mRNA差别显示技术

1、生工生工1班班杨金鑫杨金鑫主要内容主要内容 概述概述 定义及原理定义及原理 应用及优缺点应用及优缺点 展望展望 高等生物大约有高等生物大约有35 35 万万个不同的基因，在每一个正常的个不同的基因，在每一个正常的体细胞中都含有相同的基因组拷贝，但在不同的组织细胞体细胞中都含有相同的基因组拷贝，但在不同的组织细胞中仅有中仅有10%20%10%20%的少部分基因被的少部分基因被，这种选择性表，这种选择性表达是在发育过程中细胞分化的根本原因，是调控细胞生命达是在发育过程中细胞分化的根本原因，是调控细胞生命活动过程的核心机制。因此，比较不同组织之间，或相同活动过程的核心机制。因此，比较不同组织之间，或

2、相同组织在不同生理条件下，或胚胎在不同的发育阶段的组织在不同生理条件下，或胚胎在不同的发育阶段的基因基因表达差异表达差异，可分离并克隆出这些特异性表达的基因。近年，可分离并克隆出这些特异性表达的基因。近年来，该领域的研究取得了很大进展，来，该领域的研究取得了很大进展， 扣除杂交扣除杂交（subtractive hybridization, SHsubtractive hybridization, SH）、）、基因芯片技术基因芯片技术（DNA chip techniqueDNA chip technique）、）、基因表达的系统分析基因表达的系统分析(serial (serial analysi

3、s of gene expression, SAGE)analysis of gene expression, SAGE)、噬菌体全套抗体噬菌体全套抗体库技术库技术(phage display antibody repertoire library (phage display antibody repertoire library technique)technique)和和双向电泳技术双向电泳技术(two-dimensional gel (two-dimensional gel electrophoresis)electrophoresis)先后成功地建立。先后成功地建立。一一. 概述概述

4、 基因表达调控的一种方基因表达调控的一种方式。指在对信号或诱导物做式。指在对信号或诱导物做出应答时，选择出应答时，选择表达不同的表达不同的基因基因，或使，或使基因的表达水平基因的表达水平有所不同。有所不同。DD的发明及其基础的发明及其基础 由由LiangLiang于于19921992年创立年创立 是是分离差异表达基因分离差异表达基因强有力的工具强有力的工具 在随后几年里，在随后几年里， LiangLiang等在技术方面做等在技术方面做了大量改进，使技术更适用、更简便了大量改进，使技术更适用、更简便 基于基于RT-PCRRT-PCR理论，依赖于理论，依赖于3 3种种技术技术 1 1）RT-PCR

5、RT-PCR技术技术 2 2）以特定引物进行的）以特定引物进行的PCRPCR技术技术 3 3）DNADNA电泳技术电泳技术 二二.基本概念基本概念 mRNAmRNA差别显示技术也称为差别显示技术也称为差示反差示反转录转录PCRPCR（Differential Display of Differential Display of reverse Transcriptional PCRreverse Transcriptional PCR）简）简称为称为ddRT-PCRddRT-PCR。它是将。它是将mRNAmRNA反转录技反转录技术术与与PCRPCR技术技术二者相互结合发展起来二者相互结合发展起

6、来的一种的一种RNARNA指纹图谱技术指纹图谱技术。目前已广。目前已广泛应用于分离鉴定组织特异性表达的泛应用于分离鉴定组织特异性表达的基因。基因。 反转录反转录PCRPCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reverse Transcription-Polymerase Chain ReactionReaction，RT-PCRRT-PCR）又称为）又称为逆转录逆转录PCRPCR。其原理是：提取组织。其原理是：提取组织或细胞中的总或细胞中的总RNARNA，以其中的，以其中的mRNAmRNA作为模板作为模板，采用，采用Oligo(dT)Oligo(d

7、T)或随机引物利用逆转录酶反转录成或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNAcDNA。再以。再以cDNAcDNA为模板进为模板进行行PCRPCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCRRT-PCR使使RNARNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNARNA样品分样品分析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成目的基因、合成cDNAcDNA探针、构建探针、构建RNARNA高效转录系统。高效转录系统。 RT- PCRRT- PC

8、R（Reverse Transcription-Polymerase Chain ReactionReverse Transcription-Polymerase Chain Reaction）即）即逆转录逆转录PCRPCR，是将，是将RNARNA的逆转录（的逆转录（RTRT）和）和cDNAcDNA的聚合酶链式扩的聚合酶链式扩增反应（增反应（PCRPCR）相结合的技术。）相结合的技术。RT-PCRRT-PCR技术灵敏而且用途广泛技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞，可用于检测细胞/ /组织中基因表达水平，细胞中组织中基因表达水平，细胞中RNARNA病毒的病毒的含量和直接克隆特定基因的含量和直接

