第5章蛋白质结构解析

1、 人体基因数目仅比低等生物线虫多两倍。人体基因数目仅比低等生物线虫多两倍。如此少的基因是如何创造出人体如此复杂如此少的基因是如何创造出人体如此复杂的生命活动？的生命活动？ 人体基因的主要功能是通过蛋白质来实现人体基因的主要功能是通过蛋白质来实现的，的，蛋白质扮演着构筑生命大厦的主要角蛋白质扮演着构筑生命大厦的主要角色。色。人体中大约有人体中大约有1010万种蛋白质。万种蛋白质。 测定蛋白质结构的意义测定蛋白质结构的意义vX-X-射线晶体衍射法：射线晶体衍射法：85.3% 85.3% v核磁共振波谱：核磁共振波谱：14.7%14.7%v电镜三维重构、各种光谱技术、显微电镜三维重构、各种光谱技术、

2、显微 技术和计算机模拟技术和计算机模拟 l 1895年年11月月8日日 ,德国物德国物理学家，理学家，50岁的伦琴在岁的伦琴在自己的实验室中偶然发自己的实验室中偶然发现现 一种从阴极射线管一种从阴极射线管中辐射出的新型射线，中辐射出的新型射线，由于对管子发出的由于对管子发出的“东东西西”性质不确定，伦琴性质不确定，伦琴就把这种射线命名为就把这种射线命名为“X射线射线” 。图片出处: http:/ 伦琴实验室伦琴实验室人类第一张人类第一张X光照片光照片图片出处:http:/ 伦琴妻子之手伦琴妻子之手 1896年年1月月23日伦日伦琴将这一重大发现在维琴将这一重大发现在维尔兹堡物理医学会上报尔兹堡

3、物理医学会上报告。告。Kolliker教授提议教授提议将该射线命名为将该射线命名为“伦琴伦琴射线射线”,但伦琴却说：但伦琴却说：“我还没有彻底解释这我还没有彻底解释这种射线的发生现象，还种射线的发生现象，还是称它为是称它为X射线最恰射线最恰当。当。” 威廉威廉康拉德康拉德伦琴伦琴 Wilhelm Conrad Rntgenl1901年第一届诺贝尔物理学奖评选时，年第一届诺贝尔物理学奖评选时，29封推荐信中就有封推荐信中就有17封集中推荐他。伦封集中推荐他。伦琴最终获得了第一次诺贝尔物理学奖金琴最终获得了第一次诺贝尔物理学奖金图片出处http:/ X射线本质射线本质 X射线是一种短波长射线是一种

4、短波长(0.00510nm)、高能量高能量(2.5105 1.2102eV)的电磁波。的电磁波。它是原子内层电子在高速运动电子流冲它是原子内层电子在高速运动电子流冲击下，产生跃迁而发射的电磁辐射。击下，产生跃迁而发射的电磁辐射。l 一般由高速电子撞击金属产生。如图所示，是一种产生一般由高速电子撞击金属产生。如图所示，是一种产生X射线的真空管，射线的真空管，K是发射电子的热阴极，是发射电子的热阴极，A是由钼、钨或是由钼、钨或铜等金属制成的阳极。两极之间加有数万伏特的高电压，铜等金属制成的阳极。两极之间加有数万伏特的高电压，使电子流加速，向阳极使电子流加速，向阳极A撞击而产生撞击而产生X射线。射线

5、。AX射线衍射射线衍射l1912年年Max von Laue发现发现X射线具有衍射线具有衍射的现象。（射的现象。（1914年的诺贝尔物理学奖）年的诺贝尔物理学奖）图片出处图片出处: :http:/ 劳厄的实验装置劳厄的实验装置 图片出处图片出处:http:/ l X射线衍射分析所依赖的基本原理是射线衍射分析所依赖的基本原理是X射线衍射现象射线衍射现象l X射线衍射现象射线衍射现象利用利用X射线的波长和晶体中原子的大小及射线的波长和晶体中原子的大小及原子间距同数量级的特性来分析晶体结构。原子间距同数量级的特性来分析晶体结构。 l 当当X射线入射到样品晶体分子上时，分子上的每个原子使射线入射到样品

6、晶体分子上时，分子上的每个原子使X射线发生散射，这些散射波之间相互叠加形成衍射图形。射线发生散射，这些散射波之间相互叠加形成衍射图形。 l 衍射图形能给出样品内部结构的许多资料，如原子间的衍射图形能给出样品内部结构的许多资料，如原子间的距离距离、键角键角，分子的，分子的立体结构立体结构、绝对构型绝对构型、原子和分子、原子和分子的的堆积堆积、有序或无序的、有序或无序的排列排列等。等。 X X射线通过红宝石晶体射线通过红宝石晶体( (a)a)和硅单晶体和硅单晶体( (b)b)所拍摄的劳厄斑所拍摄的劳厄斑图片出处图片出处:http:/ 劳伦斯劳伦斯布拉格布拉格( Lawrence Bragg) 因在

7、用因在用X射线研究晶体结构方面所作出的杰出贡射线研究晶体结构方面所作出的杰出贡献献 ,亨利亨利布拉格布拉格（William Henry Bragg）和和劳伦劳伦斯斯布拉格布拉格（William Lawrence Bragg）父子分享了父子分享了1915年的诺贝尔物理学奖。年的诺贝尔物理学奖。图片出处图片出处50/nobel/nobel1.htm 图片出处图片出处/physics/laureates/1915/wl-bragg-bio.html l 20世纪世纪60年代解析一个蛋白质结构可以获年代解析一个蛋白质结构可以获

8、得诺贝尔奖；得诺贝尔奖；l 20世纪世纪70年代解析一个蛋白质结构则可成年代解析一个蛋白质结构则可成 为轰动世界的新闻；为轰动世界的新闻； l 20世纪世纪80年代解析一个蛋白质结构则可申请到教授的职位；年代解析一个蛋白质结构则可申请到教授的职位；l 20世纪世纪90年代解析一个蛋白质结构通常可以获得博士学位；年代解析一个蛋白质结构通常可以获得博士学位；l 今天，一个博士研究生也许就可解析多个蛋白质结构，但如今天，一个博士研究生也许就可解析多个蛋白质结构，但如果没有深入研究其结构与功能的关系，往往不能毕业。果没有深入研究其结构与功能的关系，往往不能毕业。蛋白质结构解析的发展蛋白质结构解析的发展

