红细胞血型血清学技术

1、红细胞血型血清学技术 标本 盐水介质凝集试验 酶处理细胞的凝集试验 抗球蛋白试验 聚凝胺的应用 抗体效价滴定 吸收放散试验 凝集抑制试验标本（一）标本采集1红细胞标本 采集方法：针刺耳垂或指尖，直接用生理盐水配成红细胞悬液待用。静脉采血，用抗凝剂（ACD、CPD、Na-EDTA等）抗凝。直接从血凝块（血柱）中洗脱游离的红细胞。（一）标本采集1红细胞标本 特殊情况：用于抗球蛋试验（Coombs试验）的标本要抗凝，否则，补体C3b、C4b容易致敏红细胞造成抗球蛋试验（Coombs试验）假阳性。存在有受Ca2+抑制的自身抗体时，不宜用抗凝血液作为红细胞抗原标本。（一）标本采集2血清标本 采集方法：

2、取静脉血注入干燥试管内，放置37水浴中，凝固后用玻璃棒搅动血块，使之与试管壁剥离，然后放置4冰箱过夜，离心分离血清。 必要时，当血液凝固后即可离心分离血清。（一）标本采集2血清标本需注意的问题： 血清如需于4冰箱保存，需加叠氮钠（NaN3）防腐，叠氮钠（NaN3）终浓度0.1%。 血清如用于制备试剂（如抗A、抗B标准血清）要经过56灭活补体后才能使用。 一般实验避免使用血浆，防止纤维蛋白的干扰。（二）红细胞悬液的配制用于血型鉴定、配血等的红细胞至少要用大量生理盐水洗一次，其目的是通过洗涤可以去除红细胞表面的下列物质：1)少量的血浆蛋白；如 纤 维蛋白原等；2)已溶解红细胞的基质 ； 他们有竞争

3、 抗 体的作用。3)可溶性的抑制物质，如A、B、H、Lewis 等血型物质；4)抗凝剂；他们有抗补 体 作用。红细胞悬液的常用浓度 压积红细胞1滴加8滴生理盐水所配成的悬液约为10%，按此比例配制其他所需浓度的红细胞悬液。2%的红细胞悬液一般用于滴定抗体效价。5%的红细胞悬液一般用于血型鉴定、配血试验、及抗球蛋白试验等大多数血型血清学试验。10%的红细胞悬液一般用于测定抗体的亲和力试验。（三）标本的保存1血清标本没有稀释过的血清如加有防腐剂可在4冰箱保存数月；在-20以下可保存数年而其抗体活性基本不变。用白蛋白或无抗体活性的AB型血清作稀释剂稀释血清后保存，效果和上述相同。用生理盐水稀释过的血

4、清只限当天使用，不能保存。用大分子物质做稀释介质，其对抗体活性不起保护作用。 2红细胞标本 一般试验用的在4冰箱保存下的凝血标本要在5天内使用，以不溶血为准。 ACD保存液或其它特制的保存液可保存红细胞3周。 盐水配制的红细胞悬液只能当天使用，不宜保存。 应注意的问题： 用作交叉配血的供血者、病人标本（血清、细胞）要放4冰箱保存1周，以便在出现输血反应时可备查。 各种保存的红细胞在使用前都要用盐水洗一次以上。盐水介质凝集试验原 理 盐水介质中红细胞上的抗原决定簇与相应抗体分子上的抗原结合部位结合，交叉连结形成肉眼可见的凝集块。用 途：盐水介质凝集试验用于IgM抗体的检出、鉴定、盐水配血试验。盐

5、水抗体鉴定的血型抗原，如ABO、MN、P等血型系统的抗原。例外情况： 在盐水介质中，凝集是IgM抗体的行为。ABO血型系统中的A、B抗原位点多，当IgG抗A、抗B的浓度足够大时，在盐水介质里也能与相应的红细胞发生凝集反应。盐水介质凝集试验 (一)方法 常用的方法有平板法和试管法。盐水介质凝集试验（二）、立即离心法： 用 途： 盐水法鉴定血型和交叉配血时，多采用立即离心(immediate spin)法。正确的操作是红细胞悬液加到血清中后立即离心并观察结果。 延迟立即离心的后果： 反应时间过长而延误立即离心的时间对ABO血型系统的抗体检出影响较大。如果在室温放置2分钟后离心，可能使3+4+的凝集

