第四章固定化酶ppt

1、第章四第章四 酶、细胞、原生质体固定化酶、细胞、原生质体固定化一、概述一、概述Immobilized enzymew 固定化酶的研究从50年代开始，1953年德国的格鲁布霍费（Grubhofer）和施莱思（Schleith）采用聚氨基苯乙烯树脂为载体，经重氮化法活化后，分别与羧化酶、淀粉酶、胃蛋白海、核糖核酸酶等结合，而制成固定化酶。w 20世纪年代初，以色列科学家发现生物细胞里的许多酶并不是单独在水溶液里起作用，而是包埋在细胞膜里或其他细胞器里面起作用的。于是，他试着把分离得到的酶结合到某种不溶于水的载体上，或者是包埋于天然的或人工合成的膜上，这样就装配成了固定化酶。接着又对固定化酶的催化特

2、性进行观察，发现许多酶经过固定化以后，活性丝毫未减，稳定性反而提高了。在反应容器里，固定化酶可以反复利用，成百上千次发挥效能，以不变促万变。w 这一发现是酶的推广应用的转折点，也是酶工程发展的转折点。在此基础上，酶的固定化技术日新月异。w60年代后期，固定化技术迅速发展。 1969年，日本的千烟一郎首次在工业生产规模应用固定化氨基酰化酶从DL-氨基酸连续生产L-氨基酸，实现了酶应用史上的一大变革。w此后，固定化技术迅速发展，促使酶工程作为一个独立的学科从发酵工程中脱颖而出。w 固定化酶是指固定在载体上并在一定的空间范围内进行催化反应的酶。w 固定化酶既保持了酶的催化特住，又克服了游离酶的不足之

3、处，具有增加稳定性，可反复或连续使用以及易于和反应产物分开等显著优点。固定化酶的优点以及局限性w优点：不溶于水，易于与产物分离；可反复使用；可连续化生产；稳定性好。w缺点：固定化过程中往往会引起酶的失活固定化酶活力回收率低，且不适合用于高分子质量的底物。高果糖浆也称果葡糖浆或异构糖浆，它是以酶法糖化淀粉所得的糖化液，经葡萄糖异构酶的异构作用，将其中一部分葡萄糖异构成果糖，由葡萄糖和果糖而组成的一种混合糖糖浆。高果糖浆的生产流程玉米淀粉玉米淀粉 液化、糖化液化、糖化 葡萄糖浆葡萄糖浆 膜过滤膜过滤 离交、浓缩离交、浓缩 异构化异构化 部分部分变成果糖（变成果糖（42%42%）混合混合 浓缩、精制

4、浓缩、精制 55%55%高果糖浆高果糖浆参与的酶：参与的酶：淀粉酶、淀粉葡萄糖苷酶淀粉酶、淀粉葡萄糖苷酶葡萄糖异构酶葡萄糖异构酶淀粉酶能将淀粉水解为葡萄糖吗?固定化菌体w 用于固定化的酶，起初都是采用经提取和分高纯化后的酶。w 随着固定化技术的发展，也可采用含酶菌体或菌体碎片进行固定化，直接应用菌体或菌体碎片中的酶或酶系进行催化反应，这称之为固定化菌体或称固定化死细胞。w 1973年，日本首次在工业上成功地应用固定化大肠杆菌菌体中的天门冬氨酸酶，由反丁烯二酸连续生产L天门冬氨酸。固定化酶和固定化菌体都是以酶的应用为目的，它们的制备和应用方法也基本相同 在固定化酶和固定化菌体的基础上，70年代后

5、期出现了固定化细胞技术。固定化细胞是指固定在载体上并在一定的空间范围内进行生命活动的细胞。也称为固定化活细胞或固定化增殖细胞。w 1976年，法国首次用固定化酵母细胞生产啤酒和酒精。1978年，日本用固定化枯草杆菌细胞生产-淀粉酶的研究成功，开始了用固定化细胞生产酶的先例。w 郭勇等郭勇等人从1984年开始，在国内首次进行固定化细胞生产淀粉酶、糖化酶和果胶酶等的研究，取得良好效果。 1979年，固定化毛地黄细胞和长春花细胞的研究成功，推动了固定化植物细胞和动物细胞的研究，为动植物来源的天然产物的工业化生产开辟了新的途径。固定化原生质体w 1982年，日本首次研究用固定化原生质体生产谷氨酸，取得