9、饶子和院士饶子和院士HIV基质蛋白基质蛋白 SARS射线衍射用于蛋白质结构的测定射线衍射用于蛋白质结构的测定l1954年年伯纳尔伯纳尔(Bernal)获得第一张胃蛋白获得第一张胃蛋白酶晶体衍射图片。酶晶体衍射图片。l1957年年肯特罗肯特罗(Kendrew)完成肌红蛋白完成肌红蛋白的的0.6 nm分辨率的蛋白质晶体结构分辨率的蛋白质晶体结构图片出处:http:/www.drg.de/data/wuerdigungen/Nobelpreise/RoenNobel.htm 图片出处:http:/www2.mrcmb.cam.ac.uk/archive/gal/source/kendrew.html

10、 肌红蛋白的三维结构肌红蛋白的三维结构 肌红蛋白的三维结构模型肌红蛋白的三维结构模型图片出处:http:/ http:/ www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/ archive/Kendrew62.html 1959年年佩鲁茨佩鲁茨(Perute)完成血完成血红蛋白红蛋白0.55分辨分辨率的晶体结构率的晶体结构图片出处:http:/www.hsgq.pudong- (1962) 血红蛋白的四级结构血红蛋白的四级结构 模型模型图片出处http:/ 血红蛋白分子就是由二个由血红蛋白分子就是由二个由141个氨基酸残基组成的个氨基酸残基组成的亚基和二个由亚基和二个由146个氨基酸个氨基酸残基组

11、成的残基组成的亚基按特定的接触和排列组成的一个球状蛋白质分子，每个亚基中亚基按特定的接触和排列组成的一个球状蛋白质分子，每个亚基中各有一个含亚铁离子的血红素辅基。四个亚基间靠氢键和八个盐键维系着血红蛋各有一个含亚铁离子的血红素辅基。四个亚基间靠氢键和八个盐键维系着血红蛋白分子严密的空间构象。白分子严密的空间构象。 由于测定出蛋白质的精细结构由于测定出蛋白质的精细结构, ,两位英国科两位英国科学家学家M.F.M.F.佩鲁茨佩鲁茨和和J.C.J.C.肯德鲁肯德鲁获得获得19621962年的诺年的诺贝尔化学奖。贝尔化学奖。图片出处：图片出处： 1997年年,核小体八组蛋白结构核小体八组蛋白结构 20

12、04年年,菠菜捕光复合物菠菜捕光复合物LHC-II2005年，线粒体膜蛋白复合物年，线粒体膜蛋白复合物2精细结构精细结构X射线衍射测定蛋白和核酸精细结构，为射线衍射测定蛋白和核酸精细结构，为新药设计新药设计提供了全新方向提供了全新方向中国科学家研制抗癌新药首获瑞典爱明诺夫奖施一公抗癌抗乙肝病毒新药施一公抗癌抗乙肝病毒新药Birinapant，进入临床二期，进入临床二期蛋白质蛋白质X X射线晶体结构测定程序射线晶体结构测定程序 l 1、样品制备、样品制备 l 2、蛋白质结晶和晶体生长、蛋白质结晶和晶体生长 l 3、衍射数据收集和处理、衍射数据收集和处理 l 4、位相求解、位相求解 l 5、模型建

13、立和修正、模型建立和修正 1、样品制备、样品制备 l大量表达、分离和纯化目标蛋白大量表达、分离和纯化目标蛋白 一般要求纯度大于一般要求纯度大于97%，浓度达到浓度达到5mg/ml以上。以上。2、蛋白质结晶和晶体生长、蛋白质结晶和晶体生长 蛋白质结晶原理蛋白质结晶原理 与小分子结晶一样，蛋白质在溶液中处于与小分子结晶一样，蛋白质在溶液中处于过饱和状态时，分子间可以规则的方式堆过饱和状态时，分子间可以规则的方式堆积起来形成晶体析出积起来形成晶体析出 蛋白质晶体生长的影响因素蛋白质晶体生长的影响因素l 物理因素物理因素：温度温度、重力、重力、压力压力、震动、时间、电场磁场、震动、时间、电场磁场、介质

14、的电解质性质和粘度、均相或非均相成核等介质的电解质性质和粘度、均相或非均相成核等 l 化学因素化学因素：pH值、沉淀剂值、沉淀剂类型和浓度、添加剂、离子种类型和浓度、添加剂、离子种类、离子强度、类、离子强度、过饱和度过饱和度、氧化还原环境、蛋白质浓度等、氧化还原环境、蛋白质浓度等 l 生化因素生化因素：蛋白质纯度蛋白质纯度、配合体、抑制剂、化学修饰、遗、配合体、抑制剂、化学修饰、遗传修饰、蛋白质的聚集状态、蛋白质水解、蛋白质自身的传修饰、蛋白质的聚集状态、蛋白质水解、蛋白质自身的对称性、蛋白质的稳定性和对称性、蛋白质的稳定性和等电点等电点等等 蛋白质结晶方法蛋白质结晶方法 （1）批量结晶法（）

15、批量结晶法（Batch crystallization） （2）透析法）透析法( Dialysis ) （3） 液相扩散法液相扩散法(Liquid diffusion) （4） 气相扩散法（气相扩散法（Vapour diffusion） （5） 蛋白质结晶新方法蛋白质结晶新方法 （1）批量结晶法（）批量结晶法（Batch crystallization）l通过在待测结晶蛋白质溶液的通过在待测结晶蛋白质溶液的体积、浓度体积、浓度和和组成固定组成固定的条件下，直接将的条件下，直接将不同量的饱不同量的饱和沉淀剂和沉淀剂加入未饱和的蛋白质溶液以产生加入未饱和的蛋白质溶液以产生一个浓度梯度而使蛋白质在不