6、减弱为01+，并伴有溶血现象。如果在室温放置5分钟后离心，原有的凝集可能消失，并有溶血。有的标本在延迟离心后，本来应有的凝集会变为既不凝集也不溶血，因而难以发现ABO血型的不配合，这多数发生在O型人的血清抗体与A型、B型或AB型红细胞反应的试验中，发生率为2%3%。发生上述现象的原因： 反应强的抗A、抗B和抗原强度强的A、B抗原作用时，补体C1在有Ca2+存在的条件下，固定到红细胞膜上，妨碍了红细胞的凝集，进一步可能引起溶血。解决方法：血清与红细胞混合后立即离心用血浆或灭活的血清做试验。用EDTA盐水配制红细胞悬液，以消除这种现象。稀释血清后再做试验可消除这 种现象，因而也称这种现象为前带现象

7、（三）、试验结果的判读和记录 判读结果前应预先设计好记录册，在记录册上标记好细胞样本和血清样本的位置。一定要一边观察，一边记录结果，不能事后记录。常用的记录符号及所示的凝集强度如下:（三）、试验结果的判读和记录 4+：一个大凝集块，背景透明，无游离细胞。 3+：:数个大凝集块，背景透明，无游离细胞。 2+：许多小凝集块，肉眼可见，大小均匀，背景基本透明，有游离细胞。 1+：很小的凝集块，肉眼可见，背景不透明，游离细胞较多，常要用显微镜观察。 W+：:微小凝集块，肉眼很难看清，背景浑浊，要用显微镜观察。 O：无凝集，无溶血，全部是游离细胞，要用显微镜观察。 PH：部分溶血。 H：完全溶血。（四）

8、缗钱状凝集的处理 概 念： 在盐水介质的凝集试验中，常见到缗钱状凝集现象，也称串钱状凝集，这是一种假凝集，由红细胞形成的这种假凝集就象许多硬钱币堆积在一起。缗钱状凝集的特点：1在显微镜下红细胞膜完整；2细胞间界限清晰地成 缗 钱串聚集；3缗钱状假凝集反应不 不 受温度影响；4 室 温 与37结果一样；5这种红细胞的直接抗人球 蛋 白 试 验（Coombs试验）呈阴性反应。 （四）缗钱状凝集的处理 造成红细胞缗钱状凝集的原因： 多种原因可以引起红细胞缗钱状凝集，有内因和外因。 内在因素： 某些疾病致血浆球蛋白异常时，如高球蛋白血症、巨球蛋白血症时会出现缗钱状凝集。 外在因素：病人在使用大分子右旋

9、糖酐和羟乙基淀粉溶液作血容量扩张剂时，也可以产生缗钱状凝集。用玻片法试验时，如温度过高、时间过长，也容易发生这种假凝集，因为玻片接触面大，液体的蒸发面也大，致使血清容易浓缩。缗钱状凝集的解决方法：实验中遇到缗钱状凝集时，可将血清适当稀释后进行实验。在显微镜下观察到缗钱状凝集时，加1滴生理盐水到反应物并混匀，通常可以消除这种假凝集。做试管法实验时如发现缗钱状凝集，可将试管离心，去上清液，沥干，再加2滴生理盐水重新悬浮红细胞观察结果（这种方法称为盐水置换法），假凝集会消失，真凝集不会消失，严重的可重复一次。缗钱状形成不影响间接抗球蛋白试验。酶处理细胞的凝集试验(一)、原理 红细胞表面有丰富的唾液酸

