程度和强度取决于聚糖链上所存在的肽键的数量和其交联

7、的程度，如果交联程度大，则网结构就致密。酵母菌酵母菌100300 nm细胞壁的细胞壁的最里层是由葡聚糖最里层是由葡聚糖的细纤维组成的细纤维组成，它构成了细它构成了细胞壁的刚性骨架，使细胞具胞壁的刚性骨架，使细胞具有一定的形状有一定的形状，覆盖在细纤覆盖在细纤维上面的是一层糖蛋白维上面的是一层糖蛋白，最最外层是外层是甘露聚糖甘露聚糖，由由1,6-磷磷酸二酯键共价连接，形成网酸二酯键共价连接，形成网状结构。在该层的内部，有状结构。在该层的内部，有甘露聚糖甘露聚糖-酶酶的复合物，它可的复合物，它可以共价连接到网状结构上，以共价连接到网状结构上，也可以不连接。也可以不连接。酵母菌破碎酵母细胞壁的阻力破

8、碎酵母细胞壁的阻力 与细菌细胞壁一样，与细菌细胞壁一样，破碎酵母细胞壁的阻力主要破碎酵母细胞壁的阻力主要决定于壁结构交联的紧密程度和它的厚度。决定于壁结构交联的紧密程度和它的厚度。霉菌霉菌100250 nm主要存在三种聚合物，主要存在三种聚合物，葡聚糖葡聚糖（主要以（主要以-1,3糖苷键连接，糖苷键连接，某些以某些以-1,6糖苷键连接），糖苷键连接），几丁质几丁质（以微纤维状态存在）（以微纤维状态存在）以及以及糖蛋白糖蛋白。最外层最外层(a) 第第2层层(b) 第第3层层(c) 最内层最内层(d) 与酵母和细菌的细胞壁一样，与酵母和细菌的细胞壁一样，真菌细胞壁的强度和聚合物的真菌细胞壁的强度和

9、聚合物的网状结构有关，不仅如此，它网状结构有关，不仅如此，它还含有几丁质或纤维素的纤维还含有几丁质或纤维素的纤维状结构，所以强度有所提高。状结构，所以强度有所提高。各种微生物细胞壁的结构和组成各种微生物细胞壁的结构和组成微生物微生物革兰氏阳革兰氏阳性细菌性细菌 革兰氏阴革兰氏阴性细菌性细菌酵母菌酵母菌霉菌霉菌细胞壁细胞壁厚（厚（nm）20801013100300100250层次层次单层单层多层多层多层多层多层多层主要主要组成组成肽聚糖肽聚糖（40%90%）多糖多糖胞壁酸胞壁酸蛋白质蛋白质脂多糖脂多糖（1%4%）肽聚糖肽聚糖（5%10%）脂蛋白脂蛋白脂多糖脂多糖（11%12%）磷脂磷脂蛋白质蛋白

10、质葡聚糖葡聚糖（30%40%）甘露聚糖（甘露聚糖（30%）蛋白质（蛋白质（6%8%）脂类脂类（8.5%13.5%）多聚糖多聚糖（89%90%）脂类脂类蛋白质蛋白质细胞破碎方法细胞破碎方法 机械法机械法珠磨法（珠磨法（Bead millBead mill）高压匀浆破碎法（高压匀浆破碎法（High-pressure homogenizationHigh-pressure homogenization）超声波破碎法（超声波破碎法（UltrasonicationUltrasonication）X-pressX-press法法 非机械法非机械法酶溶法（酶溶法（Enzymatic lysisEnzymat

11、ic lysis）化学渗透法（化学渗透法（Chemical permeation)Chemical permeation)渗透压法（渗透压法（Osmotic pressureOsmotic pressure）冻融法（冻融法（freezing and thawingfreezing and thawing）干燥法（干燥法（DrynessDryness）珠磨法珠磨法 研磨是常用的一种方法，它将细胞悬浮液与玻璃小珠、石研磨是常用的一种方法，它将细胞悬浮液与玻璃小珠、石英砂或氧化铝等研磨剂一起快速搅拌，使细胞获得破碎。英砂或氧化铝等研磨剂一起快速搅拌，使细胞获得破碎。在工业规模的破碎中，常采用高速珠磨