6、进展。说明细胞制备成固定化原生质体后，由于有载体的保护，稳定性较好，同时由于解除了细脑壁这一扩散障碍，更有利于胞内物质约分泌。w 19861986年，郭勇等年，郭勇等人首次用固定化原生质体生产细胞间质中存在的碱性磷酸酶，取得可喜成果，随后，又进行了固定化原生质体生产葡萄糖氧化酶和谷氨酸脱氢酶等的研究，为胞内酶生产技术路线的变革提供了新的方法。 固定化细胞和固定化原生质体以酶等各种代谢产物的生产为目的，它们可以代替游离细胞进行酶的发酵生产，具有提高产酶率，缩短发酵周期并可连续发酵生产等优点。在酶的发酵生产中有广阔的发展前景。二、二、 酶固定化酶固定化一、酶固定化的方法一、酶固定化的方法载体偶联法

7、（键合法）载体偶联法（键合法）w 使酶分子上的某些非必需的游离基团通过共价键（离子键）与不溶性载体结合的固定化方法叫做共价键合法（离子键合法）。w （键合法或载体偶联法）。离子结合法离子结合法 酶分子含有离子交换基团的固相载体在适宜的pH和离子强度条件下，利用酶的侧链解离基团和离子交换剂的相互作用而达到酶的固定化的方法，称为离子键合法。常用的交换剂有CM-纤维素、DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等，其它还有各种合成的离子交换树脂如Amberlite XE-97、Dower-50等。通常50150mg蛋白/g载体。w 第一个离子结合法固定化酶： DEAE Cellulose 固定化过氧化氢

8、酶w 第一个工业化的固定化酶： DEAE-Sephadex A-50 固定化氨基酰化酶共价键合法http:/ 酶分子和载体连接的功能基团酶分子和载体连接的功能基团 从理论上讲，酶蛋白上从理论上讲，酶蛋白上可供载体结合的功能基团有以下几种：可供载体结合的功能基团有以下几种： 酶蛋白酶蛋白NN端的氨基或赖氨酸残基的端的氨基或赖氨酸残基的- -氨基。氨基。 酶蛋白酶蛋白C-C-端的羧基以及端的羧基以及AspAsp残基的残基的- -羧基和羧基和GluGlu残基残基- -羧基。羧基。 CysCys残基的巯基。残基的巯基。 SerSer、TyrTyr、ThrThr残基的羟基。残基的羟基。 PhePhe和和

9、TyrTyr残基的苯环。残基的苯环。 HisHis残基的咪唑基。残基的咪唑基。 TrpTrp残基的吲哚基。残基的吲哚基。 在实际中偶联最普遍的基团是：氨基、羧基以及苯环。在实际中偶联最普遍的基团是：氨基、羧基以及苯环。被偶联的基团还应是酶活性的非必需基团，否则将导致酶被偶联的基团还应是酶活性的非必需基团，否则将导致酶失去活性。失去活性。载体的选择载体的选择 载体直接关系到固定化酶的性质和形成。对载体直接关系到固定化酶的性质和形成。对载体的一般要求是载体的一般要求是: : 一般亲水载体在蛋白质结合量和固定化酶一般亲水载体在蛋白质结合量和固定化酶活力及其稳定活力及其稳定 性上都优于疏水载体。性上都

10、优于疏水载体。 载体结构疏松，表面积大，有一定的机械载体结构疏松，表面积大，有一定的机械强度。强度。 载体必须有在温和条件与酶共价结合的功载体必须有在温和条件与酶共价结合的功能基团。能基团。 载休没有或很少有非专一性吸附。载休没有或很少有非专一性吸附。 载体来源容易便宜并能反复使用。载体来源容易便宜并能反复使用。常用的不溶性载体：常用的不溶性载体：w 一类是天然大分子，如纤维素、葡萄糖凝胶、琼脂糖、淀粉以及它们的衍生物等；w 另一类是人工合成的高聚物，如甲基丙烯酸共聚物、顺丁烯二酸酐和乙烯的共聚物、氨基酸共聚物及聚苯乙烯等。偶联反应 酶和载体的连接反应取决于载体上的功能基团和酶分子上的非必需侧

11、链基团，而且是在十分温和的pH、中等离子强度和较低温的缓冲液中进行。 现已有许多种偶联反应都能制备固定化酶。这些方法在实际运用中着决定性作用，必须考虑到酶的偶联效率固定化酶总活力，操作的简便性以及载体与试剂的成本等因素。w要使载体与酶形成共价键，必须首先使载体活化，即借助于某种方法，在载体上引进某一活泼基团。然后此活泼基团再与酶分子上的某一基团反应，形成共价键。 固定化酶的制法是：利用酶所带的官能团（固定化酶的制法是：利用酶所带的官能团（NHNH2，COOHCOOH，SHSH，咪唑基，苯酚基等）与高分子化合物的官，咪唑基，苯酚基等）与高分子化合物的官能团进行反应制得，例如将含能团进行反应制得，