16、同的过饱和一个浓度梯度而使蛋白质在不同的过饱和溶液中结晶。溶液中结晶。 （2）透析法）透析法( Dialysis ) l利用利用半透膜半透膜允许小分子透过而大分子不能允许小分子透过而大分子不能透过的性质来调节蛋白质溶液的沉淀剂浓透过的性质来调节蛋白质溶液的沉淀剂浓度、度、pH或离子强度，从而使蛋白质溶液缓或离子强度，从而使蛋白质溶液缓慢形成过饱和状态以形成晶核。慢形成过饱和状态以形成晶核。该法是培该法是培养蛋白质晶体的常用方法。养蛋白质晶体的常用方法。（3） 液相扩散法液相扩散法(Liquid diffusion) l利用利用液相平衡原理液相平衡原理而设计的。由于蛋白质在而设计的。由于蛋白质在

17、不同溶液中的溶解度不同，把待结晶蛋白质不同溶液中的溶解度不同，把待结晶蛋白质溶液缓慢加入溶液缓慢加入溶解性差异大的溶剂溶解性差异大的溶剂中，在界中，在界面处形成沉淀剂浓度梯度在局部达到瞬间过面处形成沉淀剂浓度梯度在局部达到瞬间过饱和，从而促使晶核形成。饱和，从而促使晶核形成。（4） 气相扩散法（气相扩散法（Vapour diffusion）l把待结晶蛋白质、把待结晶蛋白质、高于高于此蛋白质结晶所需此蛋白质结晶所需盐浓度的溶液和盐浓度的溶液和低于低于这种浓度的盐溶液放这种浓度的盐溶液放在一个密闭体系内，两种浓度不同的溶液在一个密闭体系内，两种浓度不同的溶液由于发生由于发生蒸汽扩散蒸汽扩散最后达到

18、平衡，随着溶最后达到平衡，随着溶液中沉淀剂浓度的增加蛋白质溶解性降低液中沉淀剂浓度的增加蛋白质溶解性降低，从而蛋白质达到过饱和而析出晶体。，从而蛋白质达到过饱和而析出晶体。（5） 结晶新方法结晶新方法Nucleant 生物玻璃生物玻璃晶体初步鉴定晶体初步鉴定偏光显微镜观察、染色、电泳等偏光显微镜观察、染色、电泳等3、衍射数据收集和处理、衍射数据收集和处理l第三代同步辐射光源的应用使得用第三代同步辐射光源的应用使得用20-40 um大小的晶体解析高分辨率结构已经成为大小的晶体解析高分辨率结构已经成为现实现实APS（USA）; ESRF（France）; SPring-8（Japan）上海同步辐射

19、中心上海同步辐射中心同步辐射光源同步辐射光源晶体收集和储存晶体收集和储存液氮气冷技术4、位相求解、位相求解 1. 分子置换法分子置换法(MR)2. 多对同晶型置换法多对同晶型置换法(MIR)3. 多波长反常散射法多波长反常散射法(MAD)实验中经常联合使用实验中经常联合使用分子置换法分子置换法(MR)l分子置换法就是把已知结构的蛋白质分子分子置换法就是把已知结构的蛋白质分子放到待测蛋白质晶体的晶胞中建立起初始放到待测蛋白质晶体的晶胞中建立起初始结构模型并借助此模型计算待测蛋白质晶结构模型并借助此模型计算待测蛋白质晶体各个衍射点的相角的方法。体各个衍射点的相角的方法。 多对同晶型置换法多对同晶型

20、置换法(MIR)l在蛋白质晶体中引入在蛋白质晶体中引入散射能力强的重金属散射能力强的重金属原子原子如如Pb和和Hg等作为标志原子，制备出重等作为标志原子，制备出重原子的衍生物，然后求出这些重原子在晶原子的衍生物，然后求出这些重原子在晶胞中的坐标，根据坐标计算出重原子散射胞中的坐标，根据坐标计算出重原子散射波在各个衍射点的相角，最后推测出蛋白波在各个衍射点的相角，最后推测出蛋白质分子在各个衍射中的位相。质分子在各个衍射中的位相。 多波长反常散射法多波长反常散射法(MAD)l利用利用同步辐射波长连续可变同步辐射波长连续可变的特点，使用的特点，使用一个重原子衍生物作为母体，用一个晶体一个重原子衍生物

21、作为母体，用一个晶体就可以收集到重原子反常散射吸收边两侧就可以收集到重原子反常散射吸收边两侧的多套数据，并解出结构。的多套数据，并解出结构。 5、模型建立和修正、模型建立和修正l晶体学晶体学R因子一般要求达到因子一般要求达到0.2以下以下l键长偏差大约为键长偏差大约为0.015l键角偏差约为键角偏差约为3l二面角构象分布要求除了甘氨酸的二面角二面角构象分布要求除了甘氨酸的二面角构象是随机的外，其他残基的二面角构象构象是随机的外，其他残基的二面角构象分布受到立体化学的限制分布受到立体化学的限制l X-Ray晶体衍射目前仍然是蛋白质三维结构测定的晶体衍射目前仍然是蛋白质三维结构测定的主要方法主要方

22、法l 优点：优点：分辨率高，能精确确定生物大分子中各原子分辨率高，能精确确定生物大分子中各原子的坐标、键长、键角的坐标、键长、键角,给出生物大分子的分子结构和给出生物大分子的分子结构和构型构型,确定活性中心的位置和结构确定活性中心的位置和结构 l 缺点：缺点：只能测定单晶，反映静态结构信息，无法测只能测定单晶，反映静态结构信息，无法测定溶液中的信息定溶液中的信息v 成为推广速度和发展速度都居首位的一种结构分析方法。成为推广速度和发展速度都居首位的一种结构分析方法。v 核磁共振可以方便地在溶液中研究分子结构并且是核磁共振可以方便地在溶液中研究分子结构并且是唯一唯一可以使试样不经受任何破坏的结构分

23、析方法可以使试样不经受任何破坏的结构分析方法。v目前核磁共振成象技术已能以活人为观察对象，扫描身目前核磁共振成象技术已能以活人为观察对象，扫描身体中任何器官或组织的任何一个断面的核磁共振参数体中任何器官或组织的任何一个断面的核磁共振参数，成成为一种引人注目的癌症早期诊断技术。为一种引人注目的癌症早期诊断技术。 NMRNMR核磁共振技术（核磁共振技术（NMR）v1946年美国年美国斯坦福大学斯坦福大学的的F.Bloch和哈佛大学的和哈佛大学的E.M.Purcell两个研究小组首次独立观察到核磁共振现象，两个研究小组首次独立观察到核磁共振现象，为此他们两人获为此他们两人获1952年诺贝尔物理奖。年