9、克隆特定基因的cDNAcDNA序列等。序列等。 反转录反转录PCRRNARNA指纹指纹 RNA RNA 首先在逆首先在逆转录酶的作用下使转录酶的作用下使RNA RNA 逆转录为逆转录为DNADNA，之后以其之后以其DNA DNA 为模板，为模板，通过以通过以技术技术建立建立进行分进行分析。析。 某些某些DNADNA序列的差异序列的差异可通过可通过限制性酶切片段限制性酶切片段长长度的改变反映出来，此即度的改变反映出来，此即限制性片段长度多态性限制性片段长度多态性。其主要原因是由。其主要原因是由于于DNADNA序列个别碱基的突序列个别碱基的突变而引起某个限制性内切变而引起某个限制性内切酶识别位点的

10、获得或丢失，酶识别位点的获得或丢失，表现为不同长度的酶切片表现为不同长度的酶切片段段水稻品种水稻品种DNADNA指纹指纹基本原理基本原理 利用所有真核基因的利用所有真核基因的mRNA mRNA 的的33端都有一段端都有一段多聚多聚腺苷酸腺苷酸poly(A)poly(A)尾结构的特点，将不同来源的总尾结构的特点，将不同来源的总mRNAmRNA反反转录合成转录合成cDNAcDNA, ,此此cDNA cDNA 合成是采用合成是采用oligo(dT)12MN oligo(dT)12MN 为为引物，其中引物，其中M M为为A,C,GA,C,G中的任意一种，中的任意一种，N N为为A,C,G A,C,G

11、或或T T 中中的任意一种，共有的任意一种，共有12 12 种种，其中，其中可增大引物的可增大引物的TmTm值，值，对，对反转录进行分类。用这反转录进行分类。用这12 12 种引物分别对同一总种引物分别对同一总mRNA mRNA 样品样品，即进行，即进行12 12 次不同的反转录反应次不同的反转录反应，得到，得到1212种类型的种类型的cDNAcDNA，从而也将总，从而也将总mRNAmRNA分为分为12 12 个亚个亚群。在此基础上对每一类群。在此基础上对每一类cDNAcDNA进行随机引物和相应的进行随机引物和相应的反转录引物反转录引物，由于扩增的，由于扩增的cDNAcDNA片段被放射性同片段

12、被放射性同位素标记，因而利用位素标记，因而利用放射自显影技术放射自显影技术通过对不同组织通过对不同组织样品的同一类样品的同一类cDNA cDNA 的的PCR PCR 选择性扩增产物进行选择性扩增产物进行凝胶电凝胶电泳分析泳分析，从而，从而反映出不同样品间基因的时间和空间上反映出不同样品间基因的时间和空间上的组织特异性的表达。的组织特异性的表达。 基本原理是，几乎所有的真核基因基本原理是，几乎所有的真核基因mRNAmRNA分子的分子的3-3-末端，末端，都带有一个多聚的腺苷酸结构，即通常所说的都带有一个多聚的腺苷酸结构，即通常所说的poly(A)poly(A)尾巴尾巴。因此，在因此，在RNARN

13、A聚合酶的作用下，可按聚合酶的作用下，可按mRNAmRNA为模板，以为模板，以oligo(dT)oligo(dT)为引物合成出为引物合成出cDNAcDNA拷贝拷贝。根据。根据mRNAmRNA分子分子3-3-末端末端序列末端结构的分析可以看到，在这段序列末端结构的分析可以看到，在这段poly(A)poly(A)序列起点碱序列起点碱基之前的一个碱基，除了为基之前的一个碱基，除了为A A的情况之外，只能有的情况之外，只能有C C、G G、T T三三种可能。根据这种序列结构特征，种可能。根据这种序列结构特征，P. PengP. Peng等人设计合成三等人设计合成三种不同的种不同的下游引物下游引物，它由