10、，带有负电荷，是红细胞互相排斥的原因。蛋白水解酶能消化破坏这种唾液酸，减少红细胞表面的负电荷。胶粒滑动面上的Zeta电势减小，红细胞的间距缩短，IgG抗体分子能与有相应抗原的红细胞产生凝集。酶法能显著增强Rh和Kidd系统的抗原抗体反应，但蛋白酶能破坏M、N、S、s、Fya和Fyb抗原，酶法不适用这些抗原的检测。(二)、常用酶的种类 常用的酶有菠萝酶、木瓜酶、胰酶、无花果酶等。国内用得较多的是菠萝酶和木瓜酶。 注意事项： 在配制酶溶液时要注意防护，有少数人对菠萝酶、木瓜酶和无花果酶有过敏反应，酶对组织有损伤作用，特别是无花果酶。各种酶粉都容易潮解，要注意密封，宜在4保存。(三)、操作方法 1一

11、期法酶试验 一期法通常也称为直接酶法，菠萝酶和木瓜酶都适用于一期法。在已标记好的试管中加2滴血清和1滴5%的红细胞盐水悬液，再加1滴酶溶液，37孵育15分钟，离心1分钟，观察结果；或37孵育30分钟后直接观察结果。一期法不如二期法敏感，但操作简单，用于抗体筛选和鉴定、Rh定型、交叉配血等比较方便。试验系统通常要设阴性对照、阳性对照和自身对照。 2二期法酶试验 二期法也称为间接酶法。木瓜酶和无花果酶适用于二期法。 二期法分两步完成。 第一步是酶处理红细胞：在1份洗涤压积的红细胞中加2份木瓜酶溶液，37孵育30分钟，用大量pH7.4的PBS洗涤3次，用生理盐水配成5%的悬液备用。第二步是在己标记好

12、的试管中加受检血清2滴，再加1滴酶处理过的红细胞悬液，37孵育1530分钟观察结果，凝集和溶血皆属于阳性。如没有反应可转入抗球蛋白试验。二期法也要设立与一期法相同的对照系统。一般用于抗体筛选和抗体鉴定试验。(四)、酶处理红细胞凝集素 一般概念： 有一些抗体能和胰酶、木瓜酶、菠萝酶等酶处理的细胞发生凝集，但不与未处理的细胞反应，其原因尚不完全清楚，可能是酶处理后某些抗原部位得以暴露，且不同的酶暴露的部位不完全相同。对于这类与酶处理红细胞才发生凝集的抗体称为酶处理细胞凝集素。酶处理细胞凝集素有以下几个特点： 1抗球蛋白法试验没有反应；或反应微弱；常表现为自身凝集或全凝集； 2可以和其他酶处理的细胞

13、发生交叉反应； 3也可能不发生交叉反应； 4偶而有型特异性； 5多表现为Rh血型系统抗体特异性； 6也可能表现为同种异体抗体特异性； 7一些Rh系统的抗体，尤其是抗E和抗C与木瓜酶处理的细胞反应强； 8通常不引起输血反应。抗球蛋白试验（一）、概 念： 抗球蛋白试验（antiglobulin test，AGT）又称Coombs试验，是检查IgG抗体的一种很好的方法。 将抗球蛋白血清（antiglobulin serum，AGS）加入己致敏的红细胞盐水悬液中，红细胞表面的抗体球蛋白（使其致敏的IgG抗体）与抗球蛋白血清中的抗体发生特异性反应，使红细胞发生凝集。 抗球蛋白血清除了可以测定红细胞上Ig

14、G抗体外，还可以测定IgM和IgA，也可以测补体组分（C3、C4）。 所谓广谱AGS即包括抗IgG和抗C3。抗球蛋白试验分为直接抗球蛋白试验和间接抗球蛋白试验。抗球蛋白试验（二）、抗球蛋白试剂：试剂来源简介： 用人体免球蛋白免疫家兔获得。产量少，纯度低，属广谱抗人球蛋白试剂。 用杂交瘤技术制备单克隆抗球蛋白试剂。产量大，纯度高，针对性强，多为单特异性抗球蛋白试剂，如抗IgG、。抗C3等，单克隆的广谱抗人球蛋白试剂为抗IgG、抗C3的混合物。多特异性（广谱）抗球蛋白试剂组成：试剂中含有抗IgG和抗C3d.。用途：主要用于配血试验、抗体筛选、抗体鉴定以及直接抗球蛋白试验（DAT），如溶血性输血反应

