不同产地当归炮制前后质量研究

1、目录摘要1. 当归的炮制方法及工艺参数1.1药材1.2炮制品1.2.1酒炙法1.2.2包装 2.薄层色谱（TLC）鉴别 2.1试药及对照品与设备 2.1.1试药及对照品 2.1.2设备 2.2实验方法2.2.1利用当归对照药材建立的薄层色谱鉴别方法 2.2.1.1对照药材溶液的制备 2.2.1.2供试品溶液的制备 2.2.1.3薄层色谱条件2.2.2利用阿魏酸对照品建立的薄层色谱鉴别方法 2.2.2.1对照品溶液的制备 2.2.2.2供试品溶液的制备 2.2.2.3薄层色谱条件 2.3实验结果 2.3.1利用当归对照药材建立的薄层鉴别图谱2.32利用阿魏酸对照品建立的薄层鉴别图谱2.3.3讨论

2、分析3当归炮制前后HPLC特征图谱及阿魏酸的含量 3.1试剂与仪器 32方法与结果 3.2.1色谱条件 3.2.2对照品溶液的制备 3.2.3供试品溶液的制备 3.3特征图谱方法学考察 3.3.1精密度试验 3.3.2稳定性试验 3.3.3重现性试验3.4炮制前后特征图谱分析 3.4.1特征图谱的建立 3.4.2特征峰的指认3.5阿魏酸含量测定方法学考察 3.5.1标准曲线 3.5.2精密度试验 3.5.3稳定性试验 3.5.4重复性试验3.6当归炮制前后阿魏酸的含量测定4 讨论 4.1样品提取方法的选择 4.2样品提取溶剂的选择 4.3波长选择 4.4流动相 4.5色谱柱 4.6柱温和流速选

3、择5实验结果不同产地当归炮制前后质量研究摘 要：目的 研究不同产地炮制前后的质量变化。方法 采用高效液相色谱法、薄层色谱法等测定四川、甘肃等产地当归炮制前后当归素、异当归素的含量变化。结果 炮制使不同产地当归中当归素、异当归素的含量增加，而产地不同，当归的有效成分量不同。结论 炮制能使不同产地当归中有效成分增加，显著提高中药当归的生物活性，产地不同，药物质量评价不同。 当归为伞形科植物当归的干燥根。具有补血活血，调经止痛，润肠通便的功效。主要用于血虚诸证；月经不调；经闭；痛经；症瘕结聚；崩漏；虚寒腹痛；痿痹；肌肤麻木；肠燥便难；赤痢后重；痈疽疮疡；跌扑损伤。1. 当归的炮制方法及工艺参数1.1

4、药材 当归药材及饮片样品由浙江中医药大学中药饮片厂加工炮制而成，每批药材样品各自加工成相应的炮制品，经南京中医药大学陈建伟教授鉴定为当归药材及饮片。样品编号如下表所示。3个产地当归药材和炮制品来源品种批号产地来源当归药材080728四川中江浙江中医药大学中药饮片厂080606甘肃渭源浙江中医药大学中药饮片厂080605甘肃岷县浙江中医药大学中药饮片厂酒当归080728四川中江浙江中医药大学中药饮片厂080606甘肃渭源浙江中医药大学中药饮片厂080605甘肃岷县浙江中医药大学中药饮片厂1.2炮制品1.2.1酒炙法将当归薄片 55.0 kg，加黄酒5.5kg拌匀，润透。启动炒药机（型号：自控温鼓

5、式炒药机 CGY-750W）。加热铁锅_5_min至60。A将闷润好的当归薄片置30 kg置预热好的热锅中，温度为 70110 炒_30_min至干，取出，晾凉。B将闷润好的当归薄片置 30 kg置预热好的热锅中，温度为 100130 炒_22_min至干，取出，晾凉。1.2.2包装酒当归饮片按每包装袋1kg称重，装入相应的塑料包装袋内，封口，贴上标签。原药材 55 kg，共收酒当归饮片_ 38.84kg。成品收率70.6_%2 薄层色谱（TLC）鉴别2.1实验材料2.1.1试药及对照品当归对照药材(中国药品生物制品检定所，批号：120927-200613)；阿魏酸对照品(朗泽植提)。乙醚、甲