12、机（在工业规模的破碎中，常采用高速珠磨机（High speed High speed bead millbead mill）。）。 工作原理：工作原理：进入球磨机的细胞悬浮液与玻璃小珠、石英进入球磨机的细胞悬浮液与玻璃小珠、石英砂和氧化铝等研磨剂一起快速搅拌和研磨，通过剪切和碰砂和氧化铝等研磨剂一起快速搅拌和研磨，通过剪切和碰撞作用，使细胞破碎，释放出内含物。撞作用，使细胞破碎，释放出内含物。 在珠液分离器的协在珠液分离器的协助作用下，研磨剂被滞留在破碎室内，浆液流出从而实现助作用下，研磨剂被滞留在破碎室内，浆液流出从而实现连续操作。连续操作。珠磨法珠磨法 影响因素：影响因素：珠体直径、珠体装

13、量、细胞浓度、料液性质、研磨时间、搅拌速度和操作温度等。 提高细胞破损率：提高细胞破损率：延长研磨时间、增加珠体装量、提高搅拌速度、提高操作温度。 特点：特点：1. 具有破碎和冷却双重功能，产物不易失活；2. 一次操作即可达到较高的破碎率；3. 适合各种微生物细胞的破碎；4.操作参数多，不易控制，不适合大规模操作。高压匀浆法高压匀浆法 工作原理：工作原理：细胞浆液通过止逆阀进入泵体内，在高压下迫使其在排出细胞浆液通过止逆阀进入泵体内，在高压下迫使其在排出阀的小孔中高速冲出，并射向撞击环上，由于突然减压和高速冲击，使细胞阀的小孔中高速冲出，并射向撞击环上，由于突然减压和高速冲击，使细胞受到高的液

14、相剪切力而破碎。在操作方式上，可以采用受到高的液相剪切力而破碎。在操作方式上，可以采用单次通过匀浆器或多单次通过匀浆器或多次循环通过等方式次循环通过等方式，也可连续操作。为了控制温度的升高，可在进口处用干，也可连续操作。为了控制温度的升高，可在进口处用干冰调节温度，使出口温度调节在冰调节温度，使出口温度调节在2020左右。在工业规模的细胞破碎中，对于左右。在工业规模的细胞破碎中，对于酵母等难破碎的及浓度高或处于生长静止期的细胞，常采用多次循环的操作酵母等难破碎的及浓度高或处于生长静止期的细胞，常采用多次循环的操作方法。方法。高压匀浆法高压匀浆法 破碎的动力学方程：破碎的动力学方程： ln1/(

15、1-R)=Ktnpa R R 破碎率；破碎率； Kt Kt 与温度有关的速度常数；与温度有关的速度常数； n n 悬浮液通过匀浆器的次数；悬浮液通过匀浆器的次数； P P 操作压力，操作压力，MPaMPa； 与微生物种类有关的常数。与微生物种类有关的常数。高压匀浆法高压匀浆法 影响因素：影响因素：温度、压力和通过匀浆器的次数。 升高压力有利于破碎，它表明可以减少细胞的循环次数，升高压力有利于破碎，它表明可以减少细胞的循环次数，在不明显增加通过量的情况下，甚至一次通过匀浆阀就在不明显增加通过量的情况下，甚至一次通过匀浆阀就可达到几乎完全的破碎，这样就可避免细胞碎片不至过可达到几乎完全的破碎，这样