15、原因调查、新生儿溶血病检查、自身免疫性溶液血性贫血（AIHA）的检查等。单特异性抗球蛋白试剂试剂种类：有抗IgG、抗IgM、抗IgA、抗C3、抗C4。实际应用以抗IgG、抗C3为主。用 途： 1、用于配血试验、抗体检出和鉴定。 2、对多特异性（广谱）抗球蛋白试验阳性结果进行分型。用抗IgG、抗C3可分出IgG、IgG+C3、C3三个型。 IgM抗体分子在红细胞洗涤过程中容易解离，但同时致敏的补体能牢固地结合在红细胞上而不易解离。因为抗IgM抗体总是结合补体，因此，通过用抗C3测定红细胞上是否结合有补体，则可间接证明红细胞上是否有IgM抗体包被。冷抗体引起的自身免疫性溶血性贫血一般是补体型的。抗

16、IgM在抗球蛋白试验中作用不大。（三）、方 法 抗球蛋白试验分为直接抗球蛋白试验和间接抗球蛋白试验。（一）、直接抗球蛋白试验概 念： 直接抗球蛋白试验是检查体内致敏红细胞的一种方法， 用 途： 用于检查红细胞是否已被不完全抗体所致敏。如新生儿溶血病（胎儿红细胞被母亲血型抗体致敏）、溶血性输血反应（输入的不相合红细胞被病人不完全抗体致敏）、自身免疫性溶血性贫血（病人红细胞被自身抗体致敏）以及药物诱导产生的自身抗体（由甲基多巴类药物，青霉素等所致）。.直接抗球蛋白试验（1）操作方法 1取受检查红细胞，以生理盐水洗涤3次，配成3%红细胞盐水悬液。 2取上述受检者红细胞盐水悬液1滴，滴入试管，加抗球蛋

17、白血清1滴，混匀。 3阳性对照：不完全抗D血清致敏的3%D阳性红细胞悬液1滴，加抗球蛋白血清1滴，混匀。. 4阴性对照：正常人3%D阳性红细胞悬液1滴加抗球蛋白血清1滴，混匀。 5受检者以及阳性，阴性对照管同时离心，观察结果。直接抗球蛋白试验（2）结果判定 如阳性对照管凝集，阴性对照管不凝集，受检红细胞凝集者为阳性，不凝集者为阴性。直接抗球蛋白试验（3）注意事项1)标本采取后立即进行试验，延迟试验或中途停止可使抗体从细胞上解离，造成假阴性结果。2)抗球蛋白血清应按说明书使用最适稀释度，否则，可产生前带和后带反应，而误为阴性结果。3)受检红细胞一定要用盐水洗涤3次，除去红细胞悬液中混杂的血清蛋白

18、，以防止假阴性结果。4)如果要了解体内致敏红细胞的免疫球蛋白类型，可分别以抗IgG、抗IgM或抗C3单价抗球蛋白清进行分型试验。直接抗球蛋白试验注意事项5)红细胞上吸附抗体太 少 ，或Coombs阴性的自身免 疫 性溶血性贫 血 ，其直接抗 球 蛋白试验可 呈 假阴性反应。 6) 全凝集或冷疑集血液标本及含有Wharton胶（华通氏胶）的脐血标本，且洗涤不充分；血液标本中有很多网织红细胞，且抗球蛋白血清中含有抗运铁蛋白时，都可使红细胞产生凝集（假阳性结果）。（二）、间接抗球蛋白试验概 念 它是一种检测血清中不完全血型抗体的方法。即用已知抗原红细胞测定受检血清中相应的不完全抗体，或用已知抗体的抗

19、血清测定受检红细胞上相应抗原。间接抗球蛋白试验用 途： 常用于血型鉴定，抗体的检出和鉴定，输血前交叉配血试验以及其它的特殊研究。（1）操作方法 1取试管3支，标明受检管，阳性对照及阴性对照。 2按下表将各反应物加入相应试管内。间接抗人球蛋白试验（1）操作步骤 反应物： 受检管，阳性对照管，阴性对照管； 血清（已知或受检），2滴2-5%红细胞悬液（已知或受检），1滴不完全抗D血清，2滴AB型血清，2滴5%D阳性红细胞悬液1滴。 37水浴60min，洗涤3次。 每管各加最适稀释度抗球蛋白血清1滴，混匀，离心，观察结果。间接抗人球蛋白试验（2）结果判定 阳性对照管凝集，阴性对照管不凝集，受检管出现凝