24、诺贝尔物理奖。v1983年年，瑞士科学家，瑞士科学家Kurt WKurt Wthrichthrich教授实验室首次运用教授实验室首次运用核磁共振方法解析了胰高血糖素（核磁共振方法解析了胰高血糖素（glucagonglucagon）多肽的溶液构多肽的溶液构象象. .发明了利用核磁共振发明了利用核磁共振( (NMR)NMR)技术测定溶液中生物大分子三维技术测定溶液中生物大分子三维结构的方法获得了结构的方法获得了20022002年度诺贝尔化学奖年度诺贝尔化学奖 v74岁的美国科学家保罗岁的美国科学家保罗劳特布尔和劳特布尔和70岁的英国科学家彼岁的英国科学家彼得得曼斯菲尔德为曼斯菲尔德为2003诺贝尔

25、医学奖的得主诺贝尔医学奖的得主 NMR基本原理基本原理核 磁 共 振核 磁 共 振 ( ( N u c l e a r N u c l e a r Magnetic Resonance)Magnetic Resonance)，就是处于某个静磁场中的就是处于某个静磁场中的自旋核系统受到相应频率自旋核系统受到相应频率的射频磁场作用时的射频磁场作用时 , ,共振共振吸收某一特定频率的射频吸收某一特定频率的射频辐射的物理过程。辐射的物理过程。 核磁共振波谱仪核磁共振波谱仪核磁共振波谱核磁共振波谱是测量原子核对是测量原子核对射频辐射射频辐射( (约约4 4 600MHz)600MHz)的吸收，的吸收，这

26、种吸收只有在高磁场中才能这种吸收只有在高磁场中才能产生。产生。15核磁共振波谱仪核磁共振波谱仪 核磁共振波谱仪核磁共振波谱仪1永久磁铁永久磁铁：提供外磁场，：提供外磁场，要求稳定性好，均匀，不要求稳定性好，均匀，不均匀性小于六千万分之一。均匀性小于六千万分之一。扫场线圈。扫场线圈。2 射频振荡器射频振荡器：线圈垂：线圈垂直于外磁场，发射一定频直于外磁场，发射一定频率的电磁辐射信号。率的电磁辐射信号。60MHz或或100MHz。3 射频信号接受器射频信号接受器（检测（检测器）：当质子的进动频率与器）：当质子的进动频率与辐射频率相匹配时，发生能辐射频率相匹配时，发生能级跃迁，吸收能量，在感应级跃迁

27、，吸收能量，在感应线圈中产生毫伏级信号。线圈中产生毫伏级信号。4样品管：外径样品管：外径5mm的玻的玻璃管璃管,测量过程中旋转测量过程中旋转, 磁场磁场作用均匀。作用均匀。如果一个人知道了一间房子的所有尺寸，就可以画出房如果一个人知道了一间房子的所有尺寸，就可以画出房子的三维图形。同样，如图所示，通过测量蛋白质中的子的三维图形。同样，如图所示，通过测量蛋白质中的大量的短距离，就可以画出其结构的三维图像。大量的短距离，就可以画出其结构的三维图像。l 瑞士科学家库尔特瑞士科学家库尔特维特里希则发明了维特里希则发明了“利用核磁共振技术测定溶利用核磁共振技术测定溶液中生物大分子三维结构法液中生物大分子

28、三维结构法”。这种方法的优点是可对溶液中的蛋。这种方法的优点是可对溶液中的蛋白质进行分析白质进行分析, ,进而可对活细胞中的蛋白质进行分析进而可对活细胞中的蛋白质进行分析, ,能获得能获得“活活”蛋白质的结构蛋白质的结构, ,其意义非常重大。其意义非常重大。l 这种方法的这种方法的原理原理可以用测绘房屋的结构来比喻首先选定一座房屋的可以用测绘房屋的结构来比喻首先选定一座房屋的所有拐角作为测量对象所有拐角作为测量对象, ,然后测量所有相邻拐角间的距离和方位然后测量所有相邻拐角间的距离和方位, ,据据此就可以推知房屋的结构。维特里希选择生物大分子中的此就可以推知房屋的结构。维特里希选择生物大分子中

29、的质子质子( (氢原氢原子核子核) ) 作为测量对象作为测量对象, ,连续测定所有相邻的连续测定所有相邻的2 2个质子之间的距离和方个质子之间的距离和方位位, ,这些数据经计算机处理后就可形成生物大分子的三维结构图。这些数据经计算机处理后就可形成生物大分子的三维结构图。核磁共振法中几个常用的参数核磁共振法中几个常用的参数l化学位移化学位移 l耦合常数耦合常数 lNOE（核欧沃豪斯效应）信号强度（核欧沃豪斯效应）信号强度 l谱峰面积谱峰面积 l弛豫时间弛豫时间 1.化学位移化学位移 l 值越大，表示屏蔽作用越小，吸收峰出现在值越大，表示屏蔽作用越小，吸收峰出现在低场；低场； 值越小，表示屏蔽作用

30、越大，吸收峰值越小，表示屏蔽作用越大，吸收峰出现在高场。出现在高场。2.耦合常数耦合常数 核与核之间核与核之间以价电子为媒介相互耦合引起谱以价电子为媒介相互耦合引起谱线分裂的现象称为自旋裂分。由于自旋裂分线分裂的现象称为自旋裂分。由于自旋裂分形成的多重峰中相邻两峰之间的距离被称为形成的多重峰中相邻两峰之间的距离被称为自旋自旋耦合常数自旋自旋耦合常数,用用J表示。耦合常数用表示。耦合常数用来表征两核之间来表征两核之间耦合作用的大小耦合作用的大小。 J耦合常数大小主要与连接两个核的化学键耦合常数大小主要与连接两个核的化学键数目有关，与影响标量耦合核之间电子云分数目有关，与影响标量耦合核之间电子云分