16、就可避免细胞碎片不至过小，从而给随后细胞碎片的分离工作带来好处。小，从而给随后细胞碎片的分离工作带来好处。 BrokmanBrokman等人已研究了能适应于高压操作的匀浆阀，试验等人已研究了能适应于高压操作的匀浆阀，试验表明在约表明在约175MPa175MPa的压力下，破碎率可达的压力下，破碎率可达100100，但是也有，但是也有试验表明当压力超过一定的值后，破碎率增长得很慢，试验表明当压力超过一定的值后，破碎率增长得很慢，在工业生产中，通常采用的压力为在工业生产中，通常采用的压力为555570Mpa70Mpa。高压匀浆法高压匀浆法 特点：特点： 1. 操作参数少，易控制，适合大规模操作； 2

17、. 需循环多次才能达到较高的破损率； 3. 不适合丝状真菌和含包含体的基因工程菌的破碎，适合于酵母和大多数细菌细胞的破碎，料液细胞浓度可达到20%左右。超声破碎法超声破碎法 超声波破碎法（超声波破碎法（Ultrasonication)Ultrasonication)利用超声波振利用超声波振荡器发射的超声波处理细胞悬浮液。荡器发射的超声波处理细胞悬浮液。 超声波振荡器有不同的类型，常用的为电声型，超声波振荡器有不同的类型，常用的为电声型，它是由发生器和换能器组成，发生器能产生高频它是由发生器和换能器组成，发生器能产生高频电流，换能器的作用是把电磁振荡转换成机械振电流，换能器的作用是把电磁振荡转换

18、成机械振动。超声波振荡器可分为槽式和动。超声波振荡器可分为槽式和探头直接插入介探头直接插入介质质两种型式，一般破碎效果后者比前者好。两种型式，一般破碎效果后者比前者好。超声破碎法超声破碎法 工作原理：工作原理：一般认为在超声波作用下液体发生空化作用（cavitation),空穴的形成、增大和闭合产生极大的冲击波和剪切力，使细胞破碎。超声破碎法超声破碎法 影响因素：影响因素：声频、声能、处理时间、细胞声频、声能、处理时间、细胞浓度及菌种类型（更适合破碎浓度及菌种类型（更适合破碎革兰氏阴性革兰氏阴性菌菌，一般不用作，一般不用作酵母菌酵母菌的破碎）。的破碎）。 特点：特点：1. 处理少量样品时，操作

19、简便，损处理少量样品时，操作简便，损失少，更适合实验室规模；失少，更适合实验室规模；2. 超声破碎时超声破碎时会产生大量的热，需对物料进行冷却；会产生大量的热，需对物料进行冷却；3. 在大规模操作中，声能传递和散热均有困在大规模操作中，声能传递和散热均有困难。难。X-press 法 将浓缩的菌体悬浮液冷却至-25-25形成冰晶体，利用500MPa以上的高压冲击，使冷冻细胞从高压阀小孔中挤出。细胞破碎是由于冰晶体的磨损，使包埋在冰中的微生物变形而引起的。 适用范围：主要用于实验室。 优点：适应范围广、破碎率高、细胞碎片粉碎程度低及活性保留率高。 缺点：不适用于对冷冻敏感的物质。非机械法 酶溶法（

20、酶溶法（Enzymatic lysisEnzymatic lysis） 化学渗透法（化学渗透法（Chemical permeation)Chemical permeation) 渗透压法（渗透压法（Osmotic pressureOsmotic pressure） 冻融法（冻融法（freezing and thawingfreezing and thawing） 干燥法（干燥法（DrynessDryness） 其中酶法和化学法溶胞应用最广。其中酶法和化学法溶胞应用最广。 基本原理：基本原理：利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞，使细胞壁受到部分或完全破坏后，再利用渗透压冲击等方法破坏细胞膜，进一步增

