第八章免疫学技术在食品科学中的应用

1、 第八章第八章 免疫学检测技术免疫学检测技术 讨讨 论论 课课 免疫学理论（或免疫学技术）在免疫学理论（或免疫学技术）在食品科学中的应用食品科学中的应用1、研究背景、研究背景2、研究目的、研究目的3、实验方法、实验方法4、结果与分析、结果与分析5、结论、结论 PPT内容内容 第八章第八章 免疫学检测技术免疫学检测技术 免疫学检测技术以其灵敏度高、专一性免疫学检测技术以其灵敏度高、专一性强和速度快等显著特点广泛用于食品的品强和速度快等显著特点广泛用于食品的品质、质量、安全以及食品中生物活性成分的质、质量、安全以及食品中生物活性成分的检测与分析。检测与分析。 第一节第一节 抗原抗体的检测抗原抗体的

2、检测一一.抗原抗体反应抗原抗体反应 指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应，是免疫球蛋白分子上的抗原结合位和抗反应，是免疫球蛋白分子上的抗原结合位和抗原分子上的抗原决定簇相互吸引以及多种分子原分子上的抗原决定簇相互吸引以及多种分子间的引力参与下发生的反应。抗原抗体反应可间的引力参与下发生的反应。抗原抗体反应可发生于体内，也可发生于体外。发生于体内，也可发生于体外。抗原抗原抗体抗体 抗原与抗体之间通过非抗原与抗体之间通过非共价键结合，它们之间的共价键结合，它们之间的结合力包括结合力包括电荷引力电荷引力、范范德华力德华力、氢键结合力氢键结合力和和疏疏水作用

3、力水作用力。多种非共价结。多种非共价结合力使抗原抗体紧密结合合力使抗原抗体紧密结合在一起。在一起。抗原与抗体结合力抗原与抗体结合力抗原与抗体反应特点抗原与抗体反应特点抗原抗原抗体抗体1、特异性：抗原抗体在化学结、特异性：抗原抗体在化学结构和空间构型上呈互补关系，构和空间构型上呈互补关系，两者结合具有高度特异性。两者结合具有高度特异性。2、按比性：两者分子比例合适、按比性：两者分子比例合适时才出现最强的反应。时才出现最强的反应。3、可逆性：改变、可逆性：改变pH和离子强度和离子强度是最常用的促解离方法。是最常用的促解离方法。抗原与抗体反应的影响因素抗原与抗体反应的影响因素1）抗原抗体性质）抗原抗

4、体性质：互补程度：互补程度2）酸碱度）酸碱度：pH 6-83) 温度温度：37 度度4) 电解质电解质：0.85%氯化钠或各种缓冲液氯化钠或各种缓冲液二二.利用抗原抗体反应的实验利用抗原抗体反应的实验主要用途：主要用途：1. 用已知的抗原检测未知的抗体。用已知的抗原检测未知的抗体。 2. 用已知的抗体检测未知的抗原。用已知的抗体检测未知的抗原。 3. 定性或定量检测体内各种大分子，如：细胞因子，定性或定量检测体内各种大分子，如：细胞因子，免疫球蛋白。免疫球蛋白。 二二.利用抗原抗体反应的实验利用抗原抗体反应的实验免疫凝集试验免疫凝集试验 免疫沉淀反应免疫沉淀反应 免疫标记技术免疫标记技术其他其

5、他 1.1.免疫凝集试验免疫凝集试验 颗粒抗原颗粒抗原(例；细菌、红细胞）或可溶性抗原结例；细菌、红细胞）或可溶性抗原结合于不容性载体微粒上后与相应的抗体在适当的合于不容性载体微粒上后与相应的抗体在适当的条件下，经一定时间后凝集成肉眼可见的凝集物。条件下，经一定时间后凝集成肉眼可见的凝集物。直接凝集反应直接凝集反应间接凝集反应间接凝集反应免疫凝集反应免疫凝集反应颗粒抗原颗粒抗原相应抗体相应抗体直接凝集直接凝集反应反应 颗粒抗原颗粒抗原(例；细菌、红细胞）与相应的抗体直接结例；细菌、红细胞）与相应的抗体直接结合所出现的凝集现象称为直接凝集反应。合所出现的凝集现象称为直接凝集反应。直接凝集反应直接