14、，它由1111个或个或1212个连续的脱氧核苷酸加上个连续的脱氧核苷酸加上一个一个3-3-末端锚定脱氧核苷酸组成，用末端锚定脱氧核苷酸组成，用5-T11G5-T11G、5-T11C5-T11C、5-T11A5-T11A表示，这样每一种此类人工合成的寡核苷酸引物都表示，这样每一种此类人工合成的寡核苷酸引物都将能够把总将能够把总mRNAmRNA群体的群体的1/31/3分子反转录成分子反转录成mRNA-cDNAmRNA-cDNA杂交分子。杂交分子。于是，采用这三种引物，可以将整个于是，采用这三种引物，可以将整个mRNAmRNA群体在群体在cDNAcDNA水平上水平上分成三个亚群体。然后用一个分成三个

15、亚群体。然后用一个上游的随机引物上游的随机引物和与反转录时和与反转录时相同的相同的oligo(dT)oligo(dT)引物对这个亚群体进行扩引物对这个亚群体进行扩增，因为这个上游的引物将随机结合在增，因为这个上游的引物将随机结合在cDNAcDNA上上 , ,因此因此来自不来自不同的扩增产物的大小是不同同的扩增产物的大小是不同的，可以在测序胶上明的，可以在测序胶上明显分辨开来，从而筛选出不同样品间基因差异表达的显分辨开来，从而筛选出不同样品间基因差异表达的DNADNA片片段。段。5 MNAAAAAAAAAAAA(A)n 3 Poly(A) RNA5 T12MN 3锚定引物锚定引物逆转录逆转录5

16、MNAAAAAAAAAAAA(A)n 33M N TTTTTTTTTTTT 5变性变性5 MNAAAAAAAAAAAA(A)n 33M N TTTTTTTTTTTT 5退火退火5 T12MN 3锚定引物锚定引物寡核苷酸随机引物寡核苷酸随机引物3M N TTTTTTTTTTTT 5延长延长dNTP、Taq聚合酶聚合酶3M N TTTTTTTTTTTT 55MNAAAAAAAAAAA 3变性、退火、延伸变性、退火、延伸电泳电泳显示显示T12MN(M为为A、G、C，N为为A、T、G、C) 启动启动cDNA第一链合成第一链合成不同长度的不同长度的PCR产物产物回收差异条带，再扩增，回收差异条带，再扩增

17、，克隆测序，同源比对克隆测序，同源比对随机结合到随机结合到cDNA链上链上(1) 提取总提取总RNA，在这个步骤中注意不能有，在这个步骤中注意不能有DNA污染，一般用无污染，一般用无RNA酶酶的的DNA酶在酶在37下处理下处理30 min；(2)在逆转录酶作用下，以在逆转录酶作用下，以Oligo T11MN 为引物为引物(M为为G、A、C中的任一中的任一种，种，N为为A、C、G、T任一种任一种)，进行逆转录；，进行逆转录；(3)PCR反应，扩增反应，扩增cDNA的第一条链；的第一条链；(4)扩增后的扩增后的cDNA进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，使差异表达的进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，使差异表达的cDNA

18、片段片段在在6%测序胶上分开；测序胶上分开；(5)找出不同处理间差异显示的条带，从胶上切割下来，并回收，再进找出不同处理间差异显示的条带，从胶上切割下来，并回收，再进行第二次扩增；行第二次扩增；(6)克隆差异片段，差异片段可作为探针；克隆差异片段，差异片段可作为探针；(7)Northern 杂交，验证目的片段，去掉假阳性片段；杂交，验证目的片段，去掉假阳性片段；(8)对目的片段进行测序；对目的片段进行测序；(9)以克隆的目的片段为探针，从基因组文库中筛选出相应的全长基因。以克隆的目的片段为探针，从基因组文库中筛选出相应的全长基因。技术一般步骤技术一般步骤mRNAmRNA差异显示技术简略流程图差

19、异显示技术简略流程图 放射性自显影法与普通照相的曝光、显影、定影放射性自显影法与普通照相的曝光、显影、定影原理相似，此法是原理相似，此法是利用放射性同位素所放出之射线使利用放射性同位素所放出之射线使照相乳胶照相乳胶“感光感光”，再经显影和定影处理，将乳胶中再经显影和定影处理，将乳胶中因受辐照而致敏的卤化银颗粒还原成金属银，洗去未因受辐照而致敏的卤化银颗粒还原成金属银，洗去未“感光感光”的卤化银后则图像自然显示出来。图像中任的卤化银后则图像自然显示出来。图像中任何区域的黑度取决于留存的金属银的量，它反映了射何区域的黑度取决于留存的金属银的量，它反映了射线在这个区域所沉积的能量。线在这个区域所沉积