21、大胞内产物的通透性。 溶菌酶（lysozyme)适用于革兰氏阳性菌细胞的分解，应用于革兰氏阴性菌时，需辅以EDTA使之更有效地作用于细胞壁。 放线菌细胞壁结构类似于革兰氏阳性菌，以肽聚糖为主要成分，也能采用溶菌酶。 酵母和霉菌的细胞壁不同于细菌，需采用不同的酶，常用蜗牛酶、纤维素酶、多糖酶等或几种酶的混合物。 植物细胞壁的主要成分是纤维素，常用纤维素酶和半纤维素酶裂解。酶溶法酶溶法酶溶法酶溶法 分类：分类： 外加酶法：外加酶法：根据不同菌种的细胞壁的结构和化学组成，外根据不同菌种的细胞壁的结构和化学组成，外加不同的降解酶，并确定相应的加酶次序，使细胞壁破裂，加不同的降解酶，并确定相应的加酶次序

22、，使细胞壁破裂，释放出胞内物质。释放出胞内物质。 优点：优点：1. 可从细胞内不同位置选择性的释放目的产物，条件可从细胞内不同位置选择性的释放目的产物，条件温和；温和；2. 核酸泄出量少，细胞外形完整，可进行原生质体融核酸泄出量少，细胞外形完整，可进行原生质体融合实验。合实验。 缺点：缺点：1. 酶价格高，限制了其大规模应用；酶价格高，限制了其大规模应用；2. 通用性差，通用性差，不同菌种需选择不同的酶，不易确定最佳的破壁条件；不同菌种需选择不同的酶，不易确定最佳的破壁条件；3. 存存在产物抑制现象，使胞内物质释放率低。在产物抑制现象，使胞内物质释放率低。 自溶法：自溶法：通过控制一定的发酵条

23、件，使微生物自身代谢出通过控制一定的发酵条件，使微生物自身代谢出所需的溶酶，达到破壁的目的。所需的溶酶，达到破壁的目的。 优点：优点：可用于大规模生产；可用于大规模生产； 缺点：缺点：1. 对于不稳定的微生物易引起目的产物的变性。对于不稳定的微生物易引起目的产物的变性。2. 自溶后细胞悬浮液粘度增大，过滤速率下降。自溶后细胞悬浮液粘度增大，过滤速率下降。化学渗透法化学渗透法 基本原理：基本原理：某些化学试剂可以改变细胞壁或膜的通透性，使胞内物质有某些化学试剂可以改变细胞壁或膜的通透性，使胞内物质有选择的渗透出来。选择的渗透出来。常用酸、碱、表面活性剂和有机溶剂等化学试剂。常用酸、碱、表面活性剂

24、和有机溶剂等化学试剂。 化学试剂的类型：化学试剂的类型：v 酸处理酸处理可以使蛋白质水解成氨基酸，通常采用可以使蛋白质水解成氨基酸，通常采用6mol/L HCl6mol/L HCl；v 碱和表面活性剂碱和表面活性剂能溶解细胞壁上脂类物质或使某些组分从细胞内渗漏出来；能溶解细胞壁上脂类物质或使某些组分从细胞内渗漏出来；v 表面活性剂：表面活性剂：天然的表面活性剂有胆酸盐和磷脂等；合成的表面活性剂可分离子天然的表面活性剂有胆酸盐和磷脂等；合成的表面活性剂可分离子型和非离子型，离子型如十二烷基硫酸钠（型和非离子型，离子型如十二烷基硫酸钠（SDSSDS，阴离子型）；十六烷基三甲基溴化铵，阴离子型）；十

25、六烷基三甲基溴化铵（阳离子型），非离子型如（阳离子型），非离子型如Triton X-100Triton X-100和吐温（和吐温（TweenTween）等；）等；v EDTAEDTA鳌合剂：鳌合剂：螯合钙镁离子，常用于处理革兰氏阴性菌；螯合钙镁离子，常用于处理革兰氏阴性菌；v 有机溶剂：有机溶剂：溶解细胞壁上脂类物质，溶解细胞壁上脂类物质，丁酯、丙酮、甲苯、氯仿、二甲苯等；丁酯、丙酮、甲苯、氯仿、二甲苯等；v 变性剂：变性剂：盐酸胍和脲盐酸胍和脲，与水中氢键作用，削弱溶质分子间的疏水作用，从，与水中氢键作用，削弱溶质分子间的疏水作用，从而使疏水性化合物溶于水溶液。而使疏水性化合物溶于水溶液。