6、凝集反应肉眼可见的凝集物肉眼可见的凝集物直接凝集试验直接凝集试验试管法试管法玻片法玻片法 将可溶性抗原（或抗体）先吸附于一种与免疫无关将可溶性抗原（或抗体）先吸附于一种与免疫无关的、一定大小的颗粒状载体的表面，然后与相应的抗的、一定大小的颗粒状载体的表面，然后与相应的抗体体(或抗原或抗原)作用，在有电解质存在的适宜条件下，即作用，在有电解质存在的适宜条件下，即可发生凝集，称为间接凝集反应。可发生凝集，称为间接凝集反应。载体：人或动物的红细胞、活性碳颗粒、聚苯乙烯胶载体：人或动物的红细胞、活性碳颗粒、聚苯乙烯胶乳等。乳等。载体增大抗原（或抗体）反应面积。载体增大抗原（或抗体）反应面积。间接凝集反

7、应间接凝集反应可溶性抗原可溶性抗原不容性载体不容性载体相应抗体相应抗体正向间接正向间接凝集反应凝集反应可溶性抗体可溶性抗体不容性载体不容性载体可溶性相可溶性相应抗原应抗原反向间反向间接凝集接凝集反应反应待测标本待测标本相应抗体相应抗体致敏抗原致敏抗原凝集凝集不凝集不凝集间接凝集间接凝集抑制反应抑制反应可溶性抗体可溶性抗体 SPA相应抗原相应抗原协同凝协同凝集反应集反应 常用于食品安全检测，如：食物中微生物志贺氏常用于食品安全检测，如：食物中微生物志贺氏菌污染检测。菌污染检测。具体方法：具体方法：SPA（Staphylococcal Protein A, 金黄色葡金黄色葡萄球菌细胞壁的一种蛋白质

8、成分）具有同人和多种哺萄球菌细胞壁的一种蛋白质成分）具有同人和多种哺乳动物乳动物IgG分子分子Fc段结合的能力。结合到段结合的能力。结合到SPA上的志贺上的志贺氏菌抗体与志贺氏菌产生特异性的凝集反应，产生可氏菌抗体与志贺氏菌产生特异性的凝集反应，产生可见的凝集反应，从而用于快速检测。见的凝集反应，从而用于快速检测。免疫凝集试验应用免疫凝集试验应用2.2.免疫沉淀反应免疫沉淀反应 免疫沉淀反应（免疫沉淀反应（precipitation）是指可溶性抗原）是指可溶性抗原（细菌培养液、细胞或组织浸出液、血清蛋白等）（细菌培养液、细胞或组织浸出液、血清蛋白等）与相应抗体特异结合后，在电解质参与下出现的沉

9、与相应抗体特异结合后，在电解质参与下出现的沉淀现象。该反应多用于半固体琼脂作为介质，抗原淀现象。该反应多用于半固体琼脂作为介质，抗原抗体在凝胶中扩散，在比例合适处形成白色沉淀。抗体在凝胶中扩散，在比例合适处形成白色沉淀。单向免疫扩散单向免疫扩散 单向免疫扩散（单向免疫扩散（single immunodiffusion)将一定量的已知抗体均匀混于琼脂凝胶中将一定量的已知抗体均匀混于琼脂凝胶中制成琼脂板，在适当位置打孔后加入抗制成琼脂板，在适当位置打孔后加入抗原。孔内抗原向四周呈环状形成浓度梯原。孔内抗原向四周呈环状形成浓度梯度，在抗原与抗体的量达到一定比例时即度，在抗原与抗体的量达到一定比例时即