31、布的因素有关。布的因素有关。 3.NOE信号强度信号强度 l当分子内有两个空间距离小于当分子内有两个空间距离小于0.5nm的原子的原子核时，如果用双共振法照射其中一个核，核时，如果用双共振法照射其中一个核，使干扰场的强度增加到刚使被干扰的谱线使干扰场的强度增加到刚使被干扰的谱线达到饱和，则另一个靠近的原子核的共振达到饱和，则另一个靠近的原子核的共振信号就会增加，这种现象称信号就会增加，这种现象称核欧沃豪斯效核欧沃豪斯效应应 （NOE）。）。 4.谱峰面积谱峰面积 l谱峰面积和分子中同一化学环境的原子核谱峰面积和分子中同一化学环境的原子核数目的多少成正比，因此峰面积的积分值数目的多少成正比，因此

32、峰面积的积分值可用来做定量分析的基础。可用来做定量分析的基础。 5.弛豫时间弛豫时间 l原子核从激化的状态回复到平衡排列状态原子核从激化的状态回复到平衡排列状态的过程叫弛豫过程。它所需的时间叫的过程叫弛豫过程。它所需的时间叫弛豫弛豫时间时间。 l 自旋晶格弛豫：自旋晶格弛豫：处于高能态的氢核，把能量转给处于高能态的氢核，把能量转给周围的分子，回到低能态。周围的分子，回到低能态。 l 自旋自旋-自旋弛豫自旋弛豫 ：两个进动频率相同，进动取向两个进动频率相同，进动取向不同的磁性核，在一定距离内时，它们相互交换不同的磁性核，在一定距离内时，它们相互交换能量，改变进动方向。能量，改变进动方向。 二维核

33、磁共振二维核磁共振(2DNMR） NMR可获得分子内各核的化学环境、核间的耦合关系、可获得分子内各核的化学环境、核间的耦合关系、空间构象等信息，但是当分子较大的时候，由于裂分谱空间构象等信息，但是当分子较大的时候，由于裂分谱线间的重叠，因此在测定了同一种核的一维谱之后，需线间的重叠，因此在测定了同一种核的一维谱之后，需要了解两种或三种不同核之间的联系关系，如要了解两种或三种不同核之间的联系关系，如C-H，N-H等就需要用到等就需要用到2DNMR，它是它是2个频率变量的函数，吸收个频率变量的函数，吸收峰对峰对2个频率变量作图。个频率变量作图。1H-1H COSY、 1H-15N HSQC 多维核

34、磁共振多维核磁共振v1H，13C，15N核之间的化学键连接来得到核磁共振核之间的化学键连接来得到核磁共振相关信号。相关信号。 CBCANH、HNCO、HCCH-COSY v核磁共振本身不能展示样体的内部结构。要得到内部核磁共振本身不能展示样体的内部结构。要得到内部的图像，就要将的图像，就要将不同梯度不同梯度的磁场加以结合，即改变穿过的磁场加以结合，即改变穿过样本的磁场强度。这样就有无数二维的图像，彼此重叠样本的磁场强度。这样就有无数二维的图像，彼此重叠后就得到样本内部空间的三维图像后就得到样本内部空间的三维图像 核磁共振技术的应用核磁共振技术的应用l早期早期核磁共振主要用于对核磁共振主要用于对

35、核结构和性质核结构和性质的的研究，如测量核磁矩、电四极距、及核自研究，如测量核磁矩、电四极距、及核自旋等旋等l后来后来广泛应用于广泛应用于分子分子组成和结构分析，组成和结构分析，生生物物组织与组织与活体活体组织分析，病理分析、医疗组织分析，病理分析、医疗诊断、产品无损监测等方面诊断、产品无损监测等方面19851985年年, ,维特里希等人公布了第一次利用维特里希等人公布了第一次利用NMR NMR 法测定的溶法测定的溶液中蛋白质液中蛋白质蛋白酶抑制剂蛋白酶抑制剂IIA ( proteinase IIA ( proteinase inhibitor IIA) inhibitor IIA) 的结构的

36、结构 NMR图谱得到的蛋白质三维结构图谱得到的蛋白质三维结构from：厦门大学生命科学学院：厦门大学生命科学学院 NMR的非破坏性使得的非破坏性使得NMR谱图可以确定完整谱图可以确定完整生物大分子中某成分的存在和浓度从而与生物大分子中某成分的存在和浓度从而与X-Ray晶晶体衍射互为补充体衍射互为补充.核磁共振成像核磁共振成像 基本原理：基本原理：是将人体置于特殊的磁场中，用无线是将人体置于特殊的磁场中，用无线电射频脉冲激发人体内氢原子核，引起氢原子核电射频脉冲激发人体内氢原子核，引起氢原子核共振，并吸收能量。在停止射频脉冲后，氢原子共振，并吸收能量。在停止射频脉冲后，氢原子核按特定频率发出射电

37、信号，并将吸收的能量释核按特定频率发出射电信号，并将吸收的能量释放出来，被体外的接受器收录，经电子计算机处放出来，被体外的接受器收录，经电子计算机处理获得图像理获得图像.核磁共振测深核磁共振测深核磁共振测深是核磁共振测深是MRI技术在地质勘探领域的技术在地质勘探领域的延伸，通过对地层中水分布信息的探测，可以延伸，通过对地层中水分布信息的探测，可以确定某一地层下是否有地下水存在，地下水位确定某一地层下是否有地下水存在，地下水位的高度、含水层的含水量和孔隙率等地层结构的高度、含水层的含水量和孔隙率等地层结构信息。信息。 优优 缺缺 点点v优点优点：可以在水溶液或：可以在水溶液或有机相中研究生物大分

38、子有机相中研究生物大分子结构，研究溶液条件的改结构，研究溶液条件的改变对生物大分子三维结构变对生物大分子三维结构的影响以及生物大分子内的影响以及生物大分子内部动力学的特点部动力学的特点v缺点缺点：分辨率不高。目：分辨率不高。目前，前，NMR只能用于测定只能用于测定小分子和中型蛋白质的小分子和中型蛋白质的结构结构from：厦门大学生命科学学院：厦门大学生命科学学院NMR法测定蛋白质结构的基本实验步骤法测定蛋白质结构的基本实验步骤:1 、样品制备，一般应采用样品制备，一般应采用液态液态样品样品，CCl4溶解溶解2 、一维一维NMR实验实验3 、二维二维NMR实验实验4、三维三维NMR实验实验5 、