26、优点：优点：产物释放具有选择性；处理后的浆液粘度低，易于固液分离。产物释放具有选择性；处理后的浆液粘度低，易于固液分离。1. 缺点：缺点：通用性差；时间长，效率低；有些化学试剂有毒，影响后续处理。通用性差；时间长，效率低；有些化学试剂有毒，影响后续处理。渗透压法 渗透压冲击是较温和的一种破碎方法，将细胞放渗透压冲击是较温和的一种破碎方法，将细胞放在高渗透压的溶液中（如一定浓度的甘油或蔗糖在高渗透压的溶液中（如一定浓度的甘油或蔗糖溶液），由于渗透压的作用，细胞内水分便向外溶液），由于渗透压的作用，细胞内水分便向外渗出，细胞发生收缩，当达到平衡后，将介质快渗出，细胞发生收缩，当达到平衡后，将介质快

27、速稀释，或将细胞转入水或缓冲液中，由于渗透速稀释，或将细胞转入水或缓冲液中，由于渗透压的突然变化，胞外的水迅速渗入胞内，引起细压的突然变化，胞外的水迅速渗入胞内，引起细胞快速膨胀而破裂。胞快速膨胀而破裂。 适用范围：细胞壁较脆弱的细胞或预先用酶处理适用范围：细胞壁较脆弱的细胞或预先用酶处理或在培养过程中加入某些抑制剂，使细胞壁有缺或在培养过程中加入某些抑制剂，使细胞壁有缺陷，强度减弱。陷，强度减弱。反复冻融法 将细胞放在低温下冷冻（约将细胞放在低温下冷冻（约-15-15），然后在室），然后在室温中融化，反复多次而达到破壁作用。由于冷冻，温中融化，反复多次而达到破壁作用。由于冷冻，一方面能使细胞

28、膜的疏水键结构破裂，从而增加一方面能使细胞膜的疏水键结构破裂，从而增加细胞的亲水性能，另一方面胞内水结晶，形成冰细胞的亲水性能，另一方面胞内水结晶，形成冰晶粒，引起细胞膨胀而破裂。晶粒，引起细胞膨胀而破裂。 适用范围：细胞壁较脆弱的菌体。适用范围：细胞壁较脆弱的菌体。 特点：破碎率较低，需反复多次；可能引起某些特点：破碎率较低，需反复多次；可能引起某些蛋白质变性。蛋白质变性。干燥法 经干燥后的细胞，其细胞膜的渗透性发生变化，经干燥后的细胞，其细胞膜的渗透性发生变化，同时部分菌体会产生自溶，然后用丙酮、丁醇或同时部分菌体会产生自溶，然后用丙酮、丁醇或缓冲液等溶剂处理时，胞内物质就会被抽提出来。缓

29、冲液等溶剂处理时，胞内物质就会被抽提出来。 特点：条件变化剧烈，容易引起蛋白质或其他活特点：条件变化剧烈，容易引起蛋白质或其他活性物质变性。性物质变性。破碎率的测定破碎率的测定 直接计数直接计数（1）计数器）计数器（2）显微镜）显微镜 间接计数间接计数 （1） 目的产物测定（蛋白质量或酶活力）目的产物测定（蛋白质量或酶活力）（2） 电导率测定电导率测定破碎技术的研究方向破碎技术的研究方向 多种破碎方法相结合多种破碎方法相结合 与上、中游过程相结合与上、中游过程相结合培养过程的控制培养过程的控制寄主细胞的选择寄主细胞的选择包含体的形成包含体的形成克隆噬菌体溶解基因克隆噬菌体溶解基因耐高温产品的基

