第十一讲蛋白质的分离与纯化(二)

1、第十一讲第十一讲 蛋白质的分离与纯化蛋白质的分离与纯化（二）（二）第一节第一节 分离纯化概述分离纯化概述第二节第二节 纯化前处理纯化前处理第三节第三节 初级分离初级分离第四节第四节 精制分离精制分离色谱技术色谱技术第五节第五节 分离方案和纯度鉴定分离方案和纯度鉴定一、问答题（每题一、问答题（每题5 5分共分共3030分）：分）：1.1. 蛋白质工程的基本途径或主要步骤蛋白质工程的基本途径或主要步骤2.2. 什么是构型、构型，二者的主要差别。什么是构型、构型，二者的主要差别。3.3. AnfinsenAnfinsen原理及其意义。原理及其意义。4.4. 紫外可见吸收光谱和荧光光谱。紫外可见吸收光

2、谱和荧光光谱。5.5. 什么是核磁共振（什么是核磁共振（NMRNMR）？实现核磁共振的两种方法是什么？）？实现核磁共振的两种方法是什么？6.6. 什么是化学位移？什么是化学位移？19701970年年IUPACIUPAC规定，衡量化学位移的相对标准是什么？规定，衡量化学位移的相对标准是什么？规定其化学位移常数是多少？表示化学位移物理量的符号和单位的符号规定其化学位移常数是多少？表示化学位移物理量的符号和单位的符号各是什么？各是什么？蛋白质工程期中考试（蛋白质工程期中考试（20140514）分析）分析二、简述题（每题二、简述题（每题1010分共分共4040分）分）1.1.蛋白质一级结构、二级结构、

3、超二级结构、结构域和三级结构及其蛋白质一级结构、二级结构、超二级结构、结构域和三级结构及其主要作用力？它们之间的相互关系怎样？主要作用力？它们之间的相互关系怎样？2.2.如何理解蛋白质工程的含义（狭义和广义理解），其主线是什么？如何理解蛋白质工程的含义（狭义和广义理解），其主线是什么？3.3.什么是基因突变技术，包括哪两大类技术？举例说明这两大类技术什么是基因突变技术，包括哪两大类技术？举例说明这两大类技术包括哪些方法。包括哪些方法。4.4.预测蛋白质三级结构的方法有哪些？描述一种你熟悉的蛋白质高级预测蛋白质三级结构的方法有哪些？描述一种你熟悉的蛋白质高级结构预测方法的操作流程。结构预测方法的

4、操作流程。某种微生物合成的蛋白酶与人体消化液中的蛋白酶的结构和功能很相某种微生物合成的蛋白酶与人体消化液中的蛋白酶的结构和功能很相似，但对似，但对热稳定性较差热稳定性较差，进入人体后容易失效，现要将此酶开发成一，进入人体后容易失效，现要将此酶开发成一种片剂，临床治疗消化不良，通过蛋白质工程手段种片剂，临床治疗消化不良，通过蛋白质工程手段能否能否提高蛋白质的提高蛋白质的稳定性稳定性，请您试设计两套改造方案，请您试设计两套改造方案，简述改造方案依据的原理简述改造方案依据的原理。提示和要求：一套方案采用分子生物学修饰，另一套采用化学修饰。提示和要求：一套方案采用分子生物学修饰，另一套采用化学修饰。四

5、、论述题（四、论述题（20分）：分）：论述蛋白质一级结构测定的论述蛋白质一级结构测定的基本程序基本程序以及以及主要方法主要方法和和原理原理。 概述概述 常见色谱技术介绍常见色谱技术介绍第四节第四节 精制分离精制分离液相色谱技术液相色谱技术1、液相色谱（、液相色谱（Liquid chromatography）？）？l利用不同物质在利用不同物质在固定性和流动相固定性和流动相中的中的分配特性分配特性不同，对物质的分离的技不同，对物质的分离的技术。术。（理解）（理解） 依据物质的依据物质的理化特性理化特性（如：分子大小、形状、分子极性、电荷等）（如：分子大小、形状、分子极性、电荷等）不同，不同， 在在