39、有的还要做四维有的还要做四维NMR实验实验vNMR法一般只能解析相对较小的蛋白质，法一般只能解析相对较小的蛋白质，X-射射 线晶体衍射法适用于研究各种大小的蛋白质。线晶体衍射法适用于研究各种大小的蛋白质。v有些蛋白质水溶性很差，却很容易培养成晶体，有些蛋白质水溶性很差，却很容易培养成晶体，另一些蛋白质则水溶性很好，培养成晶体很困难。另一些蛋白质则水溶性很好，培养成晶体很困难。 n X射线晶体衍射技术和核磁共振技术是当前蛋白射线晶体衍射技术和核磁共振技术是当前蛋白质空间结构测定的主要方法，质空间结构测定的主要方法，但它们都存在一些但它们都存在一些不足。不足。n X射线晶体衍射技术射线晶体衍射技术

40、要求蛋白质是晶体存在状态，要求蛋白质是晶体存在状态，而对一些柔性的、结构复杂的生物大分子蛋白质而对一些柔性的、结构复杂的生物大分子蛋白质来说，比较难以得到所需的晶体结构。来说，比较难以得到所需的晶体结构。n 核磁共振技术核磁共振技术能测出溶液状态下分子量较小蛋白能测出溶液状态下分子量较小蛋白质的结构，但对分子量较大的蛋白质的数据处理质的结构，但对分子量较大的蛋白质的数据处理显得比较复杂。显得比较复杂。l因此，因此，下面下面介绍一些其他测定蛋白质结构介绍一些其他测定蛋白质结构的方法的方法：现代光谱技术现代光谱技术三维电镜衍射技术三维电镜衍射技术动力学全精研究技术动力学全精研究技术一、现代光谱技术

41、一、现代光谱技术l除传统的紫外除传统的紫外-可见差光谱法和荧光光可见差光谱法和荧光光谱法外，谱法外，圆二色谱圆二色谱、激光拉曼光谱激光拉曼光谱以以及及质谱质谱也在测定蛋白质溶液构象方面也在测定蛋白质溶液构象方面发挥着重要的作用。发挥着重要的作用。圆二色谱圆二色谱（Circular Dichroism，CD）l 圆二色谱是研究圆二色谱是研究稀溶液稀溶液中蛋白质结构的一种简单中蛋白质结构的一种简单、快速而又较准确的方法。、快速而又较准确的方法。l 圆二色谱是利用不对称分子对圆二色谱是利用不对称分子对左、右圆偏振光左、右圆偏振光吸吸光率的不同来分析蛋白质的结构。光率的不同来分析蛋白质的结构。l 19

42、69年，年，Greenfield用圆二色光谱数据估计了蛋白用圆二色光谱数据估计了蛋白质的二级结构。此后，关于利用圆二色谱研究蛋质的二级结构。此后，关于利用圆二色谱研究蛋白质空间结构的报道逐渐增多。白质空间结构的报道逐渐增多。平面偏振光、圆偏振光和椭圆偏振光平面偏振光、圆偏振光和椭圆偏振光l 平面偏振光平面偏振光：指振动方向在同一平面内的电磁波指振动方向在同一平面内的电磁波。l 圆偏振光圆偏振光：当两束当两束振幅相等振幅相等、互相垂直的互相垂直的偏振光位偏振光位相相差相相差1/4波长波长(90)时，其合成矢量绕光传播方向时，其合成矢量绕光传播方向旋转前进，朝着光源方向观察时，电场矢量旋转前进，朝

43、着光源方向观察时，电场矢量E末端末端轨迹为圆形，所以称之为轨迹为圆形，所以称之为圆偏振光圆偏振光。电场矢量方向。电场矢量方向顺时针方向旋转的称为顺时针方向旋转的称为右圆偏振光右圆偏振光，逆时针方向旋，逆时针方向旋转的则称转的则称左圆偏振光左圆偏振光。l椭圆偏振光椭圆偏振光：振幅不等的左、右圆偏振光合成振幅不等的左、右圆偏振光合成圆二色性和圆二色谱圆二色性和圆二色谱l 圆二色性圆二色性：当左、右圆偏振光进入物质时，光学当左、右圆偏振光进入物质时，光学活性物质分子对它们的吸收不一样，它们的差值活性物质分子对它们的吸收不一样，它们的差值就是圆二色性就是圆二色性光学活性物质分子对左、右圆偏振光的吸收不

44、一光学活性物质分子对左、右圆偏振光的吸收不一样，这种吸收差造成矢量振幅差，从介质出来的样，这种吸收差造成矢量振幅差，从介质出来的光成为椭圆偏振光，用光成为椭圆偏振光，用椭圆度椭圆度或或吸收差吸收差表示表示l 圆二色谱圆二色谱：指指椭圆度椭圆度(或比椭圆度等或比椭圆度等)与与波长波长的关的关系，它在本质上与旋光色散谱是一样的。系，它在本质上与旋光色散谱是一样的。圆二色谱的应用圆二色谱的应用l在分子生物学中，圆二色仪主要应用于测在分子生物学中，圆二色仪主要应用于测定定生物大分子的空间结构生物大分子的空间结构。生物大分子很多是不对称的，即生物大分子很多是不对称的，即光学活性分子光学活性分子，通过圆二

45、色谱测定和计算能够了解生物大分子在通过圆二色谱测定和计算能够了解生物大分子在溶液状态下的二级结构溶液状态下的二级结构。l 蛋白质或多肽是由氨蛋白质或多肽是由氨基酸通过肽键连接而基酸通过肽键连接而成的具有特定结构的成的具有特定结构的生物大分子，主要的生物大分子，主要的光学活性生色基团是光学活性生色基团是肽链骨架中的肽链骨架中的肽键、肽键、芳香氨基酸残基芳香氨基酸残基及及二二硫键硫键，另外，有的蛋，另外，有的蛋白质白质辅基辅基对蛋白质的对蛋白质的圆二色性有影响。圆二色性有影响。肽键的不对称性使得它总有光活性肽键的不对称性使得它总有光活性l 蛋白质的圆二色性主要由活性生色基团及折叠蛋白质的圆二色性主