10、可形成肉眼可见的沉淀环。可形成肉眼可见的沉淀环。抗原抗体双向免疫扩散双向免疫扩散 双向琼脂扩散（双向琼脂扩散（double immunodiffuse test)可溶性可溶性抗原和抗体在含有电解质的同一个琼脂凝胶板的对应抗原和抗体在含有电解质的同一个琼脂凝胶板的对应孔中，各自向四周凝胶中扩散，如果两者相对应，则孔中，各自向四周凝胶中扩散，如果两者相对应，则发生特异性反应，在浓度比例合适处形成肉眼可见的发生特异性反应，在浓度比例合适处形成肉眼可见的白色沉淀线。本法常用于抗原或抗体的定性检测、组白色沉淀线。本法常用于抗原或抗体的定性检测、组成和两种抗原的相关性分析。成和两种抗原的相关性分析。 将抗

11、原样品先进行电泳，使其中的各种成分彼此将抗原样品先进行电泳，使其中的各种成分彼此分开，然后加入抗体做双向免疫扩散，以分离的各分开，然后加入抗体做双向免疫扩散，以分离的各抗原成分与抗体在琼脂中扩散而相遇，在二者比例抗原成分与抗体在琼脂中扩散而相遇，在二者比例适当的地方，形成肉眼可见的沉淀弧。适当的地方，形成肉眼可见的沉淀弧。免疫电泳免疫电泳 常用于食品安全检测，对食品中污染常用于食品安全检测，对食品中污染病源菌的定性和监别，以及食品中的病源菌的定性和监别，以及食品中的某些成分。某些成分。如：如：单向免疫扩散法检测牛乳中免疫单向免疫扩散法检测牛乳中免疫球蛋白含量。球蛋白含量。免疫沉淀试验应用免疫沉

12、淀试验应用3.3.免疫标记技术免疫标记技术 免疫标记技术免疫标记技术immunolabelling technique 指用荧光素，放射性核素，酶、化学发光剂指用荧光素，放射性核素，酶、化学发光剂等作为追踪物，标记抗体或抗原进行的抗原等作为追踪物，标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应。具有灵敏度和特异性高，快速，抗体反应。具有灵敏度和特异性高，快速，可定性、定量等检测。可定性、定量等检测。免疫标记技术分类免疫标记技术分类v酶标记免疫学分析酶标记免疫学分析EIAv放射线标记免疫学分析放射线标记免疫学分析RIAv免疫荧光法免疫荧光法IF酶标记免疫学技术酶标记免疫学技术 将酶催化作用的高效性与抗原抗体的

13、特异性相结将酶催化作用的高效性与抗原抗体的特异性相结合的一种微量分析技术。酶标记抗原或抗体后形成的合的一种微量分析技术。酶标记抗原或抗体后形成的酶标记物，既保留抗原或抗体的免疫活性，又保留了酶标记物，既保留抗原或抗体的免疫活性，又保留了酶的催化活性。当酶标记物与待测标本中相应的抗原酶的催化活性。当酶标记物与待测标本中相应的抗原或抗体相互作用时，可形成酶标记抗原抗体复合物。或抗体相互作用时，可形成酶标记抗原抗体复合物。利用复合物上标记的酶催化底物显色，其颜色的深浅利用复合物上标记的酶催化底物显色，其颜色的深浅与待测标本中抗原或抗体的量相关。与待测标本中抗原或抗体的量相关。 灵敏度：灵敏度：ng-

14、pg, 常用酶常用酶:辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶酶标记免疫学技术酶标记免疫学技术o酶联免疫吸附试验（酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)o免疫印迹技术免疫印迹技术(Immuno-blotting)o酶免疫组化技术酶免疫组化技术（ （enzyme immunohistochemistry technique)o其它其它ELISA :enzyme linked immunosorbent assay 将已知抗体将已知抗体（ （抗原抗原） ）包被于载体上，再加上抗包被于载体上，再加上抗原原-抗体反应使酶标记抗体