12、例如将含C C6H H4NCSNCS的聚丙烯酰胺的的聚丙烯酰胺的官能团官能团C C6H H4NCSNCS与含与含NHNH2的酶中的官能团的酶中的官能团NHNH2作用，可作用，可得以下固定化酶：得以下固定化酶： 使载体活化的方法很多。主要的有重氮法、迭氮法、使载体活化的方法很多。主要的有重氮法、迭氮法、溴化氰法和烷化法等。现分述如下：溴化氰法和烷化法等。现分述如下：重氮法 将含有苯氨基的不溶性载体与亚硝酸反应，生成重氮盐将含有苯氨基的不溶性载体与亚硝酸反应，生成重氮盐衍生物，使载体引进了活泼的重氮基团，此衍生物与酶蛋白分衍生物，使载体引进了活泼的重氮基团，此衍生物与酶蛋白分子中子中酪氨酸的酚基酪

13、氨酸的酚基或或组氨酸的咪唑基组氨酸的咪唑基发生偶联反应，而成固定发生偶联反应，而成固定化酶。化酶。重氮法重氮法 是将带芳香族氨基的载体，先用是将带芳香族氨基的载体，先用NaNO2和稀盐酸和稀盐酸酸处理成重氮盐衍生物，再在中性偏碱酸处理成重氮盐衍生物，再在中性偏碱(pH89)条件下条件下与酶蛋白发生偶联反应，得到固定化酶。与酶蛋白发生偶联反应，得到固定化酶。w 可能与酶蛋白中Tyr的酚基，His的咪唑基生成重氮衍生物，在过量重氮盐存在下还可与酶蛋白的N端氨基或Lys的氨基形成双偶氮化合物。叠氮法 带有羧基或羟基、羧甲基等的载体，首先在酸性条件下用甲醇处理使之酯化，再用肼处理形成酰肼，最后在HNO

14、2作用下转变成叠氮衍生物。此衍生物在低温下可与酶蛋白的羟基、酚基或巯基等反应，但产物可用中性羟胺水解掉，使之仅与一NH2反应。 此法常用载体有羧甲基纤维素、此法常用载体有羧甲基纤维素、CMSephadex、聚天、聚天冬氨酸、冬氨酸、BioGel.CM100、乙烯、乙烯顺丁烯二酸酐共聚物、顺丁烯二酸酐共聚物、Amberlite IRC50等。叠氮法用途较广，举例如下：等。叠氮法用途较广，举例如下： 以以CM一纤维素一纤维素(CMC)叠氮衍生物为载体固定化胰蛋白酶。叠氮衍生物为载体固定化胰蛋白酶。首先，载体的酯化与肼解：CMC依次用水、乙醇和乙醚洗涤，干燥后，悬于无水甲醇，在冰浴冷却下通入HCL气

15、体，使之饱和。室温下过夜，并重复此过程(甲酯化)。然后用甲醇、乙醚充分洗涤，并空气干燥。将产物悬于甲醇中，加入80水合肼，回流1h。放置过夜，过滤，再用甲醇洗涤，干燥。其次为偶联：1g CMC酰肼和150m1 2HCL在冰浴中混合，搅拌下滴加9ml %3 NaNO2，冰水浴中搅拌20min。离心弃去上清液。沉淀用150m1二氧氯环洗涤再用150m1冷的蒸馏水洗涤二次，并且悬于预冷的10ml 0.05mol/L pH87磷酸缓冲液的胰蛋白酶溶液中，5搅拌反应23h，用HCL凋PH4，冷0.001mol/L HCL洗三次，冷水洗一次，冻干，即为固定化酶。溴化氰法：溴化氰法：w 含有羟基的载体，如纤

16、维素、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶等，可用溴化氰活化生成活泼的亚氨基碳酸衍生物,在弱碱条件弱碱条件下，可与酶分子的氨基偶联，产生固定化酶。w 此法能在非常温和的条件下与酶蛋白的氨基发生反此法能在非常温和的条件下与酶蛋白的氨基发生反应应,已成为近年来普遍使用的固定化方法已成为近年来普遍使用的固定化方法,尤其是溴尤其是溴化氰活化的化氰活化的琼脂糖琼脂糖已广泛用于制备固定化酶以及亲已广泛用于制备固定化酶以及亲和层析的固定化吸附剂。和层析的固定化吸附剂。 例如：用例如：用CNBr活化的琼脂糖固定化胰蛋白酶。将活化的琼脂糖固定化胰蛋白酶。将Sepharose 4B用蒸馏水洗净，含用蒸馏水洗净，含0.1g干物质