20、的能量。记录、检查和测量整体记录、检查和测量整体和组织、细胞和亚细胞水平中放射性示踪物的分布、和组织、细胞和亚细胞水平中放射性示踪物的分布、进行定性和半定量测定进行定性和半定量测定，称为放射自显影法。，称为放射自显影法。 DDDD的优点的优点 以以RT-PCRRT-PCR和和DNADNA凝胶电泳凝胶电泳为基础为基础 灵敏度高灵敏度高，仅需，仅需0.2g0.2g的总的总RNARNA 因为从两种或更多的特定组织样品来源的扩增产物因为从两种或更多的特定组织样品来源的扩增产物在同一块胶上鉴定，因此能用于鉴定特定组织或细在同一块胶上鉴定，因此能用于鉴定特定组织或细胞来源样品之间转录水平的胞来源样品之间转

21、录水平的mRNAmRNA的的定性和定量变化定性和定量变化 可以同时检测到可以同时检测到“上调上调”及及“下调下调”的基因的基因 时间短时间短，实验过程中可步步验证比较，实验过程中可步步验证比较 可进行可进行多基因家族的表达分析多基因家族的表达分析 DDDD的缺的缺点点 每每种技术的诞生都不可能是完美的，种技术的诞生都不可能是完美的，mRNAmRNA差异显示技术差异显示技术虽然从创立时起就很受欢迎，但是许多研究者发现该技术存虽然从创立时起就很受欢迎，但是许多研究者发现该技术存在一定缺陷，其中三点较为突出：在一定缺陷，其中三点较为突出：第一第一，操作步骤多，外源，操作步骤多，外源DNADNA污染严

22、重而导致污染严重而导致假阳性率高假阳性率高，即差异片断用即差异片断用NorthernNorthern杂交时无阳性信号，杂交时无阳性信号，重复稳定性较差重复稳定性较差。据研究，这种假阳性率可高达据研究，这种假阳性率可高达7070第二第二，获得的，获得的差异条带短小差异条带短小，多为，多为300bp300bp左右，并且多为左右，并且多为33端非编码区序列（端非编码区序列（UTRUTR），难以直接判断其功能和意义。），难以直接判断其功能和意义。第三第三，必须采用放射性同位素标记反应，使得，必须采用放射性同位素标记反应，使得实验周期长、实验周期长、成本高、易造成同位素污染成本高、易造成同位素污染，且不

23、好回收差异片断。，且不好回收差异片断。（）用无酶的酶处理总，防）用无酶的酶处理总，防止污染。止污染。（）使用酶时，批号应相同，不要经常调（）使用酶时，批号应相同，不要经常调换。换。（）循环次数减至次，提高退火温度，（）循环次数减至次，提高退火温度，减少非特异性条带。减少非特异性条带。（）把从测序胶上切下来的条带纯化后分成两部（）把从测序胶上切下来的条带纯化后分成两部分，一部分用于克隆，另一部分用作探针杂交以筛分，一部分用于克隆，另一部分用作探针杂交以筛选克隆。选克隆。（）改变引物长度，如有的在（）改变引物长度，如有的在端锚定引物和端锚定引物和端各加上个碱基，带上双酶切位点，端各加上个碱基，带上

24、双酶切位点，如此可显著提高重复性如此可显著提高重复性改进方法改进方法三三.mRNA.mRNA差异显示技术的实际应用差异显示技术的实际应用 mRNA mRNA差异显示技术现在已经成功运用于差异显示技术现在已经成功运用于动物的胚动物的胚胎发育胎发育、组织分化组织分化、生长因子激活与抑制生长因子激活与抑制、细胞周期细胞周期控制控制、癌变及疾病相关基因的鉴定和克隆癌变及疾病相关基因的鉴定和克隆，在植物无，在植物无性繁殖、形态发生、次生代谢、抗逆抗病等方面被用性繁殖、形态发生、次生代谢、抗逆抗病等方面被用来进行基因的鉴定、克隆以及功能研究，并取得很好来进行基因的鉴定、克隆以及功能研究，并取得很好的结果。

25、概括起来其主要用途可以归纳为以下三点：的结果。概括起来其主要用途可以归纳为以下三点： 第一第一，寻找差异表达的基因。，寻找差异表达的基因。 第二第二，研究个体、种群或品种间转录水平上的遗传变，研究个体、种群或品种间转录水平上的遗传变异。异。 第三第三，鉴定经济动物中控制重要数量经济性状位点的，鉴定经济动物中控制重要数量经济性状位点的基因。基因。基因的鉴定与克隆基因的鉴定与克隆 差异显示技术目前已成为鉴定和克隆基因的重要方法。差异显示技术目前已成为鉴定和克隆基因的重要方法。等利用一对近等基因系，研究了西红柿基因组特异区。这对近等等利用一对近等基因系，研究了西红柿基因组特异区。这对近等基因系中有一