6、固定性固定性和和流动相流动相中的中的分配系数不同分配系数不同 流动相为流动相为平推流平推流 流动相流过固定相时，两相之间流动相流过固定相时，两相之间分配平衡分配平衡很快很快 不同物质的不同物质的流动速度流动速度不同不同而实现分离。而实现分离。 又称为层析（平推流）又称为层析（平推流）l特点特点（四高）（四高）高效率、高纯度、高精度、高自动化程度高效率、高纯度、高精度、高自动化程度现代化色谱技术现代化色谱技术高效液相色谱高效液相色谱一、概述一、概述 1850年，年，德国化学家德国化学家Runge将古罗马时期分析将古罗马时期分析染料与色素染料与色素的方法进行改进的方法进行改进，发展成为发展成为纸色

7、谱纸色谱。 1903年，年，俄国植物学家俄国植物学家 Tsweet 在在华沙生物学会议华沙生物学会议上上发表发表分离分离植物色素植物色素的论文，的论文， 1906年，年，Tsweet首次首次“色谱法色谱法” 和和“ 色谱图色谱图”的的概念。概念。“色谱法色谱法”（Chromotography） “ 色谱图色谱图” （Chromatogram） 1941年，年，英国英国生物化学家生物化学家Martin与与英国英国化学家化学家Synge （获诺贝尔奖）创立（获诺贝尔奖）创立液液分配色液液分配色谱谱，以水份饱和硅胶为固定相，含乙醇的氯仿为流动相以水份饱和硅胶为固定相，含乙醇的氯仿为流动相分离分离乙酰

8、氨基酸乙酰氨基酸。 1970年中期，年中期，微处理机技术微处理机技术用于液相色谱，提高了液相色谱的用于液相色谱，提高了液相色谱的自动化水平和分析自动化水平和分析精度精度。 80年代，年代，色谱联用技术色谱联用技术发展迅速，逐渐出现了发展迅速，逐渐出现了色谱色谱光谱光谱联用、联用、色谱色谱质谱质谱联用、联用、二维色谱二维色谱（色谱（色谱色谱）等技术。色谱）等技术。 1990年以后，生物工程和生命科学的迅速发展，为年以后，生物工程和生命科学的迅速发展，为高效液相色谱高效液相色谱技术技术提出提出了更多、了更多、更新的分离、纯化、制备的更新的分离、纯化、制备的课题课题，促进了促进了高效液相色谱技术的发

9、展。高效液相色谱技术的发展。 2、 液相色谱法的发展液相色谱法的发展在色谱技术中，液相色谱（在色谱技术中，液相色谱（Liquid chromatographyLiquid chromatography）是最早（）是最早（19031903年）发年）发明的，但其初期发展明的，但其初期发展比较慢比较慢。液相色谱普及之前，液相色谱普及之前，纸色谱纸色谱、气相色谱气相色谱和和薄层色谱薄层色谱是是色谱分析色谱分析的主流。的主流。2020thth60S60S，将较为成熟的，将较为成熟的气相色谱气相色谱 理论与技术理论与技术应用于液相色谱，使液相色谱应用于液相色谱，使液相色谱迅速发展。迅速发展。特别是特别是（

10、色谱柱）（色谱柱）制备技术、制备技术、技术技术和和性能的不断改进，使性能的不断改进，使液相色谱分析实现了液相色谱分析实现了高效化和高速化高效化和高速化。19691969年，液相色谱仪年，液相色谱仪商品化商品化。从此，这种分离效率高、分析速度快的液相色。从此，这种分离效率高、分析速度快的液相色谱被称为谱被称为高效液相色谱法高效液相色谱法（HPLCHPLC）更加更加 微量、快速、高效、广泛。微量、快速、高效、广泛。新进展：新进展：微柱微柱HPLCHPLC、无孔色谱短柱、无孔色谱短柱HPLCHPLC、毛细管、毛细管HPLCHPLC2、液相色谱的发展、液相色谱的发展1.吸附层析吸附层析 adsorpt

11、ion chromatography2.分子筛层析分子筛层析 molecular sieve chromatography3.离子交换层析离子交换层析 ion exchange chromatography4.亲和层析亲和层析 affinity chromatography5.分配色谱分配色谱液液-液色谱液色谱6.疏水色谱疏水色谱疏水作用疏水作用7.等电点聚焦色谱等电点聚焦色谱pI3、液相色谱的类型、液相色谱的类型1 1、吸附分离色谱？、吸附分离色谱？（1 1）概念：）概念：利用利用固相吸附剂固相吸附剂对不同物质的对不同物质的吸附力吸附力不同，进行物质分离的不同，进行物质分离的液相色谱技术液相