17、的湿胶加干物质的湿胶加5ml水和水和4ml现配溴化氰水溶液现配溴化氰水溶液(25mg/m1)，搅拌下用，搅拌下用2mol/LNaOH调调pH ll.0，2325反应反应6min，抽干立即用，抽干立即用300ml 0.1mol/L NaHCO3洗净洗净, (58min内完成内完成)。活化的。活化的载体用载体用0.025mol/L pH10.2（含（含0.02mol/L CaCl2）硼酸缓）硼酸缓冲液液快速淋洗后，用冲液液快速淋洗后，用5m1缓冲液转入烧杯内加缓冲液转入烧杯内加16mg结晶结晶胰蛋白酶，搅拌胰蛋白酶，搅拌4h，用，用0.1mol/L pH8.5硼酸缓冲液硼酸缓冲液(内含内含1mol

18、/L NaCl)洗涤后，复用洗涤后，复用pH4.1的醋酸缓冲液洗涤，便制的醋酸缓冲液洗涤，便制成了固定化胰蛋白酶。成了固定化胰蛋白酶。烷基化法： 含羟基的载体可用三氯-均三嗪等多卤代物进行活化，形成含有卤素基团的活化载体。活化载体上的卤素基团可与酶分子上的氨基、巯基、羟基等发生烷基化反应，制备成固定化酶。 用共价键结合法制备的固定化酶，结合很牢固，酶不会用共价键结合法制备的固定化酶，结合很牢固，酶不会脱落，可以连续使用较长时间。但载体活化的操作复杂，比脱落，可以连续使用较长时间。但载体活化的操作复杂，比较麻烦，同时由于共价结合时可能影响酶的空间构象而影响较麻烦，同时由于共价结合时可能影响酶的空

19、间构象而影响酶的催化活性。酶的催化活性。 现在已有活化载体的商品出售，商品名为偶联凝胶现在已有活化载体的商品出售，商品名为偶联凝胶（coupling gel）。偶联凝胶有多种型号，在实际应用时，选）。偶联凝胶有多种型号，在实际应用时，选择适宜的偶联凝胶，可免去载体活化的步骤而很简单地制备择适宜的偶联凝胶，可免去载体活化的步骤而很简单地制备固定化酶。固定化酶。 在选择偶联凝胶时，一方面要注意偶联凝胶的特性和使在选择偶联凝胶时，一方面要注意偶联凝胶的特性和使用条件，另一方面要了解酶的结构特点，避免酶活性中心的用条件，另一方面要了解酶的结构特点，避免酶活性中心的构象变化而影响酶的催化能力。构象变化而

20、影响酶的催化能力。交联法交联法w 借助双功能试剂使酶分子之间发士交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法称为交联法。交联法也可用于含酶菌体或菌体碎片的固定化。w 常用的双功能试剂有戊二醛、己二胺、顺丁烯二酸酐双偶氮苯等。其中应用最广泛的是戊二醛。w 交联法制备的固定化酶或固定化菌体结合牢固，可以长时间使用。但由于交联反应条件较激烈，酶分子的多个基团被交联，致使酶活力损失较大，而且制备成的固定化酶或固定化菌体的颗粒较小，给使用带来不便。w 为此，可将交联法与吸附法或包埋法联台使用，以取长补短。w 例如，将酶先用凝胶包埋后再用戊二醛交联，或先将酶用硅胶等吸附后再进行交联等。这种固定化方法称为双重固定

21、化法。双重固定化法已在酶和菌体固定化方面广泛采用，可制备出酶活性高、机械强度又好的固定化酶或固定化菌体。 交联法有下列方法：交联法有下列方法： (1) 交联酶法交联酶法 在一定条件下，加入一定量的戊二醛溶液于酶溶液中，在一定条件下，加入一定量的戊二醛溶液于酶溶液中，生成不溶性固定化酶。这种反应与酶和试剂浓度、溶液生成不溶性固定化酶。这种反应与酶和试剂浓度、溶液PH和离子强度、温度、反应时间均有一定的关系。和离子强度、温度、反应时间均有一定的关系。 如木瓜蛋白酶在如木瓜蛋白酶在0.2酶蛋白浓度、酶蛋白浓度、2.3戊二醛、戊二醛、pH 5.27.2、0下交联下交联24h，可形成固定化酶。其中，可形

22、成固定化酶。其中，PH的影响十分明显，随的影响十分明显，随pH升高，固定化速度增加，升高，固定化速度增加，pH低于低于4不能形成固定化酶。有人认为不能形成固定化酶。有人认为pH应控制在酶的等电点附近应控制在酶的等电点附近有利于固定化。有利于固定化。 w 在交联时，加入一定量中性盐如在交联时，加入一定量中性盐如Na2SO4、（NH4)2SO4等等和丙酮等有机溶剂有助于形成和丙酮等有机溶剂有助于形成固定化酶。温度也有一定影响。固定化酶。温度也有一定影响。w 如木瓜蛋白酶和戊二醛在如木瓜蛋白酶和戊二醛在pH6.0、0长时间长时间反应，只得可溶性固定化酶，若在室温下反应，只得可溶性固定化酶，若在室温下