6、醇、环己烷、乙酸乙酯、二氯甲烷等试剂为分析纯。2.1.2实验仪器薄层色谱扫描系统(瑞士CAMAG公司)，包括半自动点样仪Linomat 5-150743及自动成像系统Visualizer-151204。硅胶预制薄层板GF-254(青岛海洋化工厂)，用前105活化。R-210旋转蒸发仪（瑞士BUCHI公司），KQ5200DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。2.2实验方法22.1利用当归对照药材建立的薄层色谱鉴别方法2.2.1.1对照药材溶液的制备取对照药材粉末约0.5 g，精密称定，置100 mL具塞锥形瓶中，精密加入乙醚30 mL，密塞，超声处理（200W，40 KHz）10mi

7、n，过滤，滤液在60下减压蒸干，用95%乙醇定容至1mL，即得到对照药材溶液，冷藏备用。2.2.1.2供试品溶液的制备取当归药材及饮片样品粉末约0.5 g，精密称定，分别置100 mL具塞锥形瓶中，精密加入乙醚30 mL，密塞，超声处理（200W，40 KHz）10min，过滤，将滤液在60下减压蒸干，分别用95%乙醇定容至1mL，即得到当归药材和饮片的供试品溶液，冷藏备用。2.2.1.3薄层色谱条件采用瑞士CAMAG公司的薄层色谱系统进行自动点样和图像采集。点样：2uL，条带状点样，条带宽度为6mm，点样距两边各为12mm，条带距底边12mm.展开剂：正己烷-乙酸乙酯（4：1）为展开剂。精密

8、量取正己烷20mL，乙酸乙酯5mL。展开缸：双槽展开缸，10cm×10cm。展开：展开缸预平衡15分钟，上行展开，展距约为9cm。检视：置366nm紫外灯下检视。2.2.2 利用阿魏酸对照品建立的薄层色谱鉴别方法2.2.2.1 对照品溶液的制备取阿魏酸5mg，精密称定，置于5 mL容量瓶中，混匀，得浓度为1.0mg/mL的对照品溶液，冷藏备用。2.2.2.2 供试品溶液的制备取当归药材及饮片样品粉末约3.0g，精密称定，加入1的碳酸氢钠溶液50mL，超声10min，离心过滤，滤液用稀盐酸调pH至2-3，用乙醚萃取两次，每次20mL，合并萃取液，蒸干，用甲醇定容至1mL，即得。2.2.

9、2.3薄层色谱条件采用瑞士CAMAG公司的薄层色谱系统进行自动点样和图像采集。点样：3uL，条带状点样，条带宽度为6mm，点样距两边各为12mm，条带距底边12mm.展开剂：环己烷：二氯甲烷：乙酸乙酯：甲酸4：1：1：0.1为展开剂。展开缸：双槽展开缸，10cm×10cm。展开：展开缸预平衡15分钟，上行展开，展距约为9cm。检视：置366nm紫外灯下检视。2.3 实验结果2.3.1 利用当归对照药材建立的薄层鉴别图谱当归药材和酒当归样品的薄层色谱图如下图所示： 1 2 3 4 5 6 7 8各点依次为：1. 对照药材、 2. 四川中江（药材）080728、 3. 甘肃渭源（药材）0

10、80606 4. 甘肃岷县（药材）080605 5. 四川中江（酒当归）080728、6. 甘肃渭源（酒当归）080606 7. 甘肃岷县（酒当归）080605、 8. 对照药材（T:16，RH:35%）2.3.2 利用阿魏酸对照品建立的薄层鉴别图谱当归药材和酒当归样品的薄层色谱图如下图所示： 1 2 3 4 5 6 7 8各点依次为：1. 阿魏酸 2. 四川中江（药材）080728、 3. 甘肃渭源（药材）080606 4. 甘肃岷县（药材）080605 5. 四川中江（酒当归）080728、6. 甘肃渭源（酒当归）080606 7. 甘肃岷县（酒当归）080605、 8. 阿魏酸（T:14

