第12章 分子发光分析

1、2022-5-30Instrument Analysis 化学化工学院1Molecular Luminescence Analysis12-1 分子发光分析概述分子发光分析概述 在化学反应过程中，分子吸收反应释放出的在化学反应过程中，分子吸收反应释放出的化学能而产生激发态物质，当回到基态时发出光化学能而产生激发态物质，当回到基态时发出光辐射，这种分子受化学能辐射，这种分子受化学能 激发后产生的发光现象激发后产生的发光现象称为化学发光。利用化学发光现象建立的分析方称为化学发光。利用化学发光现象建立的分析方法称为化学发光分析。法称为化学发光分析。2022-5-30Instrument Analys

2、is 化学化工学院21.1.荧光和磷光的产生荧光和磷光的产生1）分子能级与跃迁 分子能级比原子能级复杂；分子能级比原子能级复杂； 在每个电子能级上，都存在振动、转动能级；在每个电子能级上，都存在振动、转动能级； 基态基态(S0)激发态激发态(S1、S2、激发态振动能级激发态振动能级) )：吸：吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁一次到位收特定频率的辐射；量子化；跃迁一次到位。 12-2 12-2 荧光和磷光分析基本原理荧光和磷光分析基本原理2022-5-30Instrument Analysis 化学化工学院3激发态激发态基态：多种途径和方式基态：多种途径和方式(见能级图见能级图)；速度；速度最快

3、、激发态寿命最短的途径占优势；最快、激发态寿命最短的途径占优势； 第一、第二、第一、第二、电子激发单重态电子激发单重态 S1 、S2 ； 第一、第二、第一、第二、电子激发三重态电子激发三重态 T1 、 T2 ；2022-5-30Instrument Analysis 化学化工学院42 2）电子激发态的多重度）电子激发态的多重度 电子激发态的多重度：电子激发态的多重度：M=2S+1 S S为电子自旋量子数的代数和为电子自旋量子数的代数和(0(0或或1)1)； 平行自旋比成对自旋稳定平行自旋比成对自旋稳定( (洪特规则洪特规则) )，三重态能，三重态能级比相应单重态能级低；级比相应单重态能级低；

4、大多数有机分子的基态处于单重态；大多数有机分子的基态处于单重态； 2022-5-30Instrument Analysis 化学化工学院5 S0T1 禁阻跃迁；通过其他途径进入禁阻跃迁；通过其他途径进入(见能级图见能级图)；进入的几率小；进入的几率小； 2022-5-30Instrument Analysis 化学化工学院62）.激发态基态的能量传递途径 电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃迁过辐射跃迁(发光发光)和无辐射跃迁等方式失去能量。和无辐射跃迁等方式失去能量。传递途径传递途径辐射跃迁荧光延迟荧光磷光内转移外转移系间跨越振动弛预无

5、辐射跃迁2022-5-30Instrument Analysis 化学化工学院7 激发态停留时间短、返回速度快的途径，发生的激发态停留时间短、返回速度快的途径，发生的几率大，几率大，发光强度相对大；发光强度相对大；荧光荧光：10-710-9 s,第一激发单重态的最低振动能级第一激发单重态的最低振动能级基态；基态；磷光磷光：10-410s；第一激发三重态的最低振动能级；第一激发三重态的最低振动能级基态；基态；2022-5-30Instrument Analysis 化学化工学院8S2S1S0T1吸吸收收发发射射荧荧光光发发射射磷磷光光系间跨越内转换振动弛豫能量l l 2l l 1l l 3 外转

6、换l l 2T2内转换振动弛豫2022-5-30Instrument Analysis 化学化工学院9非辐射能量传递过程非辐射能量传递过程 振动弛豫振动弛豫：同一：同一电子能级内以热能量交换形式由高电子能级内以热能量交换形式由高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛振动能级至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间豫的时间10-14-10 -12 s。 内转换内转换：同多重度电子能级中：同多重度电子能级中,等能级间的无辐射能等能级间的无辐射能级交换，级交换，时间时间10-13-10-11 s。 。 2022-5-30Instrument Analysis 化学化工学院10 通过内转换和

