第一章 药物分离纯化技术 绪论

1、第一章第一章 绪论绪论主要内容主要内容一、药物分离纯化技术的研究内容及 重要性 二、分离纯化的原理与方法三、分离纯化方法选择的标准及其评价第一节 药物分离纯化技术的研究内容及重要性 一、分离纯化的研究内容和意义1、分离纯化过程： 通过物理、化学或生物等手段，或将这些方法结合起来，把某混合物分离纯化成几个组成彼此不同的产物的过程。 2、分离纯化技术：（1）定义：在工业中通过适当的技术手段与装备，耗费一定的能量来实现混合物的分离过程，研究实现这一分离纯化过程的科学技术称为分离纯化技术。（2）研究内容： 分离纯化方法的选择和优化 新型分离设备的研制开发 3、分离纯化的意义：（1）分离纯化技术在工业、

2、农业、医药、食品等生产过程中具有重要作用，与人们的生活息息相关。（2）分离技术与其他学科相互促进、共同发展。（3）分离纯化技术在环境污染的治理过程中发挥着重大作用。二、药物分离纯化的重要性1、天然产物中的活性成分、化学药物和生物产品中的有效成分都需要采用适当的分离纯化技术来获得。2、在制药工业中，分离过程的装备和能量消耗占主要地位。3、制药工业中产生的“三废”（废气、废水、废渣）需要分离纯化技术加以处理，才能达到国家对“三废”的排放要求。第二节 分离纯化的原理与方法一、分离纯化的原理1、分离纯化系统的组成分离纯化装置产物原料分离剂2、药物分离的特点： （1）根据不同药品种类和来源，采用的分离技

3、术原理和方法也不同。 （2）分离过程需要多种方法联合使用，使有效成分的含量不断提高。 （3）采用适当的分离方法和条件，以保证产品的稳定性。 （4）从药品研究到药品生产，分离在量上的差别很大，小到含量为10 g级，用以鉴定，大到生产的吨级纯化。 （5）药品的质量必须达到国家的标准，生产环境需要达到一定的洁净度，防止环境对产品的污染。-6二、分离纯化方法的分类：1、按分离纯化过程中初始相与第二相的状态进行分类。P4表1-22、按分离过程的原理分类：（1）机械分离：P4表1-3（2）传质分离： a.平衡分离过程 b.速率分离过程 P4表1-4第三节 分离纯化方法选择的标准及其评价一、分离纯化方法选择

4、的标准 P5表1-5二、分离纯化方法的评价 常用的评价分离纯化方法的指标有：回收率、分离因子、富集倍数、准确性和重现性1、回收率：（R） R=Q/Q 100%02、分离因子： 表示两种组分分离的程度。 S = =RBAA , BRQ / QABQ / Q0 , A0 , B （8）人参皂苷Rh2抑制肿瘤作用： Rh2是人参中的稀有皂苷，它可由人参二醇类皂苷经酶法改变其皂苷糖基而生成，由苷元人参二醇和一分子葡萄糖组成。 人参皂苷Rh2体外对小鼠黑色素瘤B16细胞的分化诱导作用。 黑色素瘤细胞是一种常用的分化诱导实验模型，具有独特的优点，黑色素生成能力增加，克隆形成能力降低以及形态改变作为分化标记

5、。夏丽娟等人研究了Rh2对B16细胞的分化诱导作用机理：a.Rh2对B16细胞有较强的分化诱导作用，表现为：形态向正常上皮样细胞分化；细胞呈网状结构；黑色素颗粒增加，黑色素生成能力明显增加；生长变缓慢。作用机理：络氨酸是黑色素合成的限速酶，控制黑色素的合成。细胞动力学表明，人参皂苷Rh2使B16细胞阻断在G1期。药物作用后G1期细胞明显增多，而S期细胞明显减少，说明Rh2可诱导B16细胞向正常色素细胞分化。 b.Rh2对B16移植性肿瘤具有诱导再分化作用：文献报道：Rh2对诱发性小鼠肿瘤有明显的抑制作用，其潜伏时间、荷瘤数、荷瘤体积均与对照组有显著差异，动物口服的外观情况、进食、活动力均好于对

