第七章核酸分子杂交技术与核酸序列测定

1、第七章第七章 核酸分子杂交技术与核酸核酸分子杂交技术与核酸序列测定序列测定Molecular Hybridization and Blotting Technology 主讲教师：主讲教师： 熊伟熊伟 副教授副教授/博士博士Content of Table 前前 言言1 1 核酸分子杂交技术的原理核酸分子杂交技术的原理2 2 核酸探针的制备核酸探针的制备3 3 核酸探针的标记核酸探针的标记4 4 核酸分子杂交技术核酸分子杂交技术 前前 言言 核酸分子杂交核酸分子杂交 把亲源关系较近的，不同生物个体来源的把亲源关系较近的，不同生物个体来源的变性变性DNADNA或或RNARNA单链，经退火处理形成

2、单链，经退火处理形成DNA-DNA-DNADNA或或DNA-RNADNA-RNA这一过程叫这一过程叫分子杂交分子杂交。 第一节第一节 核酸分子杂交的核酸分子杂交的 基本原理基本原理一、分子杂交与印迹技术的原理一、分子杂交与印迹技术的原理P44P44复性复性RNADNA 应应 用：用：(1)(1)检测特定生物有机体之间是否存在检测特定生物有机体之间是否存在亲缘关系；亲缘关系；(2)(2)用来揭示核酸片段中某一特定基因用来揭示核酸片段中某一特定基因的存在与否、拷贝数及表达丰度。的存在与否、拷贝数及表达丰度。 Home例：例：变性引起紫外吸收值的改变变性引起紫外吸收值的改变DNA的紫外吸收光谱的紫外

3、吸收光谱增色效应：增色效应：DNA变性时其溶液变性时其溶液A260增高的现象。增高的现象。热变性热变性解链曲线解链曲线：如果在连续加热如果在连续加热DNADNA的过程中以的过程中以温度对温度对A A260260（absorbanceabsorbance，A A，A A260260代表溶液在代表溶液在260nm260nm处的吸光率）值作图，所得的曲线称为解处的吸光率）值作图，所得的曲线称为解链曲线链曲线。 Tm：变性是在一个相当窄的温度范围内完成，变性是在一个相当窄的温度范围内完成，在这一范围内，紫外光吸收值达到最大值的在这一范围内，紫外光吸收值达到最大值的50%时的时的温度称为温度称为DNA的

4、解链温度，又称融解的解链温度，又称融解温度温度(melting temperature, Tm)。其大小与。其大小与G+C含量成正比。含量成正比。核酸分子杂交的应用核酸分子杂交的应用研究研究DNA分子中某一种基因的位置分子中某一种基因的位置鉴定两种核酸分子间的序列相似性鉴定两种核酸分子间的序列相似性检测某些专一序列在待检样品中存在与否检测某些专一序列在待检样品中存在与否是基因芯片技术的基础是基因芯片技术的基础 第二节第二节 核酸探针技术及其标记核酸探针技术及其标记 一、核酸探针的种类和应用一、核酸探针的种类和应用根据核酸性质和检测目的不同可以分为：（一）基因组DNA探针（二）cDNA探针（三）

5、RNA探针（四）人工合成的寡核苷酸探针最基本的原则是核酸探针与要检测的核酸之间在核酸序列上要有高度的特异性 基因组基因组DNA探针探针 真核生物基因组中存在大量的重复序列和非编码序列，因此选择基因组DNA做探针时，一定要充分考虑实验目的性 利用分子克隆或PCR方法可以获得某一段特定的DNA序列cDNA探针探针 cDNA是能与mRNA互补的DNA分子，它是利用RNA分子作模板在逆转录酶作用下产生的。 利用基因克隆的方法可获得cDNA 优点：cDNA探针不含有内含子序列，尤其适用于基因表达的检测。RNA探针探针 RNA是单链分子，所以它与靶序列的杂交反应效率极高 早期采用的RNA探针是细胞mRNA

6、探针和病毒RNA探针。利用mRNA与基因的 DNA杂交，可以反映出基因的转录状态。 人工合成的寡核苷酸探针人工合成的寡核苷酸探针 利用DNA合成仪，采用化学方法人工合成寡核苷酸探针设计寡核苷酸探针的原则设计寡核苷酸探针的原则 1）序列及长度 根据靶分子的序列而定，长度一般为18-50个核苷酸合适。 2）碱基成分 一般G+C含量为40%-60% 3）探针分子内不存在互补，避免出现“发夹”结构 4）避免单一碱基的重复出现，不超过4个 5）与非靶标区域的同源性不超过70% 二、探针的标记二、探针的标记放射性和非放射性两种放射性和非放射性两种放射性核素：放射性核素： 32P、35S和和3H 非放射性标

