第十三章工业微生物菌种复壮和保藏

1、第十三章第十三章 工业微生物菌种复壮和保藏工业微生物菌种复壮和保藏 性状稳定的菌种是微生物学工作最重要的基性状稳定的菌种是微生物学工作最重要的基本要求，否则生产或科研都无法正常进行。本要求，否则生产或科研都无法正常进行。 影响微生物菌种稳定性的因素：影响微生物菌种稳定性的因素： a）变异；）变异； b）污染；）污染； c）死亡。）死亡。第一节第一节 菌种的退化与复壮菌种的退化与复壮 菌种退化，菌种退化，主要指生产菌种的或选育过程筛选出来主要指生产菌种的或选育过程筛选出来的较优良的菌株，由于进行移接传代或保藏之后，群体的较优良的菌株，由于进行移接传代或保藏之后，群体中某些生理特性和形态特征逐渐减

2、退或完全丧失的现象。中某些生理特性和形态特征逐渐减退或完全丧失的现象。 菌种退化的才集中表现：菌种退化的才集中表现：代谢产物合成能力下降；产代谢产物合成能力下降；产量低、发酵力和糖化力降低，孢子数量减少，菌落变小，量低、发酵力和糖化力降低，孢子数量减少，菌落变小，生长速度减慢等。生长速度减慢等。一、菌种的退化原因一、菌种的退化原因（一）基因突变（一）基因突变1. 基因突变导致菌种退化基因突变导致菌种退化（1）表型延迟现象；）表型延迟现象；（2）双核或多核孢子分离；）双核或多核孢子分离；（3）非正倍体或部分双倍体分离、）非正倍体或部分双倍体分离、纯菌种纯菌种自发突变自发突变不纯菌种不纯菌种突变个

3、体突变个体传代增殖传代增殖原始个体原始个体衰退衰退菌种菌种2. 质粒脱落导致菌种退化质粒脱落导致菌种退化 细胞中控制产量的质粒脱落或者核内细胞中控制产量的质粒脱落或者核内DNA和质粒复和质粒复制不一致，经过多代繁殖后，某些细胞中将出现不具有制不一致，经过多代繁殖后，某些细胞中将出现不具有这一类对产量起决定作用的质粒，这些细胞出现的比例这一类对产量起决定作用的质粒，这些细胞出现的比例越来越大，以致产量下降，菌种退化。越来越大，以致产量下降，菌种退化。（二）连续移代（二）连续移代 菌种移接代数越多，发生突变的概率就越高。菌种移接代数越多，发生突变的概率就越高。（三）培养和保藏条件的影响（三）培养和

4、保藏条件的影响 不良的培养条件，如培养基组成、不良的培养条件，如培养基组成、pH值、通气等和值、通气等和保藏条件如营养、培养基含水量，温度、氧气等，不仅保藏条件如营养、培养基含水量，温度、氧气等，不仅会诱导低产基因型菌株的出现，而且会造成低产基因和会诱导低产基因型菌株的出现，而且会造成低产基因和高产基因细胞的数量比发生变化。高产基因细胞的数量比发生变化。 要采用减少传代、经常纯化、创造良好的培养条要采用减少传代、经常纯化、创造良好的培养条件，用单细胞移植传代以及科学的保藏方法等措施，件，用单细胞移植传代以及科学的保藏方法等措施，不但可以使菌种保持优良的生产能力，而且还能使不但可以使菌种保持优良

5、的生产能力，而且还能使已退化的菌种得到恢复提高。已退化的菌种得到恢复提高。二、菌种退化的防止二、菌种退化的防止1. 尽量减少传代尽量减少传代2. 菌种经常纯化菌种经常纯化（1）注重菌落的纯化；）注重菌落的纯化；（2）单细胞或单孢子的纯化；）单细胞或单孢子的纯化； 实际工作中，要注意观察和归纳，每次移接时，要实际工作中，要注意观察和归纳，每次移接时，要有意识地挑选这种菌落类型进行传代，就可以较长时期有意识地挑选这种菌落类型进行传代，就可以较长时期地保持优良的性状。地保持优良的性状。3. 创造良好的培养条件创造良好的培养条件 究竟什么样的培养基能保持菌种的优良特性，应进究竟什么样的培养基能保持菌种

6、的优良特性，应进行专门的实验研究。行专门的实验研究。4. 用单细胞移植传代用单细胞移植传代 对以霉菌和放线菌，由于菌丝可能是多核的，所以对以霉菌和放线菌，由于菌丝可能是多核的，所以尽可能用单核的孢子移接，如采用棉花团沾取孢子接种。尽可能用单核的孢子移接，如采用棉花团沾取孢子接种。5. 采用有效的菌种保藏方法采用有效的菌种保藏方法（1）良好的保藏培养基；）良好的保藏培养基；（2）良好的保藏的温度条件。）良好的保藏的温度条件。（一）菌种复壮的原理（一）菌种复壮的原理（1）狭义的复壮：狭义的复壮：从衰退的菌种群体中把少数从衰退的菌种群体中把少数正常个正常个体体再找出来，重新获得具有原有典型性状的菌种