6、照组，存活时间显著长于对照组，R和的抑瘤作用与其浓度呈明显的量效关系。作用机理：Rh2可使B16细胞阻断在G1期和S期，使G2期、M期细胞数减少，细胞周期变化显著，细胞核缩小，胞浆体积肿大，显示Rh2具有诱导分化作用，说明在肿瘤的术前和术后应用Rh2，可以提高和巩固治疗效果。 c. Rh2对B16细胞的高转移株B16-B26细胞的抗肿瘤侵袭作用，Rh2能明显的抑制癌细胞的侵袭和转移，这在防止肿瘤转移方面的应用有积极意义。 d.Rh2可以拮抗化学抗癌药物的毒副作用：Rh2对用环磷酰胺诱发的小鼠外周血液中白细胞减少有显著的升高作用，表明Rh2可以拮抗化学抗癌药物的毒副作用，在化疗的同时使用Rh2，

7、可以增强化疗效果。Rh2对C6胶质瘤细胞的增殖抑制和诱导凋亡作用. 李殿友等人用流式细胞术探讨了Rh2对C6胶质瘤细胞的作用：A.Rh2在浓度为2umol/L,8umol/L时对C6胶质瘤有增殖抑制作用，且呈明显的量效关系，在实验剂量范围内没有明显的细胞毒性。B.Rh2作用72h后，浓度为4umol/L时对C6胶质瘤诱导凋亡作用最为明显。d. Rh2作用后，G0/G1期细胞百分率明显下降，而S期细胞百分率显著增加。e. 通过流式细胞仪检测到由于核小体间DNA断裂形成的凋亡峰表明Rh2在一定浓度范围内通过诱导细胞凋亡而非细胞毒作用。 人参皂苷Rh2诱导人肝癌细胞SK-HEP-1的细胞凋亡研究：

8、Rh2通过与细胞周期蛋白A激酶复合物有关的P21 WAFI/CIPI，分解蛋白的分裂方式导致SK-HEP1细胞凋亡。 P21 WAFI/CIPI的蛋白酶解的切断对于细胞周期蛋白A/cdk2活性的正向调节及Rh2诱导的细胞凋亡的完成都是一个必要的过程。 Rh2在体外和裸鼠实验中对人卵巢癌细胞（HRA）的生长抑制作用。 日本学者研究发现，Rh2在体外浓度为1060umol/L时能够抑制人卵巢癌细胞的增殖，且有明显的量效关系。 每日口服Rh2时， 与CDDP（顺铂）治疗相比，肿瘤生长被明显抑制，生存时间明显延长。 Rh2分子作用机制研究： 未纯化的Rh2在体外培养的Morris肝癌细胞中诱发表型地转

9、录，而且扣留人肝癌细胞的细胞周期，通过蛋白水解caspase-3的底物（ADP-核糖）多聚酶，激活caspase-3诱发人肝癌细胞SK-HEP-1细胞的凋亡； 纯化的Rh2在G1期和S期抑制B16黑色素瘤细胞的细胞周期过程，激发黑色素生成，诱发不能转录的表型的表达； Rh2抑制了人类血液中淋巴细胞的姊妹染色体交换的形成； 人参皂苷的混合在体外能增加NDA多聚酶的活性。Cdk2是细胞周期过程中G1期和S期的中重要激酶。日本学者的研究发现Rh2抑制了在G1期扣留的B16黑色素瘤细胞的Cdk2的活性，而对S期扣留的细胞没有抑制作用。一般认为，Rh2对肿瘤细胞具有生长抑制作用。该作用是通过诱导分化和引