7、记物：非放射性标记物：1）半抗原：）半抗原：生物素、地高辛素生物素、地高辛素 抗原抗原-抗体反应抗体反应2）配体：生物素）配体：生物素-亲和素反应亲和素反应3）荧光素）荧光素 ( 探针标记方法探针标记方法 核酸分子杂交所用的探针几乎都用体外标记法标记，分为化学法和酶法 化学法化学法P48：利用标记物分子上的活性基团与探针分子上的基团发生的化学反应直接将标记物结合到探针分子上。特点是简单、快速、均匀。 酶法酶法P48：将标记物预先标记在核苷酸分子上，然后利用酶促反应将标记的核苷酸分子渗入到探针分子上去，或将核苷酸分子上的标记基团交换到探针分子上。一个理想的标记物应满足：(1)(1)标记前后探针基

8、本结构、化学性质相同标记前后探针基本结构、化学性质相同; ;(2)(2)特异性强、本底低、重复性好；特异性强、本底低、重复性好；(3)(3)操作简单、节时；操作简单、节时；(4)(4)安全、无环境污染。安全、无环境污染。 常用探针的标记方法常用探针的标记方法3.2.13.2.1 缺口平移法缺口平移法3.2.23.2.2 随机引物标记法随机引物标记法3.2.33.2.3 末端标记法末端标记法3.2.43.2.4 生物素光照标记法生物素光照标记法缺口平移法的原理缺口平移法的原理 将将DNAase I 的水解活性与大肠杆菌的水解活性与大肠杆菌DNA polymerase I 的的53的聚合酶活性和的

9、聚合酶活性和5 3的外切酶活性相结合。的外切酶活性相结合。 首先用首先用E.coli的的DNAse I 在探针在探针DNA双链上造成缺口，双链上造成缺口，然后再借助于然后再借助于DNA pol I的的53外切酶活性，切去带有外切酶活性，切去带有5-磷酸的核苷酸；同时利用该酶磷酸的核苷酸；同时利用该酶53聚合酶活性，使生物聚合酶活性，使生物素或同位素标记的互补核苷酸补入缺口。素或同位素标记的互补核苷酸补入缺口。 这两种活性同时作用，缺口不断向这两种活性同时作用，缺口不断向3方向移动，方向移动，DNA链链上的核苷酸不断为标记的核苷酸取代，成为带有标记的上的核苷酸不断为标记的核苷酸取代，成为带有标记

10、的DNA，纯化除去游离脱氧核苷酸后成为标记，纯化除去游离脱氧核苷酸后成为标记DNA探针。探针。 随机引物标记法原理随机引物标记法原理 用一些六核苷酸作为随机引物，将这些用一些六核苷酸作为随机引物，将这些引物和探针引物和探针DNADNA片段一起热变性，退火后，片段一起热变性，退火后，引物与单链引物与单链DNADNA互补结合，再在互补结合，再在DNADNA聚合酶的聚合酶的作用下，按碱基互补配对原则不断在其作用下，按碱基互补配对原则不断在其3- 3- OHOH端添加标记的单核苷酸修补缺口，合成新端添加标记的单核苷酸修补缺口，合成新的标记的探针片段。的标记的探针片段。末端标记法原理末端标记法原理（1）

11、一种是在）一种是在5末端加成标记法：末端加成标记法： 先用碱性磷酸酶（先用碱性磷酸酶（AP）去掉）去掉dsDNA 5-磷磷酸，再用酸，再用T4多核苷酸激酶催化标记的多核苷酸激酶催化标记的ATP 的的-磷酸转移加到磷酸转移加到DNA片段片段5-OH上。上。（2）在探针）在探针3-末端用末端转移酶掺入一个末端用末端转移酶掺入一个单标记的单标记的-32PdNTP。生物素光照标记法生物素光照标记法 光敏生物素在紫外线照射下与光敏生物素在紫外线照射下与DNADNA或或RNARNA的碱基发生化学加成反的碱基发生化学加成反应，获得生物素标记的应，获得生物素标记的DNADNA探针。探针。探针的纯化探针的纯化

12、1.乙醇沉淀法 用无水乙醇沉淀2-3次 2.SG-50柱层析法 3.微柱离心法第三节第三节 核酸分子杂交的基本方法核酸分子杂交的基本方法 印迹杂交印迹杂交印迹杂交印迹杂交 将通过凝胶电泳分离的核酸将通过凝胶电泳分离的核酸片段片段转移转移到特定的固相支持物上到特定的固相支持物上,在在转移过程中，核酸片段保持其原来转移过程中，核酸片段保持其原来的相对位置不变，然后采用标记的核的相对位置不变，然后采用标记的核酸酸探针探针与结合于固相支持物上核酸片与结合于固相支持物上核酸片段进行段进行杂交杂交的技术。的技术。 印迹杂交类别：印迹杂交类别： 二、印迹技术的类别及应用二、印迹技术的类别及应用 用于基因组用