12、色谱技术。（2 2）原理：）原理：通过通过范德华力范德华力，流动相流动相中的分子与固定相（吸附剂）吸附、再解吸附进中的分子与固定相（吸附剂）吸附、再解吸附进入流动相（洗脱剂）。入流动相（洗脱剂）。不同物质在不同物质在固相固相和和液相液相之间之间分配系数分配系数或或解离平衡解离平衡不同。不同。通过连续的通过连续的吸附吸附解吸附解吸附再吸附再吸附过程将物质分离。过程将物质分离。 二、常见色谱介绍二、常见色谱介绍（3）影响因素？）影响因素？吸附剂、溶剂、被分离物质的性质吸附剂、溶剂、被分离物质的性质“三方面三方面”l吸附剂：凡能对其它物质具有吸附剂：凡能对其它物质具有吸附作用吸附作用的固体物质。的固

13、体物质。l吸附剂选择原则：吸附剂选择原则：l根据：根据：吸附剂吸附剂性质、性质、溶剂溶剂的性质、被的性质、被分离对象分离对象的性质的性质选择选择。l表面积大、颗粒均匀、表面积大、颗粒均匀、吸附选择性吸附选择性好、稳定性强、成本低廉。好、稳定性强、成本低廉。l如何理解如何理解选择原则？（三者之间相互影响关系）：选择原则？（三者之间相互影响关系）：l极性强极性强的吸附剂易吸附的吸附剂易吸附极性强极性强的物质，的物质，非极性强非极性强的吸附剂易吸附的吸附剂易吸附非极性强非极性强的物质。的物质。l为了便于为了便于解吸附解吸附，对于，对于极性大极性大的分离物，选择的分离物，选择极性较小极性较小的的吸附剂

14、吸附剂，反之亦然，反之亦然 。l极性吸附剂、分离极性吸附剂、分离弱极性弱极性物质、弱极性溶剂洗脱；分离物质、弱极性溶剂洗脱；分离强极性强极性物质、用物质、用强极性强极性溶剂溶剂l理想吸附剂理想吸附剂和和溶剂溶剂的选择：依据原则，依靠的选择：依据原则，依靠经验经验和和多次试验多次试验。l常用吸附剂：常用吸附剂：l硅胶、氧化铝硅胶、氧化铝、活性炭、硅酸镁、聚酰胺、硅藻土、活性炭、硅酸镁、聚酰胺、硅藻土、羟基磷灰石羟基磷灰石等等l硅胶的硅醇基（分离中性和酸性成分）硅胶的硅醇基（分离中性和酸性成分）l氧化铝：多孔氧化铝：多孔Al2O3，分三种：酸性氧化铝、中性氧化铝、碱性氧化铝，分三种：酸性氧化铝、中

15、性氧化铝、碱性氧化铝l活性炭：非极性吸附剂、常用于活性炭：非极性吸附剂、常用于脱色和脱臭脱色和脱臭等吸附过程等吸附过程l层析方式（层析方式（2 2种）：种）： ：羟基磷灰石（羟基磷灰石（HAHA），），CaCa3 3(PO(PO4 4) )3 3OHOH2 2 ，酸性蛋白质、酶、核酸、病酸性蛋白质、酶、核酸、病毒等生命大分子毒等生命大分子。硅胶硅胶：含硅醇基团（含硅醇基团（-Si-OH-Si-OH），氨基酸、甾体激素、皂苷类、），氨基酸、甾体激素、皂苷类、类脂和色素等等。（分离并洗脱）类脂和色素等等。（分离并洗脱）：（只分离不洗脱），（只分离不洗脱），例如：例如：硅胶硅胶薄层层析和薄层层析和聚

16、酰胺薄膜聚酰胺薄膜薄层层析薄层层析u 硅胶薄层层析硅胶薄层层析：硅胶板分类（硅胶板分类（4 4类）类），硅胶硅胶H H（纯硅胶），能用腐蚀性强的显色剂；（纯硅胶），能用腐蚀性强的显色剂；硅胶硅胶G G（10%-15%10%-15%煅石膏和煅石膏和5%5%淀粉的硅胶）淀粉的硅胶）；硅胶硅胶CMCCMC（含羧甲基纤维素）（含羧甲基纤维素）；硅胶硅胶HF254HF254( (含荧光剂的硅胶含荧光剂的硅胶H)H)。 硅胶板的制备硅胶板的制备：玻璃板玻璃板，硅胶制备硅胶制备（加溶剂碾磨），（加溶剂碾磨），铺板铺板，活化活化和和合格检查：合格检查：约约1mg1mg苏丹黄苏丹黄、苏丹红苏丹红和和靛酚蓝靛酚蓝