23、0一一5h，即可形成不溶性固定化酶。这种情况对，即可形成不溶性固定化酶。这种情况对不同酶可能有不同结果。不同酶可能有不同结果。 这种方法也用于制备交联的结晶酶。交这种方法也用于制备交联的结晶酶。交联结晶酶仍具有一定酶活力。联结晶酶仍具有一定酶活力。 例如：将例如：将500mg酶溶于酶溶于5m1 0.2mol/L pH6醋酸缓醋酸缓冲液中，在搅拌下滴加冲液中，在搅拌下滴加2m1 2.5戊二醛，在室温下放置戊二醛，在室温下放置1030min，会有沉淀析出，会有沉淀析出，13h内反应结束。形成的内反应结束。形成的凝胶切碎后水洗，除去多余戊二醛，即为固定化酶。凝胶切碎后水洗，除去多余戊二醛，即为固定化

24、酶。(2)酶与辅助蛋白交联法酶与辅助蛋白交联法 用双功能或多功能试剂使惰性蛋白与酶用双功能或多功能试剂使惰性蛋白与酶共交联，从而制备固定化酶。由于酶在交联共交联，从而制备固定化酶。由于酶在交联反应过程中因化学修饰而引起失活，可得到反应过程中因化学修饰而引起失活，可得到的酶量有限，因此，通常以一些辅助蛋白，的酶量有限，因此，通常以一些辅助蛋白，如牛血清白蛋白、明胶、胶原、抗体等，与如牛血清白蛋白、明胶、胶原、抗体等，与酶一起进行交联。酶一起进行交联。 w 例如：例如：10mg脲酶与脲酶与2.5ml含含6白蛋白、白蛋白、0.2戊二醛的戊二醛的0.02mol/L pH7.8磷酸缓冲液混合，磷酸缓冲液

25、混合，冷到冷到30后，再升温至后，再升温至4 下下,放置放置4h将形将形成的泡沫聚合物彻底洗除后，冻干，即为固成的泡沫聚合物彻底洗除后，冻干，即为固定化脲酶。定化脲酶。(3)载体交联法载体交联法 是用多或双功能试剂的一部分功能基团与载体交联，另是用多或双功能试剂的一部分功能基团与载体交联，另一部分功能基团与酶蛋白交联而制备固定化酶的方法。一部分功能基团与酶蛋白交联而制备固定化酶的方法。 例如：尼龙固定化木瓜蛋白酶的制备：尼龙布用含例如：尼龙固定化木瓜蛋白酶的制备：尼龙布用含18.6CaCL2和和18.6水的甲醇溶液处理水的甲醇溶液处理10min，洗净吸干，于，洗净吸干，于3.65mol/LHC

26、L中中45水浴中水解水浴中水解45min，水洗至中性，吸，水洗至中性，吸干，用干，用5戊二醛溶液戊二醛溶液(0.2mol/L pH8.5硼酸缓冲液配制硼酸缓冲液配制)，于于20搅拌交联搅拌交联20min，用，用PH7.8 0.1mol/L磷酸缓冲液洗磷酸缓冲液洗去多余戊二醛。去多余戊二醛。2g处理载体处理载体(尼龙尼龙)加入加入4ml酶溶液酶溶液(1mg/ml）于于45下固定下固定3h后，用后，用0.1mol/L pH7.5磷酸缓冲液磷酸缓冲液(内内含含0.5mol/LNaCl)洗涤，除去多余酶液，抽干，即为固定化洗涤，除去多余酶液，抽干，即为固定化木瓜蛋白酶。木瓜蛋白酶。 w 单用戊二醛等试

27、剂文联制备的固定化酶活单用戊二醛等试剂文联制备的固定化酶活力较低，常将此法与吸附法、包埋法结合力较低，常将此法与吸附法、包埋法结合使用，可以达到既提高固定化酶的活力，使用，可以达到既提高固定化酶的活力，又起到加固的效果。又起到加固的效果。 壳聚糖微球固定化木瓜蛋白酶制备。壳聚糖微球制备：壳聚糖微球固定化木瓜蛋白酶制备。壳聚糖微球制备：4g壳聚糖溶于壳聚糖溶于100mL2醋酸溶液，在搅拌下缓慢滴入烧杯醋酸溶液，在搅拌下缓慢滴入烧杯中的透平油中的透平油(酸性胶与透平油的比例为酸性胶与透平油的比例为1：3)中，按中，按4：35：1比例加入比例加入25戊二醛溶液，再用戊二醛溶液，再用1mol/L Na