20、集者为阳性，受检管不出现凝集者为阴性。 效价滴定 如果受检者血清中检出IgG抗体，可将受检者血清以盐水做倍量稀释后，按上法进行测定。间接抗人球蛋白试验（3）、注意事项 红细胞洗涤应迅速，一开始洗涤就不应中途停止。洗涤用盐水要足量并用力冲入管底，使压积于管底的红细胞松离。切勿用手指堵住管口，颠倒混匀，以防污染来自皮肤的蛋白。 离心速度和时间十分重要，应按规定进行。 如果检查的抗体为补体依赖抗体，则必需加入新鲜AB型血清，抗球蛋白血清中也应含有抗C3。 间接抗人球蛋白试验（四）、试剂对照细胞的制备 在直接和间接抗球蛋白试验中，阴性结果都要用IgG抗体致敏的试剂对照红细胞检查证实。间接抗人球蛋白试验

21、（四）、试剂对照细胞的制备1、IgG致敏的试剂对照红细胞 等量的IgG抗D+O型Rh(+)红细胞于37水浴30分钟，用大量的生理盐水洗涤3次后再用盐水悬浮成5%的红细胞即可。间接抗人球蛋白试验（四）、试剂对照细胞的制备 2、补体致敏的试剂对照红细胞 20ml10%的蔗糖溶液+46滴新鲜血液，或加2滴洗涤过的压积红细胞和4滴AB型新鲜血清，37水浴15分钟，用大量的生理盐水洗涤3次后再用盐水悬浮成5%的红细胞即可。间接抗人球蛋白试验（五）、增强抗球蛋白试验的方法目的：加快抗体致敏速度或增强敏感性。1酶 法：2低离子介质法：3牛白蛋白法：4聚乙二醇（PEG）法：聚凝胺的应用（一）、原 理 聚凝胺（

22、polybrene），一种高价阳离子季胺盐多聚物，溶解后能产生很多正电荷，可中和红细胞表面的负电荷，使红细胞之间距离减少，能引起正常红细胞可逆性的非特异性凝集。如果是抗体致敏的红细胞被聚凝胺凝集，则凝集不可逆。在检测抗体活性的聚凝胺试验中红细胞和血清首先在低离子介质中孵育，促进抗体与红细胞结合，然后加入聚凝胺使细胞聚集。离心后，聚集的细胞不再悬浮，加入重新悬浮液，聚凝胺的聚集作用可通过加入枸橼酸钠而中和，使正常红细胞的聚集解散，而抗体引起的凝集仍存在。聚凝胺试验原理 （二）试剂和材料 1低离子介质（LIM） 2聚凝胺 3重新悬浮液（枸橼酸三钠）（三）操作方法 1在试管中加2滴受检血清或试剂血清

23、，1滴2%5%受检红细胞或试剂红细胞，混匀。 2加LIM溶液0.6ml，混合均匀，室温孵育1min。 3 加2滴0.05%聚凝胺溶液，混合后静置15s。 41300g/min，离心15s，倾去上清液。不再悬浮细胞。 5轻轻摇动试管，目测细胞有无凝集，如无凝集，必须重做。 6 加入2滴重新悬浮液，并轻轻混合，观察结果。（四）结果判定 如凝集散开，则为聚凝胺引起的非特异性凝集，为阴性反应；如.凝集不散开，则为抗原抗体结合的特异性反应，为阳性反应，如肉眼观察凝集强度弱，可进一步在显微镜下观察有无凝集。（五）注意事项 1可以用含ETDA之血浆代替血清。 2当重新悬浮液加入后，应尽快观察结果（不可超过3