17、混合物乙酸乙酯溶液点样，混合物乙酸乙酯溶液点样，苯：苯：展层剂展层剂，RfRf：苏丹黄苏丹黄 苏丹红苏丹红 靛酚蓝，苏丹黄靛酚蓝，苏丹黄RfRf约约0.50.5，苏丹红和靛酚蓝，苏丹红和靛酚蓝RfRf之差在之差在0.10.20.10.2。 分析程序：点样，展层，显色。分析程序：点样，展层，显色。u聚酰胺薄膜薄层层析：聚酰胺薄膜薄层层析： 如：如：DNS氨基酸分析，氨基酸分析，DNS-Cl（二甲氨基萘磺酰氯），灵敏度（二甲氨基萘磺酰氯），灵敏度10-910-10mol/L。 DNS-Cl和氨基酸或多肽在特定条件下反应。和氨基酸或多肽在特定条件下反应。 DABTH-氨基酸的薄层层析分析蛋白质序列。

18、氨基酸的薄层层析分析蛋白质序列。 Edman降解试剂降解试剂DABITC（4-N,N-二甲氨基偶氮苯二甲氨基偶氮苯-4-异硫氰酸酯）异硫氰酸酯）进行微量蛋白质序列分析（进行微量蛋白质序列分析（210 nmol肽样品）。肽样品）。单向纸层析单向纸层析 双向纸层析双向纸层析 薄层层析薄层层析硅胶硅胶G板薄层层析板薄层层析2、凝胶色谱凝胶色谱：凝胶凝胶过滤、过滤、排阻色谱或分子筛层析排阻色谱或分子筛层析以具有以具有筛孔筛孔的介质为固定相，依据的介质为固定相，依据分子大小分子大小进行物质分离的进行物质分离的液相色谱技术。液相色谱技术。 原理：原理：分子在固相分子在固相筛孔筛孔中自由扩散、渗透，中自由扩

19、散、渗透，不同尺寸的分子不同尺寸的分子在筛孔中的在筛孔中的分配系数分配系数不同，导致分子流动速度不同。不同，导致分子流动速度不同。流动相流动过程中，物质在凝胶内和凝胶外很快达到分配平衡。流动相流动过程中，物质在凝胶内和凝胶外很快达到分配平衡。分子量分子量大，大，排阻大，分子量小，排阻小，物质按分子量的大小流出分离柱。排阻大，分子量小，排阻小，物质按分子量的大小流出分离柱。分子排阻范围为：分子排阻范围为：0100%。（排阻率为。（排阻率为0和和100的物质不能分离。的物质不能分离。Why？）？）u如何理解？如何理解？凝胶色谱示意图凝胶色谱示意图0100200020406080elution vo

20、lume/mlAbsorbance/mAU UV280LH3LH2 分配系数分配系数（ Kav ）：）：l 分离组分在凝胶分离组分在凝胶内水内水和和外水外水体积中的比例关系。体积中的比例关系。l Kav=(Ve-V0)/Vi Vt=Vo+Vi+Vg， Vt、Vo、Vi和和Vg分别为：分别为：床体积床体积、外水体外水体积、积、内水体积内水体积和介质的体积。和介质的体积。 Ve：分离组分流出的体积。：分离组分流出的体积。 分离物质的大小，分离物质的大小，0 Kav 1， Kav=0或或 Kav=1，不能分离。，不能分离。凝胶种类和性质：凝胶种类和性质：l种类：浮石、琼脂、琼脂糖、聚乙烯醇、聚丙烯酰