46、要由活性生色基团及折叠结构两方面圆二色性的总和。根据电子跃迁能级能结构两方面圆二色性的总和。根据电子跃迁能级能量的大小，蛋白质的量的大小，蛋白质的CD光谱分为三个波长范围光谱分为三个波长范围: 1）250nm以下的以下的远紫外光谱区远紫外光谱区，圆二色性主要由肽，圆二色性主要由肽键的键的n*电子跃迁引起；远紫外电子跃迁引起；远紫外CD主要应用于蛋主要应用于蛋白质白质二级结构的解析二级结构的解析 2）250300nm的的近紫外光谱区近紫外光谱区，主要由侧链芳香，主要由侧链芳香基团的基团的*电子跃迁引起；近紫外电子跃迁引起；近紫外CD主要揭示蛋主要揭示蛋白质的白质的三级结构信息三级结构信息 3 3

47、）300300700nm700nm的的紫外紫外- -可见光光谱区可见光光谱区，主要由蛋白，主要由蛋白质辅基等外在生色基团引起。紫外质辅基等外在生色基团引起。紫外- -可见光可见光CDCD主要主要用于用于辅基的偶合分析辅基的偶合分析。 l 肽键肽键是高度有规律排列是高度有规律排列的，其排列的方向性决的，其排列的方向性决定了肽键能级跃迁的分定了肽键能级跃迁的分裂情况。具有不同二级裂情况。具有不同二级结构的蛋白质或多肽所结构的蛋白质或多肽所产生产生CD谱带的位置、谱带的位置、吸收的强弱都不相同。吸收的强弱都不相同。因此，根据所测得蛋白因此，根据所测得蛋白质或多肽的远紫外质或多肽的远紫外CD谱，能反映

48、出蛋白质或谱，能反映出蛋白质或多肽链二级结构的信息多肽链二级结构的信息，从而揭示蛋白质或多，从而揭示蛋白质或多肽的二级结构。肽的二级结构。 -螺旋螺旋结构在靠近结构在靠近192nm有一正的谱带，在有一正的谱带，在222和和208nm处表现出两个负的特征肩峰谱带；处表现出两个负的特征肩峰谱带；-折叠折叠的的CD光谱在光谱在216nm有一负谱带，在有一负谱带，在185200nm有一正谱带；有一正谱带；-转角转角在在206nm附近有一正附近有一正CD谱带，而左手螺旋谱带，而左手螺旋P2结构在相应的位结构在相应的位置有负的置有负的CD谱带，如上图和表所示。谱带，如上图和表所示。 - band(nm)+

49、 band(nm)-螺旋螺旋222，208192-折叠折叠216195-转角转角220-230(弱弱)，180-190（强）（强）205左手螺旋左手螺旋P2结构结构190210-230（弱）（弱）无规则卷曲无规则卷曲200212 CD数据拟合计算蛋白质的二级结构的方法基本原理是假设蛋白质在波长处的CD信号()是蛋白质中或多肽各种二级结构组分及由芳香基团引起的噪音的线性加，()= fi()i + noise。()i是第i个二级结构成分的CD信号值，fi为第i个二级结构成分的含量分数，fi规定值为1；通过已知蛋白（或称参考蛋白）二级结构的圆二色数据库，曲线拟合未知蛋白或多肽的圆二色数据，估算未知蛋

50、白或多肽的二级结构。 蛋白质或多肽的二级结构拟合计算方法中，主要采用多聚氨基酸为参考多肽。Greenfield 等采用多聚L-lys 作参考多肽，建立-螺旋、-折叠及无规卷曲等二级结构参考CD 光谱曲线，采用单一波长法（208nm）计算出-螺旋含量后，然后假设不同的-折叠含量（X）值，并假设CD 值是-螺旋含量(XH)、-折叠含量(X)无规卷曲(XR)三者贡献值的加和，即： XH+X+XR=1 通过计算得到不同波长的()，得出计算曲线。假设一些不同的X值，分别求出它们相应的计算曲线，找出与实验曲线最接近的曲线，相应于该最接近曲线的X及XR即认为是该蛋白质的相应结构含量。 Example fit

51、: myoglobin(肌红蛋白肌红蛋白)l In this case: qt = xaqa + xbqb + xcqcl fits best with xa = 80%, xb= 0%xc = 20% l agrees well with structure 78% helix, 22% coil激光拉曼光谱激光拉曼光谱l激光拉曼光谱法是研究激光拉曼光谱法是研究生物大分子生物大分子结构、结构、动力学及功能的重要手段，它在物理、化动力学及功能的重要手段，它在物理、化学、医学及生物学等领域都有着十分重要学、医学及生物学等领域都有着十分重要的应用价值。的应用价值。l在在蛋白质等结构研究蛋白质等结构

52、研究方面，拉曼光谱分析方面，拉曼光谱分析可以提供大量的信息，促进蛋白质等生物可以提供大量的信息，促进蛋白质等生物大分子研究进展。大分子研究进展。l 1928年，印度物理学家年，印度物理学家拉曼拉曼(Raman)发现了拉曼光谱，同发现了拉曼光谱，同时期的苏联物理学家时期的苏联物理学家兰斯伯格兰斯伯格(G. Landsberg)也独立地发也独立地发现了这一现象。从那时起，拉曼光谱逐渐发展成为一个分现了这一现象。从那时起，拉曼光谱逐渐发展成为一个分析物质结构的有力工具。析物质结构的有力工具。l 然而由于拉曼光谱技术强度很弱，时间较长，测定有色物然而由于拉曼光谱技术强度很弱，时间较长，测定有色物质和发

53、光样品存在困难等缺陷质和发光样品存在困难等缺陷,给其应用带来了很大困难给其应用带来了很大困难,故故在后来很长一段时间内发展比较缓慢，曾一度有被红外光在后来很长一段时间内发展比较缓慢，曾一度有被红外光谱取代的趋势。谱取代的趋势。l 直到直到1960年年激光激光出现以后，由于激光具有高亮度、单色性出现以后，由于激光具有高亮度、单色性和方向性好以及高偏振度等特点，非常适合作为拉曼光谱和方向性好以及高偏振度等特点，非常适合作为拉曼光谱的激发光源，因而迅速为科研工作者所利用。的激发光源，因而迅速为科研工作者所利用。质谱质谱(mass spectrometry，MS)l 自美国科学家自美国科学家John