13、于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析、重组质粒和噬菌体的分析。分子杂交实验分子杂交实验白瓷盘白瓷盘玻璃板玻璃板滤纸滤纸凝胶凝胶尼龙膜尼龙膜滤纸滤纸吸水纸吸水纸玻璃板玻璃板重物重物吸水纸转膜吸水纸转膜。真空转膜槽真空转膜槽滤纸滤纸尼龙膜尼龙膜凝胶凝胶盖子盖子+-真空转膜真空转膜Southern印迹法印迹法DNA分子分子限制片段限制片段限制性酶切割限制性酶切割琼脂糖电泳琼脂糖电泳转移至硝酸纤维素膜上转移至硝酸纤维素膜上与放射性标记与放射性标记DNA探针杂交探针杂交放射自显影放射自显影带有带有DNA片片段的凝胶段的凝胶凝胶凝胶滤膜滤膜用缓冲液用缓冲液转移转移DNA吸附有吸附有DNA片段的膜片段的膜

14、Southern和和Western印迹法印迹法DNA frangmentElectrophoresisTransfer of DNA by blotting32P-labled DNA probeAutoradiographyAgarrose gelAutoradiogramNitrocellulose sheetAutoradiogramPolymer sheetSDS-Polyacrylamide gelTransfer proteinAdd radiolabled spesfic antibody , Wash to remove unboud antibodyProtein band

15、detected by specific antibodyAutoradiography 将待检测蛋白质（或酶）经将待检测蛋白质（或酶）经PAGE电泳并染电泳并染色后，转移到滤膜上固定，再用色后，转移到滤膜上固定，再用“抗体抗体-抗抗原原”免疫反应或免疫反应或“DNA-protein”结合反应结合反应鉴别滤膜上的蛋白质。鉴别滤膜上的蛋白质。 实验操作实验操作 1 细胞裂解物的准备；细胞裂解物的准备； 2 细胞裂解物的蛋白定量；细胞裂解物的蛋白定量； 3 细胞裂解物的细胞裂解物的SDS-PAGE； 4 蛋白质的转移；蛋白质的转移； 5 目的蛋白质的检测。目的蛋白质的检测。蛋白质免疫印迹法蛋白质免

16、疫印迹法三种印迹技术的比较三种印迹技术的比较分子杂交实验分子杂交实验放放射射自自显显影影照照片片(四四) 斑点印迹杂交和狭线印迹杂交斑点印迹杂交和狭线印迹杂交Dot blotting and slot blotting 适于核酸样品定量检测，而不是适于核酸样品定量检测，而不是定性检测。定性检测。 (五五)原位杂交原位杂交 in situ hybridization分为菌落、噬菌斑及真核细胞原位杂交分为菌落、噬菌斑及真核细胞原位杂交 第第 三三 节节 核核 酸酸 序序 列列 分分 析析Nucleic Acid Sequence Analysis 核酸序列分析的基本原理核酸序列分析的基本原理化学裂

17、解法化学裂解法 (Maxam-Gillbert法法)DNA链的末端合成终止法链的末端合成终止法 (sanger法法)DNA测序的基本战略测序的基本战略 设法产生带标记的不同长度的成套设法产生带标记的不同长度的成套DNA片片段，各带有标记的片段起点相同、终点不同，段，各带有标记的片段起点相同、终点不同，使待测的使待测的DNA链中的相应每个核苷酸处都有断链中的相应每个核苷酸处都有断裂或终止。通过裂或终止。通过PAGE电泳，能够将相差一个电泳，能够将相差一个核苷酸的核苷酸的DNA片段分开，放射自显影后，根据片段分开，放射自显影后，根据长短排列，根据特定末端碱基的长短排列，根据特定末端碱基的DNA片段

18、就可片段就可读出待测读出待测DNA的碱基序列。的碱基序列。 酶法酶法 测序技术进展测序技术进展 DNA序列分析序列分析（一）（一） 双脱氧终止法双脱氧终止法 英国英国Sanger 1955 确定牛胰岛素结构确定牛胰岛素结构, 1958 获诺贝尔化学奖获诺贝尔化学奖1975 设计出设计出DNA测序测序法法, 1980 获诺贝尔化学奖获诺贝尔化学奖. 合成一段与待测合成一段与待测DNA序列互补的序列互补的DNA片段群。片段群。 DNA的的Sanger测序法测序法(酶法酶法) 读出模板互读出模板互补序列补序列dNTP 凝胶电泳凝胶电泳 较大片段较大片段 较小片段较小片段ddGTPddATPddCTP ddTTP 反应混合物反应混合物Klenow酶酶 未知序列的单链未知序列的单链DNA 读出待测读出待测序列序列CTGACTTCGACAAAGAA5 3 放射性标记的引物放射性标记的引物TGTTA C T GddGddGddGddGGACTGAAGCTGTT3 5 CTGACTTCGACAA5 3 DNA的测序仪示意图的测序仪示意图computer analysis凝胶中凝胶