21、胺、葡聚糖凝胶等：种类：浮石、琼脂、琼脂糖、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、葡聚糖凝胶等：l常用种类和商品名称常用种类和商品名称（根据分类对象选择凝胶材料）（根据分类对象选择凝胶材料）u交联交联葡聚糖葡聚糖（Sephadex G10G200）；）； Amersham Biosciencesu交联交联琼脂糖琼脂糖（Sepharose CL-4B,CL-6B）uSephacryl S 系列（聚丙烯酰胺系列（聚丙烯酰胺-葡聚糖）葡聚糖）uSuperdes 系列系列 （高交联琼脂糖（高交联琼脂糖-葡聚糖）葡聚糖）uBio-Beads S-X系列系列 （苯乙烯（苯乙烯-二乙烯苯）二乙烯苯）uBio-Gel P系列

22、系列 （聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺） Bio-RaduBio-Gel A系列系列 （琼脂糖）（琼脂糖）uTSKgel SW 系列系列 （硅胶硅胶）uTSKgel Toyopearl HW 系列，亲水性聚乙烯醇系列，亲水性聚乙烯醇 Toyo Soda uTSKgel PW 系列系列 亲水性亲水性聚乙烯聚乙烯uTSKgel CW-35 纤维素纤维素uCellulofine 纤维素纤维素 Chisso操作程序：操作程序：l凝胶选择和处理（型号和粒度、凝胶用量、凝胶处理）凝胶选择和处理（型号和粒度、凝胶用量、凝胶处理）l凝胶柱的制备凝胶柱的制备（柱选择：径长比约为：（柱选择：径长比约为：1:251:100，

23、装柱、柱鉴定），装柱、柱鉴定）l平衡层析柱平衡层析柱l加样和洗脱（加样、洗脱、样品收集，检测）加样和洗脱（加样、洗脱、样品收集，检测）l凝胶柱的再生和保存凝胶柱的再生和保存应用：应用：l分离纯化、脱盐和浓缩、去热源物质分离纯化、脱盐和浓缩、去热源物质l分析检测（定性、定量、分子量）。分析检测（定性、定量、分子量）。Kav=-blgMr+c（3）离子交换色谱：）离子交换色谱：理解：理解：依据电荷大小依据电荷大小 进行物质分离的进行物质分离的液相色谱技术液相色谱技术。原理：原理：l固相介质上结合有一定的固相介质上结合有一定的离子基团离子基团。l结合结合阳离子基团阳离子基团，称阴离子交换剂，其，称阴

24、离子交换剂，其反离子反离子为阴离子（如：为阴离子（如：Cl-）。）。l在适当的条件下，反离子与分离物中的阴离子交换。在适当的条件下，反离子与分离物中的阴离子交换。l在不同盐浓度或在不同盐浓度或pH值下，将带不同电荷的物质洗脱下来。值下，将带不同电荷的物质洗脱下来。洗脱方式：洗脱方式：l洗脱剂分类：盐梯度洗脱；洗脱剂分类：盐梯度洗脱；pH梯度洗脱。梯度洗脱。l洗脱梯度分类：连续梯度；不连续梯度。洗脱梯度分类：连续梯度；不连续梯度。01503000100200300 UV280 CNaclConcentration of Nacl/10-3mol*l-1Absorbance at 280nm/mA

25、Uelution volume/ml50%sampleRC-LH1LH20150300020 离子交换剂分类（离子交换剂分类（2种）种）l交换剂分类交换剂分类I（根据交换剂所带电荷：根据交换剂所带电荷：2大类）大类）阳离子阳离子交换剂：交联交换剂：交联阴阴离子基团，与阳离子交换。如：离子基团，与阳离子交换。如：羧甲基羧甲基（-O-CH2-COO-）阴离子阴离子交换剂：交联交换剂：交联阳阳离子基团，与阴离子交换。如：离子基团，与阴离子交换。如：氨基乙基氨基乙基（-O(CH2)2-NH3+）l交换剂分类交换剂分类II（根据（根据基质的组成基质的组成和性质：和性质：2大类）大类）u疏水性疏水性离子交

26、换剂离子交换剂（亲水性较小的合成树脂，如苯乙烯与二乙烯苯的聚合物）亲水性较小的合成树脂，如苯乙烯与二乙烯苯的聚合物）阳离子交换剂阳离子交换剂带负电荷，电荷强弱（强酸型、中强型和弱酸型），反离子为正电荷离子带负电荷，电荷强弱（强酸型、中强型和弱酸型），反离子为正电荷离子阴离子交换剂阴离子交换剂带正电荷，电荷强弱（强阴性、中阴性和弱阴性），反离子为负电荷离子带正电荷，电荷强弱（强阴性、中阴性和弱阴性），反离子为负电荷离子螯合离子交换剂螯合离子交换剂具有络合一些金属离子、排斥另外一些离子的能力，选择性更高具有络合一些金属离子、排斥另外一些离子的能力，选择性更高u亲水性亲水性离子交换剂离子交换剂（亲水