7、。再找出来，重新获得具有原有典型性状的菌种。（2）广义的复壮：广义的复壮：有意识地利用微生物会发生自发突有意识地利用微生物会发生自发突变的特性，在日常的菌种维护工作中不断筛选变的特性，在日常的菌种维护工作中不断筛选“正变正变”个体个体。三、菌种的复壮及其方法三、菌种的复壮及其方法（二）菌种复壮的主要方法（二）菌种复壮的主要方法1. 纯种分离纯种分离（1 1）菌落纯：）菌落纯：是只要求达到菌落纯化的水平，通过稀是只要求达到菌落纯化的水平，通过稀释平板法、划线法、表面涂血法等常规操作法，释平板法、划线法、表面涂血法等常规操作法，该方法较为粗放，适用于菌退化不太严重的情况。该方法较为粗放，适用于菌退

8、化不太严重的情况。（2 2）细胞纯：）细胞纯：采用单胞分离法，也可以二者结合，先采用单胞分离法，也可以二者结合，先用前一种方法获得较纯的菌种后再采用单胞分离用前一种方法获得较纯的菌种后再采用单胞分离法进一步纯化。法进一步纯化。 通过物理、化学的方法处理菌体通过物理、化学的方法处理菌体( (或孢子或孢子) )，使大，使大部分死亡部分死亡(80%(80%以上以上) )，存活的菌多为生长健壮者，可，存活的菌多为生长健壮者，可从中选出优良菌种来。从中选出优良菌种来。2. 淘汰法淘汰法3. 宿主体内复壮法宿主体内复壮法 对于寄生性微生物如苏云金杆菌、白僵菌、多角体对于寄生性微生物如苏云金杆菌、白僵菌、多

9、角体病毒等，由于长期使用，其毒力会下降，导致杀虫效率病毒等，由于长期使用，其毒力会下降，导致杀虫效率降低待衰退现象。这时可以用菌种却感染菜青虫幼虫等，降低待衰退现象。这时可以用菌种却感染菜青虫幼虫等，然后从致死的虫体上重新分离，经过几次重复感染与分然后从致死的虫体上重新分离，经过几次重复感染与分离，就可以逐步恢复和提高毒力。离，就可以逐步恢复和提高毒力。第二节第二节 工业微生物菌种的保藏工业微生物菌种的保藏 工业微生物菌种保藏与其他目的的菌种保藏要求有工业微生物菌种保藏与其他目的的菌种保藏要求有所不同。所不同。 工业微生物菌种保藏，是要使菌种生产能力和与生工业微生物菌种保藏，是要使菌种生产能力

10、和与生产工艺相适应的优良性状保持稳定，当然做不到绝对不产工艺相适应的优良性状保持稳定，当然做不到绝对不变，只是力求把这种衰退现象推迟减缓到最低限度。变，只是力求把这种衰退现象推迟减缓到最低限度。 一、菌种保藏一、菌种保藏目的：目的：在一定时间内使菌种在一定时间内使菌种不死、不变、不乱不死、不变、不乱，以供，以供研研究、生产、交换究、生产、交换之用。之用。基本原则：基本原则：1 1、挑选典型菌种的、挑选典型菌种的优良纯种优良纯种 2 2、尽量使用、尽量使用分生孢子、芽孢分生孢子、芽孢等休眠体等休眠体 3 3、创造有利于休眠的保藏环境（如、创造有利于休眠的保藏环境（如干燥、干燥、低温、缺营养、缺氧

11、低温、缺营养、缺氧） 4 4、尽可能多的采用、尽可能多的采用不同的手段不同的手段保藏一些比保藏一些比较重要的微生物菌株较重要的微生物菌株1、斜面保藏法、斜面保藏法 简单冷冻（低温简单冷冻（低温40C冰冰箱），保藏箱），保藏3-6个月，优点个月，优点是简单方便，缺点是保藏时是简单方便，缺点是保藏时间不长，此法细菌保存采用间不长，此法细菌保存采用的较多。的较多。 2、石蜡保藏：、石蜡保藏： 利用缺氧、冷却。（细利用缺氧、冷却。（细菌、无孢子的丝状菌，如菌、无孢子的丝状菌，如920产生菌）石蜡使斜面与产生菌）石蜡使斜面与空气隔绝，造成缺氧环境。空气隔绝，造成缺氧环境。保藏期：一年左右。（视菌保藏期：