30、因表达耐高温产品的基因表达 与下游过程相结合与下游过程相结合包涵体的分离和蛋白质复性 重组重组DNADNA技术为大规模生产目标蛋白质提供了崭新技术为大规模生产目标蛋白质提供了崭新的途径，开辟了现代生物技术发展的新纪元。但是，的途径，开辟了现代生物技术发展的新纪元。但是，人们在分离纯化基因工程表达产物时遇到了意想不人们在分离纯化基因工程表达产物时遇到了意想不到的困难，很多利用大肠杆菌为宿主细胞的外源基到的困难，很多利用大肠杆菌为宿主细胞的外源基因表达产物（如尿激酶、人胰岛素、人生长激素、因表达产物（如尿激酶、人胰岛素、人生长激素、白细胞介素、人白细胞介素、人干扰素等）不仅不能分泌干扰素等）不仅不

31、能分泌到细胞外、而且在细胞内凝聚成没有生物活性的固到细胞外、而且在细胞内凝聚成没有生物活性的固体颗粒包涵体（体颗粒包涵体（ inclusion bodies,IBs)inclusion bodies,IBs) 包涵体主要由蛋白质构成包涵体主要由蛋白质构成，其中大多是基因表达产，其中大多是基因表达产物。这些基因表达产物的一级结构是正确的，但立物。这些基因表达产物的一级结构是正确的，但立体结构是错误的，所以没有生物活性。为此，欲获体结构是错误的，所以没有生物活性。为此，欲获得天然活性态的目标产物，必需分离包涵体后，溶得天然活性态的目标产物，必需分离包涵体后，溶解包涵体并使其中的目标蛋白恢复应有的天

32、然活性。解包涵体并使其中的目标蛋白恢复应有的天然活性。包涵体的洗涤和目标蛋白的变性 包涵体的洗涤包涵体的洗涤 洗涤目的：洗涤目的：溶解除去膜蛋白和脂质类杂质。溶解除去膜蛋白和脂质类杂质。 洗涤原则：洗涤原则：使用的浓度以溶解杂质而不溶解包涵体中表达使用的浓度以溶解杂质而不溶解包涵体中表达产物。产物。 洗涤试剂：洗涤试剂：洗涤常采用较温和的表面活性剂（如洗涤常采用较温和的表面活性剂（如Triton-Triton-100)100)或低浓度的弱变性剂（如尿素）。或低浓度的弱变性剂（如尿素）。 目标蛋白的变性目标蛋白的变性 变性目的：变性目的：目标蛋白溶解于液相以进行分离。目标蛋白溶解于液相以进行分离

33、。 变性增溶剂：变性增溶剂：盐酸胍（盐酸胍（5 58mol/L)8mol/L)、尿素（、尿素（6 68mol/L) 8mol/L) 、表面活性剂（如十二烷基硫酸钠，即表面活性剂（如十二烷基硫酸钠，即SDS,1%SDS,1%2%)2%)、碱溶液碱溶液和有机溶剂（乙腈、丙酮等和有机溶剂（乙腈、丙酮等）（很少用，生物活性和毒性考虑）。）（很少用，生物活性和毒性考虑）。 影响因素：影响因素：作用时间、作用时间、pHpH、离子强度、变性剂种类和浓度、离子强度、变性剂种类和浓度等。等。目标蛋白的复性 目标蛋白的复性目标蛋白的复性 溶解于变性剂溶液（如盐酸胍、脲）中的蛋白质呈变性状态，溶解于变性剂溶液（如盐酸胍、脲）中的蛋白质呈变性状态，即所有的氢键、疏水键全被破坏，疏水侧链完全暴露，但一即所有的氢键、疏水键全被破坏，疏水侧链完全暴露，但一级结构和共价键不被破坏。因此当除去变性剂时，蛋白质可级结构和共价键不被破坏。因此当除去变性剂时，蛋白质可以自动折叠成具有活性的正确构型，这一折叠过程称为蛋白以自动折叠成具有活性的正确构型，这一折叠过程称为蛋白质的复性。质的复性。 复性的方法：复性的方法：稀释法、膜分离法（透析、超滤或电渗析稀释法、膜分离法（透析、超滤或电渗析等）、高效疏水