27、性较大的合成物质，纤维素、葡聚糖、交联琼脂糖等）亲水性较大的合成物质，纤维素、葡聚糖、交联琼脂糖等）阳离子交换剂阳离子交换剂阴离子交换剂阴离子交换剂常用固定相介质常用固定相介质 DEAE（二乙基胺基乙基）（二乙基胺基乙基） Cellulose DE-32 DEAECellulose DE-52 DEAE- Sephadex A-50（25） DEAE-Sepharos CL-6b DEAE-Bio-Gel A CM（羧甲基）（羧甲基）- Cellulose DE-52 CM- Cellulose CM- Sephadex C-25(50)离子交换剂的选择依据离子交换剂的选择依据 物质在溶液中的

28、电荷性质物质在溶液中的电荷性质 物质的吸附特性（疏水、亲水）物质的吸附特性（疏水、亲水） 实践和经验实践和经验蛋白质分离 离子交换色谱操作程序离子交换色谱操作程序 洗脱方式：梯度洗脱洗脱方式：梯度洗脱连续梯度和非连续梯度洗脱连续梯度和非连续梯度洗脱 应用：物质分离、测定等电点（应用：物质分离、测定等电点（PIPI）凝胶预处理凝胶预处理装住装住平衡平衡上样上样洗脱洗脱再生再生（4 4）亲和层析）亲和层析利用分子间利用分子间特异性可逆特异性可逆结合对物质进行结合对物质进行特异性分离特异性分离的的液相色谱技术液相色谱技术。 原理：原理：l具有具有特异性亲和力特异性亲和力的的两个分子两个分子中，一个固

29、定在中，一个固定在不溶性的基质不溶性的基质上，对另一个分子进上，对另一个分子进行分离。（次级作用力相互作用的分子）行分离。（次级作用力相互作用的分子）l固定在基质上的分子称固定在基质上的分子称配体配体，共价键与基质相连，构成，共价键与基质相连，构成固定相固定相。l流动相中的分子被特异性地与固定相吸附，使物质彼此分离。流动相中的分子被特异性地与固定相吸附，使物质彼此分离。l如：如：酶酶抑制剂、抗原抑制剂、抗原抗体、抗体、A A蛋白蛋白AgAg、配体、配体配基、过渡金属离子（配基、过渡金属离子（CuCu、NiNi、ZnZn、CoCo等）与等）与O O、S S、N N等供电子基团形成配位键，可与蛋白

30、质表面组氨酸的等供电子基团形成配位键，可与蛋白质表面组氨酸的咪唑基咪唑基、半胱氨酸的、半胱氨酸的巯基巯基、色氨酸的、色氨酸的吲哚吲哚基发生亲和基发生亲和作用。如作用。如NiNi柱柱分离带有分离带有组氨酸标签组氨酸标签的工程蛋白的工程蛋白。 操作程序：操作程序：l制备固相吸附剂制备固相吸附剂（选择凝胶、专一性合成、分析鉴定）（选择凝胶、专一性合成、分析鉴定）装柱装柱平衡平衡上样吸附上样吸附清洗清洗解解析分离析分离柱再生柱再生平衡平衡l解析剂：低解析剂：低pH pH 、高盐、竞争性洗脱剂、盐酸胍、高盐、竞争性洗脱剂、盐酸胍、 尿素等变性剂等。（尿素等变性剂等。（次级键次级键）l柱再生：高浓度盐、尿

31、素等溶液等柱再生：高浓度盐、尿素等溶液等l应用：物质分离、测定活性应用：物质分离、测定活性亲和层析原理和程序亲和层析原理和程序理解理解（5）疏水性相互作用色谱）疏水性相互作用色谱利用利用疏水作用疏水作用将不同物质分离的将不同物质分离的液相色谱技术液相色谱技术。u原理：原理：利用表面偶联利用表面偶联疏水性基团疏水性基团的基质作为固相的基质作为固相疏水吸附剂，疏水吸附剂，流动相中蛋白质等大分子组分与疏水固定相发生疏水作用，流动相中蛋白质等大分子组分与疏水固定相发生疏水作用，依据分离物组分与固相吸附剂疏水作用的差异。依据分离物组分与固相吸附剂疏水作用的差异。分离物质分离物质按疏水作用按疏水作用由小到