28、OH溶液调溶液调pH910，置水浴，置水浴(60一一70)中中3h，冷却后，弃去上层油液，冷却后，弃去上层油液，依次用石油醚、丙酮、无水乙醇、水洗涤真空干燥备用。依次用石油醚、丙酮、无水乙醇、水洗涤真空干燥备用。 酶的固定化：酶的固定化：0.5g载体于载体于0.1mol/L pH7.2磷酸缓冲液磷酸缓冲液浸泡浸泡24h，抽干，加入，抽干，加入1.6mg/ml的木瓜蛋白酶溶液的木瓜蛋白酶溶液0.6mL，48下吸附下吸附12h，滴入，滴入0.6戊二醛溶液戊二醛溶液3m1于于48交联交联3h后弃去上层溶液，用后弃去上层溶液，用0.1mol/L pH72磷酸缓冲液磷酸缓冲液(含含NaCl 0.5mol

29、/L)洗多次，吸干水分，即得固定化酶。活洗多次，吸干水分，即得固定化酶。活力回收约力回收约60，在填充反应器内连续水解酪蛋白，在填充反应器内连续水解酪蛋白(05)时时半衰期为半衰期为16d.另一种方法是酶交联后再用凝胶包埋。另一种方法是酶交联后再用凝胶包埋。 1mg/m1(601U/m1)脲酶的脲酶的0.02mol/LpH68磷酸磷酸缓冲液与等体积缓冲液与等体积2.5戊二醛的上述缓冲液混合，戊二醛的上述缓冲液混合，4反应反应10h加加G1y至至0.1mol/L，终止交联，得交联酶。，终止交联，得交联酶。 lml60丙烯酰胺和丙烯酰胺和16N，N甲叉双丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺与5mL上述交联上述

30、交联酶液混合，酶液混合，37保温保温(为溶液为溶液A)。另取。另取96mg琼脂糖在琼脂糖在6mL水中煮沸水中煮沸5min，在搅拌下冷却至，在搅拌下冷却至40(溶液溶液B)。在溶液。在溶液B中中加入加入0.5mlN，N，N，N四甲基乙二胺四甲基乙二胺36mg过硫酸过硫酸铵，立即加入溶液铵，立即加入溶液A，4聚合聚合30min，凝胶水洗，干燥，即，凝胶水洗，干燥，即为固定化酶。为固定化酶。w 包埋法w 包埋法是将聚合物的单体与酶溶液混合，再借助于包埋法是将聚合物的单体与酶溶液混合，再借助于聚合助进剂聚合助进剂(包括交联剂包括交联剂)的作用进行聚合，酶被包的作用进行聚合，酶被包埋在聚合物中以达到固定

31、化埋在聚合物中以达到固定化。w 包埋法操作简单，由于酶分子只被包埋，未受到化学反应，可以制得较高活力的固定化酶对大多数酶、粗酶制剂甚至完整的微生物细胞都是适用的。但是，只有小分子底物和产物可以通过凝胶网络，而对大分子底物不适宜。同时，凝胶网络对物质扩散的阻力导致固定化酶动力学行为的变化、活力降低。包埋法常用凝胶包埋法和微囊化法。吸附法吸附法分为物理吸附法和离子交换吸附法。(1) 物理吸附法: 通过氢键、疏水作用和通过氢键、疏水作用和电子亲和力等物理电子亲和力等物理作用，将酶固定于水不溶载体上作用，将酶固定于水不溶载体上,从而制成固定化酶从而制成固定化酶。常用的载体有： 有机载体。纤维素、骨胶原

32、、火棉胶及面筋、淀粉等。比如用纤维素作为吸附剂，用膨润的玻璃纸或胶棉膜吸附木瓜蛋白酶、碱性磷酸脂酶、6磷酸葡萄糖脱氢酶。吸附后在载体表面形成单分子层，吸附蛋白能力约70mg/cm2。 无机载休。氧化铅、皂土、白土、高岭土、多孔玻璃、二氧化钛等。比如用多孔硅为载体吸附米曲酶和枯草杆菌的r淀粉酶以及黑曲霉的糖化酶，在45进行固定化，用高浓度的底物进行连续反应半衰期分别为14、35、60d。无机载体的吸附容量较低、而且酶容易脱落。(2)离子交换吸附法: 这是将酶与含有离予交换基的水不溶载将酶与含有离予交换基的水不溶载体相结合而达到固定化的一种方法。体相结合而达到固定化的一种方法。酶吸附较牢，在工业上