11、，RH:55%）从图中可以看到当归炮制前后，成分变化不明显，其中有些成分的斑点颜色加深，可能炮制后成分含量增加，而也有成分斑点颜色减弱，可能成分减少。3当归炮制前后HPLC特征图谱及阿魏酸的含量测定研究3.1仪器与试剂岛津LC-20AB高效液相色谱仪，包括DGU-20A3在线脱气机、SIL-20A自动进样器、SPD- M20A检测器、CTO-20A柱温箱和Class-VP色谱工作站；KQ5200DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；METTLER TOLEDO AL104电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；高速万能粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)。甲醇、乙腈为色谱级（美国

12、Merck公司），其他试剂为分析纯。阿魏酸对照品由朗泽植提公司提供。3.2 方法与结果3.2.1 色谱条件色谱柱为YMC-Pack ODS-A(250 mm×4.6 mm, 5m)（YMC Co. Ltd, Japan），柱温为35，流速为1mL/min，检测波长为254nm，流动相为乙腈和0.2%的乙酸水溶液，梯度洗脱程序如下表所示：流动相线性洗脱梯度程序时间/min0.2 % 乙酸水溶液（A）/%乙腈（B）/%0955308020656040755050854555954555110356512015851259553.2.2对照品溶液的制备取阿魏酸5mg，精密称定，置于5 mL

13、容量瓶中，混匀，得浓度为1.0mg/mL的对照品溶液，冷藏备用。3.2.3供试品溶液的制备精密称取样品粉末1.0g置100mL具塞锥形瓶中，加甲醇30 mL，置超声机中超声提取30 min，取出放冷，用滤纸滤过，药渣连同滤纸放回锥形瓶中，再加甲醇30mL，置超声机中超声提取30 min，取出放冷，用滤纸滤过，合并两次滤液，减压蒸干，用甲醇定容至10mL，即得。进样前以0.45m微孔滤膜滤过。3.3特征图谱方法学考察3.3.1精密度试验 取甘肃渭源当归药材，依法制备供试品溶液并连续进样6次进行指纹图谱测定，以1号峰为标准峰计算各共有峰的相对保留时间RSD均小于0.196%，相对峰面积的RSD均小

14、于2.53%。结果见下表。精密度试验相对保留时间峰1峰2峰3峰4峰5峰6峰7峰8峰9峰1011.0001.3651.4462.1762.4672.7142.7632.8182.8503.76821.0001.3631.4432.1722.4632.7102.7592.8142.8463.76331.0001.3641.4452.1772.4672.7152.7642.8192.8513.76941.0001.3641.4442.1742.4652.7122.7602.8162.8483.76551.0001.3621.4432.1722.4632.7102.7592.8142.8463.762

15、61.0001.3661.4472.1822.4762.7242.7732.8292.8613.782均值1.0001.3641.4452.1752.4672.7142.7632.8182.8503.768SD0.0000000.0012160.0015210.0037140.0048340.0052920.0053810.0055110.0056080.007374RSD/%0.0000.0890.1050.1700.1960.1950.1940.1950.1960.195精密度试验相对峰面积峰1峰2峰3峰4峰5峰6峰7峰8峰9峰10 11.000 2.035 0.460 0.252 1.1

16、65 0.291 0.448 5.544 1.588 0.894 21.000 2.014 0.459 0.245 1.137 0.289 0.446 5.473 1.597 0.875 31.000 2.007 0.446 0.243 1.106 0.287 0.446 5.470 1.606 0.933 41.000 2.005 0.447 0.247 1.164 0.296 0.454 5.458 1.553 0.890 51.000 2.068 0.446 0.246 1.156 0.295 0.450 5.438 1.551 0.897 61.000 2.060 0.445 0.24

17、2 1.099 0.288 0.440 5.421 1.535 0.902 平均值1.000 2.031 0.450 0.246 1.138 0.291 0.447 5.467 1.572 0.898 SD0.000000 0.027296 0.006863 0.003474 0.028854 0.003605 0.004612 0.042410 0.028930 0.019208 RSD/%0.000 1.343 1.523 1.413 2.535 1.239 1.030 0.775 1.840 2.138 3.3.2稳定性试验取甘肃渭源当归药材，依法制备供试品溶液，分别在0、2、4、6、8