26、个含有抗烟草花叶病毒（）抗性基因，一基因系中有一个含有抗烟草花叶病毒（）抗性基因，一个不含。这两个近等基因系有一个差异片段，克隆后经个不含。这两个近等基因系有一个差异片段，克隆后经杂交证实是阳性克隆，并且发现，这个片段与抗性有密切关系。杂交证实是阳性克隆，并且发现，这个片段与抗性有密切关系。利用修饰的差异显示法克隆了小麦基因族的个公认的基因，利用修饰的差异显示法克隆了小麦基因族的个公认的基因，他认为差异显示法在很短时间内就可以克隆基因。和他认为差异显示法在很短时间内就可以克隆基因。和克隆了水稻的赤霉素调控基因，利用赤霉素处理水稻，一个诱导，一个克隆了水稻的赤霉素调控基因，利用赤霉素处理水稻，一

27、个诱导，一个不诱导，发现二者在差异显示时，表达量相差倍，因而很容不诱导，发现二者在差异显示时，表达量相差倍，因而很容易克隆了一个赤霉素调控基因。和利用差异显示易克隆了一个赤霉素调控基因。和利用差异显示法，分析了拟南芥对臭氧的反应。拟南芥用臭氧处理后，在根和成熟花中，法，分析了拟南芥对臭氧的反应。拟南芥用臭氧处理后，在根和成熟花中，臭氧诱导的转录物含量极高，是叶的倍。臭氧诱导的转录物含量极高，是叶的倍。序列分析证明，编码一个蛋白多肽，其序列序列分析证明，编码一个蛋白多肽，其序列与已知的蛋白序列基本一致，充分表明差异显示方法是克隆基因的有效方与已知的蛋白序列基本一致，充分表明差异显示方法是克隆基因

28、的有效方法。赵大中等比较春化过和不春化的小麦，发现春化的小麦有一个法。赵大中等比较春化过和不春化的小麦，发现春化的小麦有一个与春化相关的克隆，经杂交和同源性分析，证与春化相关的克隆，经杂交和同源性分析，证明是春化特异克隆片段，该克隆片段的基因对春化需求型植物明是春化特异克隆片段，该克隆片段的基因对春化需求型植物的成花诱导起重要作用。的成花诱导起重要作用。研究激素对植物发育的影响研究激素对植物发育的影响 在植物的发育过程中，激素自始至终起着作用，调控在植物的发育过程中，激素自始至终起着作用，调控着植物的器官形成、生长发育。研究其作用具有重要意义着植物的器官形成、生长发育。研究其作用具有重要意义。

29、Peters等发现，用玉米素处理红叶藜的细胞时，等发现，用玉米素处理红叶藜的细胞时，mRNA表达量迅速增加，从而使细胞分裂加快。表达量迅速增加，从而使细胞分裂加快。Chen等发现，用等发现，用赤霉素处理水稻幼苗，然后采用赤霉素处理水稻幼苗，然后采用mRNA差异显示技术，处差异显示技术，处理过的幼苗中理过的幼苗中mRNA有特异的差异带有特异的差异带(UBCgene)。克隆此片。克隆此片段，发现此片段影响基因调控过程中的某些蛋白。瞬时表段，发现此片段影响基因调控过程中的某些蛋白。瞬时表达分析表明，该序列位于启动子转录起始位点上游达分析表明，该序列位于启动子转录起始位点上游231159碱基位置；另外

30、，还发现碱基位置；另外，还发现UBC gene可促进可促进-淀粉酶基淀粉酶基因表达，从而调节水稻幼苗发育。因表达，从而调节水稻幼苗发育。研究抗病机制研究抗病机制 植物病害每年都使农作物受到大量损失，因此提高农植物病害每年都使农作物受到大量损失，因此提高农作物的抗病能力不仅有利于减少损失，而且有利于减少农作物的抗病能力不仅有利于减少损失，而且有利于减少农药使用和环境污染。目前研究植物抗病机理主要方法是探药使用和环境污染。目前研究植物抗病机理主要方法是探讨植物微生物的相互作用机制。讨植物微生物的相互作用机制。BenitoBenito等等1818通过研通过研究西红柿真菌病害，利用差异显示法对抗病机理进行了探究西红柿真菌病害，利用差异显示法对