10、起细胞凋亡实现的。（9）人参皂苷对兴奋毒损伤的保护作用。 人参皂苷对谷氨酸（Glu）兴奋毒引起神经细胞损伤的保护作用： Glu对神经细胞的毒性作用：Glu是中枢兴奋性氨基酸递质，它与神经细胞的作用过程为，正常情况下，Giu与突触后膜NMDA（N-甲基-D-门冬氨酸）受体结合，引起Ca+内流，然后通过神经末梢质膜上的摄取系统，从突触间隙内摄取释放Glu，也可通过Ca+、Na+、K+-ATP酶转运系统试Ca+从细胞内流出，终止Glu作用。过量的Glu促使突触前过量的蛋白激酶C（PKC）向细胞膜转移并活化，从而过度激活突触后膜的Glu受体-NMD受体，促使Ca+内流。细胞内Ca+浓度上升又激活细胞内

11、的硫蛋白酶，引起细胞内骨架蛋白-fordrin降解，使膜上Giu结合位点数量明显增加，导致胞内Ca+超载，出现迟发型损害。 b.人参皂苷的保护作用：神经节苷酯可以防护PKC与膜的结合于活化，从而阻断过量PKC反应。人参皂苷可使原代培养的神经细胞的神经节苷酯含量大约增加1.5倍，从而可对兴奋毒引起的神经细胞损伤起到保护作用。通过减低神经细胞Ca+浓度，使细胞内Ca+积聚，浓度上升，引起神经元损伤、死亡。人参皂苷与神经细胞温育10min后，可选择性地降低胞内Ca+浓度，可能是因为人参皂苷能特异性地抑制Glu被摄取进入大脑突触体中，相应减少过量Glu的兴奋毒损伤作用。（10）人参皂苷对乙酸铅胚胎发育

12、毒性的拮抗作用（自学）（11）人参皂苷对脐血细胞凋亡的抑制作用（自学） （12）人参皂苷的免疫增强作用： 人参皂苷促进NK细胞活性的可能机理： GS直接作用于NK细胞；通过诱生IFN-r间接增强NK细胞活性；通过诱生IL-2间接增强NK细胞活性。 另外，杨中辉等人应用外源ACTH（促肾上腺皮激素）诱发Swiss小鼠肾上腺皮质酮分泌的增加，同时也导致小鼠NK细胞的活性。T细胞转化活性的抑制，这种抑制与皮层酮升高水平呈正相关性。应用GS可以抑制外源ACTH所致的肾上腺皮质分泌的增加，促进NK细胞及T细胞活性恢复。表明人参皂苷可以通过调整垂体（ACTH）肾上腺（皮质酮）轴的活动参与机体免疫功能的调节

13、。（13）TSPG对人早期造血生长因子IL-3基因表达的影响： 研究方法：采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR），核酸分子原位杂交法。 实验结果： a.未经诱导的人T淋巴细胞株Jurkat细胞RNA提取物的RFPCR扩增产物只能够未见IL-3条带，而经TSPG诱导后则产生IL-3条带。 b.经TSPG诱导的胎儿胸腺细胞，脾细胞IL-3mRNA表达的阳性率及阳性强度均较对照组明显提高。TSPG能诱导人淋巴细胞表达IL-3mRNA，从而促进早期血细胞发生。 3、开发与利用：（1）人参稀有皂苷的研究开发： 稀有人参皂苷包括人参皂苷Rh2、Rh1、Rh3、和Rg5等，它们只存在于红参和野山参中。 它们具有很高的生理活性，但在人参中的含量只有十万分之几，因此从人参中直接提取不符合实际。一般用酶法通过改变人参中二醇类皂苷的糖基，使之定向转化为人参稀有皂苷。（2）人参皂苷的人工合成： 对人参皂苷的全合成石非常困难的，目前还没有相关报道。 国外有报道对Rh2用不同方法进行半合成，另外，对已阐明活性和结构的人参皂苷进行结构修饰语改造，以获得活性更强的化合物，同时可以改善人参皂苷的某些性质，增加其生物利用度 （3）发展趋势（自学）二、红景天苷地下块根及根茎入药，