18、、12 h进样测定，以1号峰为标准峰计算各共有峰的相对保留时间RSD均小于0.209%，相对峰面积的RSD均小于2.44%。结果见下表。 稳定性实验相对保留时间峰1 峰2峰3峰4峰5峰6峰7峰8峰9峰1001.000 1.363 1.443 2.172 2.463 2.710 2.759 2.814 2.846 3.763 21.000 1.364 1.445 2.177 2.467 2.715 2.764 2.819 2.851 3.769 41.000 1.364 1.444 2.174 2.465 2.712 2.760 2.816 2.848 3.765 61.000 1.362 1.

19、443 2.172 2.463 2.710 2.759 2.814 2.846 3.762 81.000 1.366 1.447 2.182 2.476 2.724 2.773 2.829 2.861 3.782 121.000 1.363 1.443 2.172 2.463 2.709 2.758 2.813 2.845 3.761 平均值1.000 1.364 1.444 2.175 2.467 2.714 2.763 2.818 2.850 3.768 SD0.0000000.0011870.0015850.0039210.0050520.0056230.0057290.0058720.

20、0059840.007836RSD/%0.0000.0870.1090.1800.2040.2070.2070.2080.2090.208稳定性实验相对峰面积峰1 峰2峰3峰4峰5峰6峰7峰8峰9峰1021.000 2.014 0.459 0.245 1.137 0.289 0.446 5.473 1.597 0.875 31.000 2.007 0.446 0.243 1.106 0.287 0.446 5.470 1.606 0.933 41.000 2.005 0.447 0.247 1.164 0.296 0.454 5.458 1.553 0.890 51.000 2.068 0.4

21、46 0.246 1.156 0.295 0.450 5.438 1.551 0.897 61.000 2.060 0.445 0.242 1.099 0.288 0.440 5.421 1.535 0.902 71.000 2.088 0.452 0.267 1.403 0.325 0.484 5.381 1.563 1.014 平均值1.000 2.040 0.449 0.248 1.178 0.297 0.453 5.440 1.568 0.918 SD0.0000000.0304400.0057610.0021970.0287630.0040290.0051390.0222520.03

22、10560.021344RSD/%0.0001.4921.2820.8842.4421.3581.1330.4091.9812.3243.3.3 重现性试验取甘肃渭源当归药材6份，依法分别制备供试品溶液，同法进样测定，记录色谱图并积分。以1号峰为标准峰计算各共有峰的相对保留时间RSD均小于0.108%，相对峰面积的RSD均小于5%。结果见下表。重现性实验相对保留时间峰1峰2峰3峰4峰5峰6峰7峰8峰9峰10 11.000 1.354 1.435 2.163 2.461 2.702 2.751 2.806 2.838 3.750 21.000 1.357 1.438 2.165 2.458 2.

23、698 2.747 2.802 2.834 3.745 31.000 1.354 1.434 2.159 2.455 2.695 2.744 2.798 2.831 3.741 41.000 1.356 1.437 2.164 2.459 2.700 2.749 2.803 2.836 3.748 51.000 1.357 1.438 2.165 2.461 2.702 2.751 2.805 2.837 3.749 61.000 1.357 1.438 2.167 2.463 2.704 2.753 2.807 2.840 3.752 平均值1.000 1.356 1.437 2.164 2

24、.460 2.700 2.749 2.804 2.836 3.748 SD0.0000000.0011450.0014440.0023540.0025340.0027600.0028380.0029040.0029480.003826RSD/%0.00000.08450.10050.10880.10300.10220.10320.10360.10400.1021重现性实验相对峰面积峰1 峰2峰3峰4峰5峰6峰7峰8峰9峰10 11.000 1.472 0.342 0.221 0.597 0.202 0.297 3.796 1.135 0.514 21.000 1.574 0.442 0.198

25、 0.636 0.217 0.323 4.188 1.248 0.560 31.000 1.576 0.450 0.215 0.631 0.207 0.317 4.259 1.187 0.575 41.000 1.475 0.534 0.270 0.580 0.229 0.306 3.609 1.898 0.510 51.000 1.552 0.493 0.235 0.605 0.218 0.308 3.874 1.225 0.539 61.000 1.585 0.480 0.224 0.610 0.220 0.316 4.082 1.205 0.565 平均值1.000 1.539 0.45