12、一年左右。（视菌种）注意：石蜡层太高，过种）注意：石蜡层太高，过于缺氧。菌种不能利用石蜡于缺氧。菌种不能利用石蜡油作碳源。油作碳源。3、干燥保藏法、干燥保藏法（1）砂土管保藏法）砂土管保藏法 常采用的保藏方法之一，创造和大自然一样的环境，常采用的保藏方法之一，创造和大自然一样的环境，在在低温、干燥、缺氧、缺营养条件低温、干燥、缺氧、缺营养条件下保藏。主要用于保下保藏。主要用于保藏产孢子的放线菌、霉菌及产芽孢的细菌。藏产孢子的放线菌、霉菌及产芽孢的细菌。（2） 滤纸条保藏法滤纸条保藏法 将菌体细胞或孢子吸附在湿的无菌滤纸上，再干燥后将菌体细胞或孢子吸附在湿的无菌滤纸上，再干燥后置于低温保藏。适合

13、霉菌、酵母和细菌的保藏。置于低温保藏。适合霉菌、酵母和细菌的保藏。3. 无水硅胶保藏法无水硅胶保藏法4. 麸皮保藏法麸皮保藏法 以无水硅胶为载体的菌种干燥保藏法，适合霉菌和酵以无水硅胶为载体的菌种干燥保藏法，适合霉菌和酵母细胞的保藏。母细胞的保藏。 以麸皮为载体，吸附接入的孢子，然后在低温干燥条以麸皮为载体，吸附接入的孢子，然后在低温干燥条件下保存，该法适合产孢子的霉菌和放线菌的保藏。件下保存，该法适合产孢子的霉菌和放线菌的保藏。（四）冷冻干燥：（四）冷冻干燥： （1） 原理原理 在较低的温度下（在较低的温度下（-15），快速地将细胞冻结，），快速地将细胞冻结，并且保持细胞完整，然后在真空中使

14、水分升华。细胞并且保持细胞完整，然后在真空中使水分升华。细胞损伤少，成活率高，保藏期损伤少，成活率高，保藏期10-30年年 是目前常用的是目前常用的 较较理想的一种方法。理想的一种方法。（2）步骤）步骤 灭菌好的保护剂（脱脂牛奶、血清）洗下成熟斜灭菌好的保护剂（脱脂牛奶、血清）洗下成熟斜面孢子或菌体，制菌悬液，装入安瓿瓶中，塞上棉花，面孢子或菌体，制菌悬液，装入安瓿瓶中，塞上棉花，冷冻抽干冷冻抽干封口封口 火花真空检测仪检查真空度（火花真空检测仪检查真空度（ 4 冰箱保藏（干燥器中）。冰箱保藏（干燥器中）。 （五）真空干燥法（五）真空干燥法 菌种不采用冷冻干燥，而在是常温下真空干燥，适菌种不采

15、用冷冻干燥，而在是常温下真空干燥，适用于细菌、放线菌、酵母和噬菌体的保藏，不适合丝状用于细菌、放线菌、酵母和噬菌体的保藏，不适合丝状真菌的保藏。真菌的保藏。（六）液氮保藏法：（六）液氮保藏法： 将需保藏的孢子或菌体悬浮于将需保藏的孢子或菌体悬浮于10（v/v）的甘油）的甘油和和10% 的二甲亚砜保护剂，并放入安瓿管中，火焰封的二甲亚砜保护剂，并放入安瓿管中，火焰封口后将安瓿管以口后将安瓿管以10C /分速度冻结，慢慢冻结到分速度冻结，慢慢冻结到350C ，放入液氮冰箱（放入液氮冰箱（-1500C -1960C）。）。 此法适用于各类微生物菌种的保藏，尤其是一些此法适用于各类微生物菌种的保藏，尤

16、其是一些不产孢子的菌丝体，用其它保藏方法不理想，而采用不产孢子的菌丝体，用其它保藏方法不理想，而采用此法。此法。 优点：优点：存活率高，稳定性强，是长期保藏菌种的最存活率高，稳定性强，是长期保藏菌种的最好方法。但要具有液氮和超低温的冷冻条件，不易推好方法。但要具有液氮和超低温的冷冻条件，不易推广。国外已普遍采用，国内也有部分单位采用。广。国外已普遍采用，国内也有部分单位采用。 （七）液相保藏法（七）液相保藏法 蒸馏水保藏法蒸馏水保藏法 磷酸盐缓冲液保藏法磷酸盐缓冲液保藏法 食盐溶液保藏法食盐溶液保藏法二、菌种保藏注意事项二、菌种保藏注意事项 保藏的菌种要用良好的培养基；保藏的菌种要用良好的培养基；在各种保藏方法操作中，要严格的无菌操作；在各种保藏方法操作中，要严格的无菌操作；要注意保藏菌种的制备质量；要注意保藏菌种的制备质量；要为菌种创造最适宜的保藏条件；要为菌种创造最适宜的保藏条件；严格控制传代次数，严格控制传代次数