7、振动弛豫，高激发单重态的电子通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一激发单重态的最低振动能级。跃回第一激发单重态的最低振动能级。 外转换外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转移能量的非辐射跃迁；互作用而转移能量的非辐射跃迁； 外转换使荧光或磷光减弱或外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭猝灭”。系间跨越系间跨越：不同多重态：不同多重态,有重叠的转动能级间的非有重叠的转动能级间的非辐射跃迁辐射跃迁,时间时间10-6-10-2 s。 。 改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋轨道轨道耦合进行。耦合进行。2022-5-30I

8、nstrument Analysis 化学化工学院11 荧光发射荧光发射：电子由：电子由第一激发单重态的最低振动能级第一激发单重态的最低振动能级基态（基态（ 多为多为 S1 S0跃迁），发射波长为跃迁），发射波长为 l l 2的荧的荧光；光； 10-710-9 s 。 由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长；小，波长长； l l 2 l l 2 l l 1 ； 磷光发射磷光发射：电子由电子由第一激发三重态的最低振动能级第一激发三重态的最低振动能级基态（基态（ T1 S0跃迁）；跃迁）； 电子由电子由S0进入进入T1的可能过程：（的可能过程：（

9、 S0 T1禁阻跃禁阻跃迁）迁） 2022-5-30Instrument Analysis 化学化工学院12 S0 激发激发振动弛豫振动弛豫内转移内转移系间跨越系间跨越振动弛豫振动弛豫 T1 发光速度很慢：发光速度很慢： 10-410 s 。 光照停止后，可持续一段时间。光照停止后，可持续一段时间。2022-5-30Instrument Analysis 化学化工学院132.2.激发光谱和发射光谱激发光谱和发射光谱1 1）荧光）荧光( (磷光磷光) )的激发光谱曲线的激发光谱曲线 固定测量波长固定测量波长( (选最大发射波长选最大发射波长),),化合物发射的化合物发射的荧光荧光( (磷光磷光)

10、 )强度与照射光波长的关系曲线强度与照射光波长的关系曲线 （图中曲（图中曲线线I I ） 。2022-5-30Instrument Analysis 化学化工学院14 激发光谱曲线的激发光谱曲线的最高处，处于激发态最高处，处于激发态的分子最多，荧光强的分子最多，荧光强度最大。度最大。2022-5-30Instrument Analysis 化学化工学院152）荧光光谱(或磷光光谱) 固定激发光波长固定激发光波长( (选最选最大激发波长大激发波长), ), 化合物发射化合物发射的荧光的荧光( (或磷光强度或磷光强度) )与发与发射光波长关系曲线射光波长关系曲线( (图中曲图中曲线线II或或III

11、) )。2022-5-30Instrument Analysis 化学化工学院16200260320380440500560620荧光激发光谱荧光激发光谱荧光发射光谱荧光发射光谱磷光光谱磷光光谱室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱2022-5-30Instrument Analysis 化学化工学院173）激发光谱与发射光谱的关系 a.Stokesa.Stokes位移位移 激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比激发光谱的长，的波长比激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。振动弛豫消耗了能量。 b. .发射光谱的形状与激

12、发波长无关发射光谱的形状与激发波长无关 电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量量( (如能级图如能级图l l 2 ,l l 1)，产生不同吸收带，产生不同吸收带，但均回到第但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，产一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光生波长一定的荧光(如如l l 2 )。2022-5-30Instrument Analysis 化学化工学院18c. . 镜像规则镜像规则 通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）成镜像对称关系。谱形状一样）成镜像

13、对称关系。 2022-5-30Instrument Analysis 化学化工学院19镜像规则的解释镜像规则的解释 基态上的各振动能级基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各分布与第一激发态上的各振动能级分布类似；振动能级分布类似； 基态上的零振动能级与第一激发态的二振基态上的零振动能级与第一激发态的二振动能级之间的跃迁几率最大，相反跃迁也然。动能级之间的跃迁几率最大，相反跃迁也然。 2022-5-30Instrument Analysis 化学化工学院202022-5-30Instrument Analysis 化学化工学院21200250300350400450500荧光激发光谱荧光激发光

14、谱荧光发射光谱荧光发射光谱nm蒽的激发光谱和荧光光谱蒽的激发光谱和荧光光谱2022-5-30Instrument Analysis 化学化工学院223.3.荧光效率荧光效率吸收激发光的量子数发射荧光的量子数 罗丹明罗丹明B B乙醇溶液的乙醇溶液的0.97,荧荧光素水溶液光素水溶液0.65,菲乙醇溶液菲乙醇溶液0.10。一般都在。一般都在0.10-1之之间间。2022-5-30Instrument Analysis 化学化工学院234.4.荧光和分子结构的关系荧光和分子结构的关系 1 1）分子产生荧光必须具备的条件）分子产生荧光必须具备的条件（1）具有合适的结构；）具有合适的结构；（2）具有一定