54、B.Fenn和日本学者和日本学者田中耕一田中耕一(Koichi. Tanaka)发明了对生物大分子进行确认和结构分析的质谱发明了对生物大分子进行确认和结构分析的质谱分析法以来，随着生命科学及生物技术的迅速发展，生物分析法以来，随着生命科学及生物技术的迅速发展，生物质谱目前已成为有机质谱中最活跃、最富生命力的前沿研质谱目前已成为有机质谱中最活跃、最富生命力的前沿研究领域之一。究领域之一。l 生物质谱的发展使人类生物质谱的发展使人类基因组计划基因组计划及其及其后基因组计划后基因组计划得以得以提前完成，对其实施也起着重要的推动作用。提前完成，对其实施也起着重要的推动作用。l 质谱分析法在研究质谱分析

55、法在研究生物大分子生物大分子特别是蛋白质方面已发展成特别是蛋白质方面已发展成为主要的技术手段之一，在蛋白质结构的研究中占据着十为主要的技术手段之一，在蛋白质结构的研究中占据着十分重要的地位。分重要的地位。质谱分析基本原理质谱分析基本原理l 质谱分析是将样品转化为运动的气态带电离子，质谱分析是将样品转化为运动的气态带电离子，于磁场中按质荷比于磁场中按质荷比(m/z)大小分离并记录的分析方大小分离并记录的分析方法。法。l 其过程可简单描述为：其过程可简单描述为： 离子源轰击样品离子源轰击样品带电荷的碎片离子带电荷的碎片离子电场加速电场加速(zeU)获得动能获得动能(mv2)磁场分离磁场分离检测器记

56、录检测器记录 其中，其中，z为电荷数，为电荷数，e为电子电荷，为电子电荷，U为加速电压，为加速电压，m为碎为碎片质量，片质量，v为电子运动速度。为电子运动速度。质谱分析质谱分析(MS)的特点的特点l MS用于生物大分子的研究具有以下优点用于生物大分子的研究具有以下优点:高灵敏度高灵敏度易操作性易操作性准确性准确性快速性快速性很好的普适性很好的普适性 高灵敏度高灵敏度能为亚微克级试样提供信息，可以有效地与色谱能为亚微克级试样提供信息，可以有效地与色谱联用，适用于复杂体系中联用，适用于复杂体系中痕量物质痕量物质的鉴定或结构测定。的鉴定或结构测定。质谱分析的方法质谱分析的方法l 近年来出现的较成功地

57、用于生物大分子质谱分析近年来出现的较成功地用于生物大分子质谱分析的软电离技术主要有下列几种：的软电离技术主要有下列几种：电喷雾电离质谱电喷雾电离质谱基质辅助激光解吸电离质谱基质辅助激光解吸电离质谱快原子轰击质谱快原子轰击质谱 离子喷雾电离质谱离子喷雾电离质谱 大气压电离质谱大气压电离质谱在这些技术中，以前面三种近年来研究得最多，在这些技术中，以前面三种近年来研究得最多，应用得也最广泛。应用得也最广泛。蛋白质的质谱分析蛋白质的质谱分析l 质谱分析目前主要测定质谱分析目前主要测定一级结构一级结构，包括分子量、，包括分子量、肽链氨基酸排序及多肽或二硫键数目和位置。肽肽链氨基酸排序及多肽或二硫键数目和

58、位置。肽和蛋白的质谱测序具有速度快、用量少、易操作和蛋白的质谱测序具有速度快、用量少、易操作等优点，使它非常适合现代科研工作的要求。等优点，使它非常适合现代科研工作的要求。l 蛋白质质谱分析蛋白质质谱分析原理原理为：通过为：通过电离源电离源将蛋白质分将蛋白质分子转化为子转化为气相离子气相离子,然后利用质谱分析仪的然后利用质谱分析仪的电场电场、磁场磁场将具有特定质量与电荷比值将具有特定质量与电荷比值(M/Z值值)的的蛋白质蛋白质离子离子分离开来分离开来,经过离子检测器收集分离的离子经过离子检测器收集分离的离子,确定离子的确定离子的M/Z值值，分析鉴定未知蛋白质。，分析鉴定未知蛋白质。蛋白质的质谱

59、分析方法蛋白质的质谱分析方法l MS用于多肽和蛋白质测序可分为三种方法：用于多肽和蛋白质测序可分为三种方法：第一种方法称为第一种方法称为蛋白图谱蛋白图谱(protein mapping),它它是使用特异性的是使用特异性的酶解酶解或或化学水解化学水解的方法将的方法将蛋白蛋白切切成小的片段，然后用质谱检测各产物肽的分子量成小的片段，然后用质谱检测各产物肽的分子量,将所得肽谱数据输入数据库将所得肽谱数据输入数据库,搜索与之相对应的已搜索与之相对应的已知蛋白知蛋白,从而获取待测蛋白序列；从而获取待测蛋白序列；l 第二种方法是利用待测分子在电离及飞行过程中第二种方法是利用待测分子在电离及飞行过程中产生的

60、亚稳离子，通过分析相邻同组类型峰的质产生的亚稳离子，通过分析相邻同组类型峰的质量差，识别相应的量差，识别相应的氨基酸残基氨基酸残基；l 第三种方法称为第三种方法称为梯状测序梯状测序(ladder sequencing)，是用化学探针或酶解使蛋白或肽从端或端逐是用化学探针或酶解使蛋白或肽从端或端逐一降解下氨基酸残基，形成相互间差一个氨基酸一降解下氨基酸残基，形成相互间差一个氨基酸残基的残基的系列肽系列肽，再经质谱检测，由相邻峰的质量，再经质谱检测，由相邻峰的质量差可知相应氨基酸残基。差可知相应氨基酸残基。质谱中主要出现的离子有四种，即质谱中主要出现的离子有四种，即分子离分子离子、碎片离子、同位素