32、大的顺序分离开来。由小到大的顺序分离开来。u特点：特点：疏水吸附剂：含有苯基、辛基、丁基、醚基等疏水基团。疏水吸附剂：含有苯基、辛基、丁基、醚基等疏水基团。高盐溶液中，蛋白吸附能力强，高盐溶液中，蛋白吸附能力强，高盐上样，高盐上样，降低盐度将蛋白洗脱分离。降低盐度将蛋白洗脱分离。成本高，仅用于实验室小规模分离。成本高，仅用于实验室小规模分离。（6）反向色谱：）反向色谱： 利用表面利用表面非极性非极性的基质为固定相，的基质为固定相，极性极性有机溶剂（包括水）为有机溶剂（包括水）为流动相流动相，进行，进行物质分离的色谱技术。物质分离的色谱技术。 特点：特点：l固定相表面完全被固定相表面完全被非极性

33、基团非极性基团覆盖，具有强的覆盖，具有强的疏水性疏水性。l固定相吸附剂：如：以硅胶为载体，硅烷化连接固定相吸附剂：如：以硅胶为载体，硅烷化连接C4、C8、C18烷基或苯基。烷基或苯基。 l典型代表：典型代表：反相反相C18柱柱常用常用C18硅烷化的硅烷化的硅胶硅胶为吸附剂，极性很小。为吸附剂，极性很小。l极性流动相：其典型代表：甲醇和乙腈。极性流动相：其典型代表：甲醇和乙腈。 类别：制备型色谱和分析型色谱类别：制备型色谱和分析型色谱 应用：物质的分离和检测（定性和定量分析）应用：物质的分离和检测（定性和定量分析）l当今液相色谱最当今液相色谱最主流的分离模式主流的分离模式l适于适于所有能够所有能

34、够溶于溶于极性或弱极性溶剂极性或弱极性溶剂中的有机物质的分离。中的有机物质的分离。（7）分配色谱）分配色谱（也称液（也称液液色谱）液色谱）利用分离组分在利用分离组分在固定相固定相与与流动相流动相之间之间溶解度溶解度的差异来的差异来实现分离实现分离的的色谱技术色谱技术。u原理：原理：分配色谱的固定相是分配色谱的固定相是液相溶剂液相溶剂，依靠图布、键合、吸附等手段分布于色谱柱，依靠图布、键合、吸附等手段分布于色谱柱或者载体表面。或者载体表面。本质上是组分分子在本质上是组分分子在固定相固定相和和流动相流动相之间不断达到之间不断达到溶解平衡溶解平衡的过程。的过程。依据溶解度的不同，将组分分离。依据溶解

35、度的不同，将组分分离。u分类：分类：u正相色谱正相色谱（normal phase）：）： 是由是由极性固定相极性固定相和和非极性非极性（或弱极性）（或弱极性）流动相流动相所组成的液相色谱体系所组成的液相色谱体系 。吸附色谱也属正相色谱。吸附色谱也属正相色谱。极性键合固定相：极性键合固定相： 键合具有二醇基、醚基、氰基、氨基等键合具有二醇基、醚基、氰基、氨基等极性基团极性基团分子的载体。分子的载体。u反相色谱反相色谱（reversed phase）： 由由非极性固定相非极性固定相和和极性流动相极性流动相所组成的液相色所组成的液相色谱体系，与正相体系的谱体系，与正相体系的极性极性正好相反。正好相反

36、。非极性键合固定相：非极性键合固定相： 键合烷基、苯基等非极性有机分子。键合烷基、苯基等非极性有机分子。（8 8） 高效液相色谱高效液相色谱 高效液相色谱高效液相色谱是是色谱色谱的一个重要分支，的一个重要分支，l以以，采用，采用，将，将的单一溶剂或不同的单一溶剂或不同比例的混合溶剂或缓冲液等比例的混合溶剂或缓冲液等泵入装有固定相的泵入装有固定相的，l在层析柱内各组分彼此分离，依次进入在层析柱内各组分彼此分离，依次进入进行检测，从而实现对进行检测，从而实现对试样进行试样进行分析和制备分析和制备的色谱技术。的色谱技术。特点：特点： 高柱效、高精度、高灵敏度（微量）、高分辨率高柱效、高精度、高灵敏度