26、7 0.227 0.610 0.215 0.311 3.968 1.316 0.544 SD0.0000000.0474010.0594020.0223230.0193860.0089580.0084350.2285070.2624520.024953RSD/%0.00003.079813.00259.82093.17944.15822.71055.758419.93864.58823.4炮制前后特征图谱分析3.4.1特征图谱的建立将各供试品溶液按2.1项下色谱条件测定，得到各样品的HPLC特征图谱，结果见下图：不同产地当归药材HPLC图谱阿魏酸不同产地当归饮片HPLC图谱阿魏酸当归药材HPL

27、C特征图谱（甘肃渭源）3.4.2特征峰的指认按照2.1项下液相条件和分析方法对阿魏酸对照品溶液进行分析，进样体积为10 uL，确定阿魏酸的位置，如下图所示；同时，以甲醇为空白溶剂，进样10 uL，确定空白溶剂中没有杂质存在。阿魏酸HPLC图谱阿魏酸甘肃渭源当归药材HPLC图谱（红色为阿魏酸，蓝色为空白）3.5 阿魏酸含量测定方法学考察3.5.1标准曲线移取适量的对照品溶液于容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，配成系列标准溶液，浓度分别为1.0mg/mL、0.1 mg/mL、0.05 mg/mL、0.02 mg/mL、0.01 mg/mL、0.001 mg/mL。在2.1项下色谱条件下分别进样10

28、 uL，测定。以对照品溶液的质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制阿魏酸的标准曲线，并计算线性回归方程为y=18792600.531x+60038.962(r= 0.9999)，结果表明阿魏酸在浓度为0.001 1.0 mg/mL之间呈良好的线性关系。3.5.2精密度试验取甘肃渭源当归药材供试品溶液10L按照2.1项下色谱条件测定，连续进样6次，阿魏酸的峰面积的RSD为0.75 %，结果表明仪器精密度良好。阿魏酸精密度试验连续进样次数 阿魏酸峰面积 11583241 21586107 31597636 41605857 51612651 61587548 平均值1595507 标准偏差/SD1

29、1897 相对标准偏差/RSD0.0075 3.5.3稳定性试验取甘肃渭源当归药材供试品溶液，分别在配制后的0、2、4、6、8、12 h进样测定，测得阿魏酸峰面积的RSD为1.37%，说明供试样品中阿魏酸在24 h内稳定。阿魏酸稳定性试验不同时间/h阿魏酸峰面积 01586107 21597636 41605857 61612651 81587548 121645991平均值1605965标准偏差/SD22134 相对标准偏差/RSD0.0137 3.5.4重复性试验取甘肃渭源当归药材6份，每份1.0 g，精密称定，按供试品溶液制备方法制备样品，进样10L，阿魏酸峰面积的RSD为4.70%，结

30、果表明该方法的重复性良好。阿魏酸重复性实验重复份数阿魏酸峰面积 12172818 22046897 32037433 42292181 52177669 62063594平均值2131765 标准偏差/SD100273 相对标准偏差/RSD0.0470 3.6当归炮制前后阿魏酸的含量测定按供试液品制备方法分别制备当归药材及饮片的供试品溶液，依照2.1项下色谱条件分析各样品。将各供试品溶液分别进样测定3次，以峰面积按标准曲线法计算各批次样品中阿魏酸的含量，并计算平均值，结果见下表。当归炮制前后阿魏酸含量品种批号产地峰面积含量（mg/g）百分含量/%当归药材080728四川中江4083208060

31、6甘肃渭源15455100.79040.0790080605甘肃岷县7865860.38660.0380酒当归080728四川中江47723080606甘肃渭源15699010.80340.0800080605甘肃岷县8289600.40910.0410注：“”指未检出本研究说明中药指纹图谱通过对中药整体特性的描述，采取适当模糊的处理方式，可控制药材饮片质量的同一性、稳定性。此外，当归药材及饮片的阿魏酸含量范围为0.380.80 mg/g，在整体图谱相似性良好的情况下，药材所含有效成分的含量仍然可能存在较大差异。因此，有必要在指纹图谱评价基础上尽可能增加有效成分的含量检测，进一步评价药品质量。