33、颇具广泛的用途。常用的载体有阴离子交换剂，如二乙基氨基乙基(DEAE)-纤维素、混合胺类（ECTEDLA）纤维素、四乙氨基乙基(TEAE)纤维素、DEAE葡聚糖凝胶、Amberlite IRA93、410、900等。阳离子交换剂，如羧甲基(CM)纤维素、纤维素柠檬酸盐、Amberlite CG50、IRC50、IR200、Dowex50等。DEAE-Sephadex固定化氨基酰化酶：将DEAE-SephadexA25充分溶胀，用05mol/LNa0H和水洗涤后，加入pH7.07.5的米曲霉3042粗酶液(水解乙酰DL-Ala活力为25umol/m1h)充分混合(1g湿重载体加60ml酶液)后，

34、于低温下搅拌过夜后，吸去上清液，再用蒸馏水和0.15mol/L醋酸钠水溶液洗涤固定化酶，置4备用。固定化酶活力回收50-60，水解乙酰DLA1a活力为600-800umol/gh湿固定化酶。氨基酰化酶也可固定于DEAE纤维素。 此外，DEAE纤维素吸附的淀粉酶、蔗糖酶已作为商品固定化酶。 通过酶蛋白化学修饰来增加蛋白质分子上电荷，能有效通过酶蛋白化学修饰来增加蛋白质分子上电荷，能有效的克服吸附法制备的固定化酶在使用过程的解吸的克服吸附法制备的固定化酶在使用过程的解吸。用水溶性乙烯顺丁烯二酸酐共聚物共价修饰的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶、可以用DEAE纤维素和DEAESephadex载体有效的固定。这

35、种固定几乎是不可逆的吸附。此外，酶的吸附与解吸还与介质中离子强度、pH、温度、蛋白质浓度及酶和载体的特性相关。pH的变化影响到载体和酶的电荷，从而影响载体对酶的吸附。在等电点两侧(1-2pH单位)吸附将明显减少，但也有个别例外。盐对吸附的影响较为复杂在一些特殊事例中、盐可以促进蛋白质的吸附。这就是所谓的盐析吸附。对蛋白质吸附来说，随温度的升高对蛋白质吸附来说，随温度的升高吸附下降。吸附下降。载体的表面积、多孔性及其顶处理都影响对酶的吸附。热处理法w 将含酶细胞在一定温度下加热处理一段时间，使酶将含酶细胞在一定温度下加热处理一段时间，使酶固定在菌体内，而制备得到固定化菌体。热处理法只适固定在菌体

36、内，而制备得到固定化菌体。热处理法只适用于那些热稳定性较好的酶的固定化，在加热处理时，用于那些热稳定性较好的酶的固定化，在加热处理时，要严格控制好加热温度和时问，以免引起酶的变性失活。要严格控制好加热温度和时问，以免引起酶的变性失活。 例如，将培养好的含葡萄糖异构酶的链霉菌细胞在例如，将培养好的含葡萄糖异构酶的链霉菌细胞在60-6560-65的温度下处理的温度下处理l5minl5min，葡萄糖异构酶全部固定在，葡萄糖异构酶全部固定在菌体内。热处理法也可与文联法或其他固定化法联合使菌体内。热处理法也可与文联法或其他固定化法联合使用，进行双重固定化。用，进行双重固定化。酶和细胞固定化方法酶和细胞固

37、定化方法 酶和细胞固定化方法酶和细胞固定化方法 载体结合法载体结合法 交联法交联法 包埋法包埋法 网格型网格型 微囊型微囊型物理吸附法物理吸附法 离子结合法离子结合法 共价结合法共价结合法 热处理（细胞）热处理（细胞）三、酶的定向固定化三、酶的定向固定化w 酶固定化的一个主要缺点是固定化酶的活性通常会大幅度下降，其原因是它的活性位点可能会因为固定化酶的位阻障碍而妨碍底物进入到酶的活性位点；w 另外还会发生酶和载体产生多点的结合从而使酶失活。目前已经发展了一些不同的定向固定化酶的方法： 利用酶和它的抗体之间的亲和性; 通过酶分子上的糖基部分固定化; 酶和金属离子形成复合物; 用分子生物学方法使酶

38、定向固定化酶和抗体的亲和连接酶通过糖基部分固定化酶通过糖基部分固定化酶和金属离子连接酶和金属离子连接分子生物学方法分子生物学方法w 如果酶中没有半胱氨酸或酶的活性位点中没有半胱氨酸,可以采用特定位点基因突变法;w 当酶的N-末端和C末端远离酶的活性位点时,可以用基因融合法;w 如果酶和载体之间允许有一个亲和素臂存在时,就可以使用翻译后修饰法在酶上面连接上一个生物素。基因融合法翻译后修饰法特定位点基因突变法四、固定化酶的特性四、固定化酶的特性w 稳定性w 最适温度w 最适pHw 底物特异性 固定化酶的稳定性一般比游离酶的稳定性好。主要表现固定化酶的稳定性一般比游离酶的稳定性好。主要表现在：在：