37、（微量）、高分辨率快速全自动分析快速全自动分析 主要由主要由组成：组成：。 其它其它辅助装置辅助装置：如梯度洗脱，脱气、自动进样及数据处理等。：如梯度洗脱，脱气、自动进样及数据处理等。根据色谱柱和分离的原理不同，根据色谱柱和分离的原理不同，高效液相色谱分为多种类型高效液相色谱分为多种类型（8.18.1）液相色谱仪组成）液相色谱仪组成高效液相色谱仪的结构示意图高效液相色谱仪的结构示意图 排阻色谱排阻色谱 离子交换色谱离子交换色谱 吸附层析吸附层析 亲和层析亲和层析 分配色谱分配色谱 疏水色谱疏水色谱 反向色谱反向色谱 聚焦色谱聚焦色谱1234 工作流程：工作流程：l高压泵高压泵将贮液器中将贮液器

38、中流动相溶剂流动相溶剂经过经过进进样器样器送入送入色谱柱色谱柱，通过，通过检测器检测器的出口的出口流出，流出，l注入欲分离样品，流动相将注入欲分离样品，流动相将样品贮液样品贮液器器（上样环）的（上样环）的样品样品带入色谱柱带入色谱柱进行进行分离，分离，l分离组分依先后顺序进入分离组分依先后顺序进入检测器检测器，记，记录仪将检测器送出的信号记录下来，录仪将检测器送出的信号记录下来，由此得到液相色谱图。由此得到液相色谱图。 8.2 液相色谱仪工作流程液相色谱仪工作流程光合细菌色素光合细菌色素HPLCHPLC分析分析HPLC（USA，Angilent 1100）小结：要求掌握小结：要求掌握 液相色谱

39、概念、原理和基本操作流程液相色谱概念、原理和基本操作流程 高效液相色谱的原理和操作流程高效液相色谱的原理和操作流程 排阻色谱排阻色谱 离子交换色谱离子交换色谱 吸附层析吸附层析 亲和层析亲和层析 分配色谱分配色谱 疏水色谱疏水色谱 反向色谱反向色谱 聚焦色谱聚焦色谱1、纯化方案的设计、纯化方案的设计（1）目的：从混合组分中提取纯化）目的：从混合组分中提取纯化目的组分目的组分，设计方案，指导分离过程进行。，设计方案，指导分离过程进行。（2）依据：分离）依据：分离物质物质的性质和特点，结合分离纯化的性质和特点，结合分离纯化方法方法的特点，对分离方法进的特点，对分离方法进行比较分析，选择出行比较分析

40、，选择出一种或几种一种或几种方法的方法的组合组合。（3）原则：）原则： 各种分离方法各有特色，操作程序简繁不一；各种分离方法各有特色，操作程序简繁不一； 考虑分离对象的特性和结构，以及取材的特点；考虑分离对象的特性和结构，以及取材的特点； 分离方案分离方案不是僵化不是僵化的，在实验中，对方案进行的，在实验中，对方案进行不断修正、调节、完善不断修正、调节、完善； 设计分离纯化方案设计分离纯化方案表格表格并进行试验验证并进行试验验证，获得分离工艺，获得分离工艺。第五节第五节 分离方案和纯度鉴定分离方案和纯度鉴定2、纯化方法的评价、纯化方法的评价u理论分析的局限性：只有通过理论分析的局限性：只有通过实践检验实践检验检验真理的唯一标准检验真理的唯一标准；u评价方法：对分离过程的每一步评价方法：对分离过程的每一步收集留份收集留份，进行分析检测；，进行分析检测；l测定指标测定指标：五个指标（测定五个指标（测定2个，计算个，计算3个）个）。l测定：含量和活性测定：含量和活性计算原样品中的总含量、总活性计算原样品中的总含量、总活性l计算：计算：比活力，纯化倍数比活力，纯化倍数（比活性（比活性/粗提液比活性）粗提液比活性），收率收率（总活性（总活性/粗提液总粗提液总活性）活性）；如：如：比活力比活力酶酶（酶活（酶活/酶量），酶量），胰岛素胰岛素（效价（效价/蛋白量）蛋白量）l判定标准判定标准：纯化