24、min，以免反应消失）。 30.05%聚凝胺溶液若放在玻璃瓶太久会变弱，所以必须保存在塑料瓶中。 4聚凝胺是一种抗肝素药物，所以使用含肝素之标本，要加稍多之聚凝胺来中和肝素。抗体效价滴定（一）、概 念、注意事项 将血清在稀释液中连续倍比稀释后，与特定抗原的红细胞在特定的反应介质中进行凝集反应，通常以肉眼观察到的最后一个“1+”的凝集管作为判断反应终点，终点管血清的稀释倍数的倒数则为该抗体的效价，或称为滴度。举 例 说 明： 抗 A效 价 测 定 试 管 编 号 1 2 3 4 5 6 7 8稀 释 倍 数 2 4 8 16 32 64 128 256 各 管 分 别 加 入 1滴 2%的 A型

25、 红 细 胞 ， 混 匀 后 立 即 离 心 凝 集 强 度 4+ 4+ 4+ 3+ 2+ + w+ 0 根 据 上 述 结 果 判 断 抗 A抗 体 的 效 价 （ 滴 度 ） 为 ： 1： 64 注意点： 效价滴定属半定量试验，间接推测抗体浓度有一定实用价值， 但用它来测定抗体含量是不准确的。 因为： 这种效价只表示结合到红细胞上抗体的量。只是亲合力大的抗体结合到红细胞上。 终点观察方法不 同，数据结果也不同。 （肉眼、显微镜）所用的指示红细胞的抗原性强弱不同结果也有差异。 人为误差大。操作者手法和环境温度等都会影响结果。 根据抗体的血清学行为性质而选用不同的效价测定方法。如抗体分子属Ig

26、M性质（如抗A、抗B、抗M等）则用盐水介质法；抗体分子属IgG性质则选用检测不完全抗的方法，如酶法、抗球蛋白法、聚凝胺法等。(二)、IgM与IgG抗体分子的区别(见免疫血液学基础) 1 血型抗体免疫球蛋白的有关特点 I Ig gM M I Ig gG G分子量 950 000 150 000沉降系数（S） 19 7分子长度 最短边350nm 最长边250nm563小时处理 活性减弱 活性不受影响2-巯基乙醇处理 降解 不受影响固定补体 能 能通过胎盘 不能 能血型物质的作用 易被中和 难被中和 2巯基化学试剂灭活IgM分子的原理： IgM分子由5个辐射状排列的亚单位组成，亚基间以二硫键相连。亚

27、基间的二硫键比亚基内的链间及链内二硫键容易被巯基化学试剂破坏，经巯基化学试剂（2-Me、DTT等）处理后，19S的IgM分子成为与IgG和IgA单体一样的7S分子，使IgM抗体失去原来的血清学性质，失去其与相应红细胞凝集的能力。IgG抗体分子则不被巯基化学试剂灭活，保持与相应红细胞致敏的血清学特性。IgA抗体分子可部分被灭活（7S单体不受影响，9S及11S多聚体被灭活）。小 结 2-巯基乙醇简称为2-Me；二硫苏糖醇简称为DTT。它们都有灭活IgM抗体的能力。 抗A、抗B抗体一般为IgG+IgM混合型。IgG和IgM型抗体具有相同特异性。其中的IgG型抗体对新生儿溶血病有临床意义，因IgM抗体

28、能在盐水介质中凝集红细胞而掩盖了IgG抗体的凝集，所以在检测IgG抗体前必须将起干扰作用的IgM抗体破坏，常用的方法是巯基化学试剂处理法。吸收放散试验吸收试验 本试验用以间接证明红细胞上的血型抗原及其强度，常用于ABO亚型的鉴定，全凝集红细胞的定型以及某种原因引起红细胞血型抗原减弱时的定型等。当受检细胞加入已知效价的抗A及抗B血清后，若红细胞上有相应的抗原，便吸收血清中的抗体，使抗体活性减弱或消失。再以已知抗原的红细胞来滴定抗体效价，比较吸收前后抗血清中抗体的效价，便可证明受检红细胞上有无相应抗原以及强度。间接判定受检红细胞的血型及其亚型的种类。 吸收试验也用于自身抗体的吸收、一份血清中几种特