15、抗体反应使酶标记抗体（ （抗原抗原） ）结合在载体上，结合在载体上，经洗涤去除游离的酶标记抗体经洗涤去除游离的酶标记抗体（ （抗原抗原） ）后加入底后加入底物显色，定性或定量分析有色产物确定待测物物显色，定性或定量分析有色产物确定待测物的存在与含量的检测技术。的存在与含量的检测技术。酶联免疫吸附试验（酶联免疫吸附试验（ELISA)酶联免疫吸附试验（酶联免疫吸附试验（ELISA)间接法间接法双抗体夹心法双抗体夹心法竞争法竞争法酶联免疫吸附试验（酶联免疫吸附试验（ELISA)间接法间接法抗原抗原抗体一抗抗体一抗二抗二抗底物底物产物产物酶联免疫吸附试验（酶联免疫吸附试验（ELISA)双抗体夹心法双抗

16、体夹心法（三明治（三明治)抗原抗原抗体抗体酶标抗体酶标抗体底物底物产物产物酶联免疫吸附试验（酶联免疫吸附试验（ELISA)竞争法竞争法EEEEEEEEEEEE测定测定对照对照抗原抗原底物底物产物产物抗体抗体E酶标酶标抗原抗原ELISA广泛应用于食品科学领域。广泛应用于食品科学领域。食品中农药残留检测食品中农药残留检测食品中抗生素残留检测食品中抗生素残留检测食源性病原菌检测食源性病原菌检测食品安全检测食品安全检测食品成分提取食品成分提取功能性食品研究功能性食品研究免疫印迹技术免疫印迹技术(Immuno-blotting) 将凝胶电泳的高分辨力同固相免疫测定结将凝胶电泳的高分辨力同固相免疫测定结合

17、起来的一种方法。先将复合物在分离胶中分合起来的一种方法。先将复合物在分离胶中分离，然后将这些分子转移至膜上，再用特异性离，然后将这些分子转移至膜上，再用特异性的抗体来鉴定这些单个的抗原成分。的抗体来鉴定这些单个的抗原成分。免疫印迹技术免疫印迹技术(Immuno-blotting) SDS-PAGE 蛋白质转印蛋白质转印 酶免疫测定酶免疫测定可应用于蛋白质提取及分析等许多方面。可应用于蛋白质提取及分析等许多方面。三项技术结合而成。三项技术结合而成。免疫印迹技术免疫印迹技术(Immuno-blotting)CBBImmunoblotting LWPCLWPC酶免疫组化技术酶免疫组化技术 以酶标抗体

18、与组织或细胞的抗原进行反以酶标抗体与组织或细胞的抗原进行反应，结合形态学检查，对抗原进行定性、应，结合形态学检查，对抗原进行定性、定量或定位检测的技术。定量或定位检测的技术。用于测定组织或细胞表面的抗原。用于测定组织或细胞表面的抗原。3.3.免疫标记技术免疫标记技术v酶标记免疫学分析酶标记免疫学分析EIAv放射线标记免疫学分析放射线标记免疫学分析RIAv免疫荧光法免疫荧光法IF放射线标记免疫学分析放射线标记免疫学分析RIA 用放射性同位素标记抗原或抗体进行免疫用放射性同位素标记抗原或抗体进行免疫学检测的免疫标记技术。该法灵敏度高达学检测的免疫标记技术。该法灵敏度高达pg。常用的放射性同位素有常

19、用的放射性同位素有125I 和和 131I。 应用于食品安全检测，食品中农药残留、应用于食品安全检测，食品中农药残留、激素等检测。激素等检测。免疫荧光法免疫荧光法IF直接法直接法荧光素直接标记抗体，对标本进行检测。荧光素直接标记抗体，对标本进行检测。特异性强，但任一抗原均需制备荧光素抗体特异性强，但任一抗原均需制备荧光素抗体间接法间接法用第一抗体与标本中抗原结合，再用荧光素用第一抗体与标本中抗原结合，再用荧光素标记的二抗进行检测。灵敏度高、荧光素标记的二抗标记的二抗进行检测。灵敏度高、荧光素标记的二抗可用于多种抗原的检测，但非特异性荧光增多。可用于多种抗原的检测，但非特异性荧光增多。 第二节第