39、（1)对热的稳定性很高，可以耐受较高的温度。对热的稳定性很高，可以耐受较高的温度。 (2)保存稳定性好，可以在一定条件下保存校长的时间。保存稳定性好，可以在一定条件下保存校长的时间。 (3)对蛋白酶的抵抗性增强，不易被蛋白酶水解。对蛋白酶的抵抗性增强，不易被蛋白酶水解。 (4)对变性剂的耐受性提高，在尿素、有机溶剂和盐酸胍对变性剂的耐受性提高，在尿素、有机溶剂和盐酸胍 等蛋白质变性剂的作用下，仍可保留较高的酶活力等。等蛋白质变性剂的作用下，仍可保留较高的酶活力等。对蛋白酶的抵抗力提高 溶液酶经固定化后提高了对蛋白酶的抵抗能力。比如：氨基酰化酶在胰蛋白酶作用下活力仅存20，而将其固定于DEAE纤

40、维素上在同样条件下仍有80的活力。 这可能是因为蛋白酶分子量大，受到空间位阻，不能进入固定化酶中。对变性剂、抑制剂的抵抗能力提高对变性剂、抑制剂的抵抗能力提高 酶经固定化后，提高了对蛋白质变性剂和抑制剂的抵抗能力。例如：氨基酰化酶与固定于DEAESephadex的氨基酰化酶比较，前者在6mol、2mol胍、1SDS和4mmol丙酮溶液中活力分别为9、49、1和55，而后者在相应溶液中活力则分别为146、117、35和138。操作稳定性操作稳定性 固定化酶在操作中可以长期使用，半衰期(t1/2)，即酶活性达到原有酶活性一半时所需的时间)较长。固定化酶与固定化细胞的应用固定化酶与固定化细胞的应用(

41、1)生物化学及分子生物学基础研究(2)药物控释载体(3)生物传感器w 固定化酶作用的最适温度可能会受到固定化方法和固固定化酶作用的最适温度可能会受到固定化方法和固定化载体的影响，在使用时要加以注意。定化载体的影响，在使用时要加以注意。w 影响固定化酶最适影响固定化酶最适pHpH值的因素主要有两个，一个是值的因素主要有两个，一个是载体的带电性质，另一个足酶催化反应产物的性质。载体的带电性质，另一个足酶催化反应产物的性质。w 固定化酶底物特异性的改变，是由于载体的空间位阻固定化酶底物特异性的改变，是由于载体的空间位阻作用引起的。酶固定在载体上以后，使大分子底物难作用引起的。酶固定在载体上以后，使大

42、分子底物难于接近酶分子而使催化速度大大降低，而分子量较小于接近酶分子而使催化速度大大降低，而分子量较小的底物受空间位阻作用的影响较小或不受影响，故与的底物受空间位阻作用的影响较小或不受影响，故与游离酶的作用没有显著不同。游离酶的作用没有显著不同。固定化酶活力固定化酶活力 与其溶液酶相比，大多数固定化酶活性下降。与其溶液酶相比，大多数固定化酶活性下降。固定固定化酶活力下降的原因主要有：化酶活力下降的原因主要有：酶与不溶性载体相结合引酶与不溶性载体相结合引起结构发生了变化；酶活性中心的重要氨基酸残基与裁起结构发生了变化；酶活性中心的重要氨基酸残基与裁体相结合。这两者造成的酶活力下降可以适当条件加以

43、体相结合。这两者造成的酶活力下降可以适当条件加以克服。克服。 载体与酶结合后，酶虽不失活，但酶与底物间的相互作用受到空间位阻，从而使活力下降。这个影响难以克服。另外，在包埋法中，酶活性的下降可能是在酶的固定过程中有变性所致。 固定化酶活力测定基本上与溶液酶相似，也以反应初速度表示。 即每毫克干重固定化酶每分钟转化1umol底物量或形成1umol产物的酶量为一个单位(umol/mgmin)。 对于酶管、酶膜、酶板等，则以单位面积（cm2）的初速度来表示。 由于在偶联反应中酶往往会有些失活，因此，测定残留活力还不能正确反映与载体结合的酶活力，所以，仍以测定蛋白量较为难确。 在酶固定化操作中，当酶与载体结合后，用适量适当的缓冲液淋洗固定化酶，以洗除未固定的酶，收集洗脱液，并测定其中蛋白量(或酶活力)，即为残留的蛋白量(或酶活力)。偶联效率以载体结合酶量偶联效率以载体结合酶量(或酶活力或酶活力)的百分数表示的百分数表示活力回