32、4 讨论4.1 样品提取方法的选择根据药材的主要成分性质，结合文献资料，实验对超声提取法和加热回流提取法进行了考察，以甘肃渭源当归样品共有峰的峰面积作为评价指标，分别采用加热回流提取和超声提取来提取供试品，提取次数分别考察1次、2次和3次，然后按照供试品溶液的制备方法制备样品，按照2.1项下色谱条件进行液相分析，结果如下图所示：当归药材不同提取提取方式峰面积比较峰1 峰2峰3峰4峰5峰6峰7峰8峰9峰10回流1次1598807 3121530 944179 334915 969097 430825 696338 8792131 2324453 1367950 回流2次1865657 34188

33、75 1133535 385449 867913 515090 723286 9548555 2524739 1365741 回流3次2686932 3371331 1222808 383064 898169 522446 780683 9686780 2520404 1129754 超声1次1559605 3156506 1170131 383450 1185503 513732 732247 8758381 2362316 1333167 超声2次1642304 3220463 979889 342972 1163348 465070 686058 9178820 2494971 1302

34、848 超声3次1736387 3346433 1082457 357386 1129933 499258 711417 9378150 2438884 1339233 当归药材不同提取方法和提取次数选择当归药材不同超声次数比较（黑色为1次，蓝色为3次）当归药材不同回流次数比较（黑色为1次，蓝色为3次）由上图所示，采用不同提取方法，不同提取次数，对10个共有成分的提取得率相似，考虑到尽量多的提取成分和简单、快速等因素，故采用甲醇超声提取2次，每次30min作为提取工艺。4.2 样品提取溶剂的选择取甘肃渭源当归药材5份，每份1.0g，精密称定，分别采用20%、40%、60%、80%和100%的甲

35、醇提取个样品，制备不同提取溶剂的供试品溶液，以共有峰的峰面积为评价指标，按照上述条件进行液相分析，结果如下图所示：当归药材不同提取溶剂共有峰峰面积峰1峰2峰3峰4峰5峰6峰7峰8峰9峰1020%甲醇1383828302682074567926893367533649142231271387809172140%甲醇177768731249781114131110758652914018610213412648501671509029460%甲醇1388662219749756608774703125673220072279458346380170284962291180%甲醇2089456327

36、3884914279223299151130418455613006757091517479601250193100%甲醇186217633658461098880350034881957464356703492939494723651071363745当归药材不同提取溶剂选择当归药材不同提取溶剂比较（从上到下依次为100%甲醇、80%甲醇、60%甲醇、40%甲醇、20%甲醇）由上图所示，采用不同提取溶剂，对10个共有成分的提取得率各不相同，考虑到尽量多的提取成分，故采用100%甲醇作为提取溶剂。4.3波长选择 参考相关文献资料1-4，同时考虑已知当归中有效成分阿魏酸和其他成分的紫外吸收，表明

37、以254 nm处检测的图谱信息量最多且重现性好，峰形较好，溶剂干扰少，基线平稳，故选用254nm作为当归的检测波长。4.4流动相实验比较了不同比例甲醇-水、乙腈-水、甲醇- 0.2%乙酸、乙腈-0.2%乙酸等溶剂系统进行梯度洗脱，以乙腈-0.2%乙酸系统所得图谱的峰形较好、分离度大,所以选用乙腈-0.2%乙酸系统为本试验流动相系统。4.5色谱柱分别采用Tigerkin ODS-C18柱(250mm×4.6mm, 5m,大连思谱公司)和YMC-Pack ODS-A柱(250 mm×4.6 mm, 5m)（YMC Co. Ltd, Japan）进行洗脱，结果表明YMC-Pack ODS-A柱洗脱出的色谱峰基本平稳，峰数多且分离度好，柱效高，所以选用YMC-Pack ODS-A柱。4.6柱温和流速选择在上述条件下，对比了不同柱温（25、35、45）及不同流速（0.8 mg/mL、1 mg/mL、1.2 mg/mL）条件下