20、二节 淋巴细胞的测定淋巴细胞的测定 测定淋巴细胞的功能，可以判断机体的细测定淋巴细胞的功能，可以判断机体的细胞免疫或体液免疫水平。胞免疫或体液免疫水平。 测定淋巴细胞功能试验应用于功能性食品测定淋巴细胞功能试验应用于功能性食品等研究中。等研究中。T淋巴细胞增殖试验淋巴细胞增殖试验T细胞功能测定细胞功能测定细胞毒试验细胞毒试验T淋巴细胞增殖试验淋巴细胞增殖试验 T淋巴细胞在有丝分裂原或抗原刺激下可转化淋巴细胞在有丝分裂原或抗原刺激下可转化为淋巴母细胞，产生一系列形态变化。细胞变为淋巴母细胞，产生一系列形态变化。细胞变大、细胞浆增多、出现空泡、核仁明显、核染色大、细胞浆增多、出现空泡、核仁明显、核

21、染色质疏松等。质疏松等。T淋巴淋巴细胞增细胞增殖试验殖试验形态学方法形态学方法-镜检淋巴母细胞镜检淋巴母细胞3H-TdR掺入法掺入法氚标记胸腺嘧啶核苷氚标记胸腺嘧啶核苷（Thymidine ribosode)渗入法。测定渗入法。测定DNA增殖增殖的量的量(也可用于测也可用于测NK细胞活性细胞活性)MTT比色法比色法细胞活化增殖水平细胞活化增殖水平（ （可溶性可溶性噻唑盐，代谢后产生兰紫色物噻唑盐，代谢后产生兰紫色物） ）T淋巴淋巴细胞增细胞增殖试验殖试验T淋巴细胞增殖试验淋巴细胞增殖试验 根据形根据形态结态结构，构，计计算淋巴算淋巴细细胞胞转转化率，即淋巴母化率，即淋巴母细细胞的含量胞的含量形

22、态学方法形态学方法 淋巴细胞转化过程中，细胞淋巴细胞转化过程中，细胞DNA合成大合成大量增多。在细胞培养液中加入氚标记的胸量增多。在细胞培养液中加入氚标记的胸腺嘧啶核苷（腺嘧啶核苷（ 3H-TdR ），使），使3H-TdR渗渗入到入到DNA中，根据细胞内核素的量可判断中，根据细胞内核素的量可判断淋巴细胞转化程度。淋巴细胞转化程度。3H-TdR掺入法掺入法MTT比色法比色法 MTT是一种黄色可溶性噻唑盐，掺入细是一种黄色可溶性噻唑盐，掺入细胞后，在细胞活化增殖时通过线粒体能量胞后，在细胞活化增殖时通过线粒体能量代谢过程，代谢过程，MTT代谢形成蓝紫色甲瓒沉积代谢形成蓝紫色甲瓒沉积于细胞内或细胞周

23、围，形成的甲瓒的量与于细胞内或细胞周围，形成的甲瓒的量与细胞活化增殖的程度成正相关。细胞活化增殖的程度成正相关。细胞毒细胞毒试验试验细胞毒试验细胞毒试验乳酸脱氢酶法乳酸脱氢酶法细胞凋亡检查法细胞凋亡检查法 乳酸脱氢酶法乳酸脱氢酶法LDH在胞浆内含量丰在胞浆内含量丰富，正常时不能通过细胞膜，当细胞受富，正常时不能通过细胞膜，当细胞受损伤或死亡时可释放到细胞外，此时细损伤或死亡时可释放到细胞外，此时细胞培养液中胞培养液中LDH活性与细胞死亡的数目活性与细胞死亡的数目成正比，用比色法测定。成正比，用比色法测定。乳酸脱氢酶法乳酸脱氢酶法 细胞凋亡检查法细胞凋亡检查法靶细胞被靶细胞被CTL杀伤后，可发生细胞凋亡。方法有杀伤后，可发生细胞凋亡。方法有形形态学法、琼脂糖凝胶电泳、流式细态学法、琼脂糖凝胶电泳、流式细胞胞仪等。仪等。细胞凋亡检查法细胞凋亡检查法B细胞功能测定细胞功能测定 B细胞的数目和功能测定