15、的荧光量子产率。）具有一定的荧光量子产率。 2022-5-30Instrument Analysis 化学化工学院242）化合物的结构与荧光（1）跃迁类型：）跃迁类型： * 的荧光效率高，系间跨越过的荧光效率高，系间跨越过程的速率常数小，有利于荧光的产生；程的速率常数小，有利于荧光的产生；（2）共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并）共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移产生红移（3）刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂）刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞的相互作用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光素有很强的荧光

16、，酚酞却没有。有相似结构，荧光素有很强的荧光，酚酞却没有。2022-5-30Instrument Analysis 化学化工学院25（4）取代基效应：芳环上有供电基，使荧光增强。）取代基效应：芳环上有供电基，使荧光增强。2022-5-30Instrument Analysis 化学化工学院262022-5-30Instrument Analysis 化学化工学院275.荧光定量分析原理(1)定量依据定量依据 荧光强度荧光强度If正比于吸收的光量正比于吸收的光量Ia和荧光量子效率和荧光量子效率 ： If = Ia 由朗由朗-比耳定律：比耳定律： Ia = I0(1-10- l c ) If =

17、I0(1-10- l c ) = I0(1-e-2.3 l c ) 浓度很低时，将括号项近似处理后：浓度很低时，将括号项近似处理后： If = 2.3 I0 l c = Kc2022-5-30Instrument Analysis 化学化工学院28（2 2）环境对荧光强度的影响）环境对荧光强度的影响溶剂的影响溶剂的影响 除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位键的形成都将使化合物的荧光发生变化。键的形成都将使化合物的荧光发生变化。温度的影响温度的影响 荧光强度对温度变化敏感，温度增加，外转换荧光强度对温度变化敏感，温度增加，外转换去活的几率增加。去活的几

18、率增加。溶液溶液pH 对酸碱化合物，溶液对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格的影响较大，需要严格控制。控制。2022-5-30Instrument Analysis 化学化工学院29各种散射光的影响各种散射光的影响 主要有瑞利散射光和拉曼散射光干扰。通过选主要有瑞利散射光和拉曼散射光干扰。通过选择合适的激发波长来消除。择合适的激发波长来消除。激发光照射的影响激发光照射的影响 有的荧光物质在激发光的照射下容易分解，引有的荧光物质在激发光的照射下容易分解，引起荧光强度急剧下降。起荧光强度急剧下降。荧光的猝灭荧光的猝灭 碰撞猝灭；碰撞猝灭； 氧的熄灭作用等氧的熄灭作用等。2022-5-30In

19、strument Analysis 化学化工学院306. 荧光定性分析荧光定性分析 根据荧（磷）的激发光谱和发射光谱进行化合根据荧（磷）的激发光谱和发射光谱进行化合物的鉴定。物的鉴定。2022-5-30Instrument Analysis 化学化工学院311. 1. 仪器结构流程仪器结构流程 测量荧光的仪器主要由四个部分组成：激发光测量荧光的仪器主要由四个部分组成：激发光源、样品池、双单色器系统、检测器。源、样品池、双单色器系统、检测器。 特殊点特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。直角。12-3 12-3 荧光和磷光分析仪器荧光和磷光分析仪器202

20、2-5-30Instrument Analysis 化学化工学院32 基本流程如图：基本流程如图：(1)(1)光源：光源：灯和高压汞灯，染灯和高压汞灯，染料激光器料激光器( (可见与紫外区可见与紫外区) )(2)(2)试样池：石英材料制成，试样池：石英材料制成，四面透光。四面透光。(3)(3)单色器单色器：选择激发光波长选择激发光波长的第一单色器和选择发射光的第一单色器和选择发射光( (测量测量) )波长的第二单色器；波长的第二单色器；(4)检测器：检测器：光电倍增管。光电倍增管。2022-5-30Instrument Analysis 化学化工学院33磷光检测器磷光检测器 荧光计上配上磷光测

21、量附件即可对磷光进行测荧光计上配上磷光测量附件即可对磷光进行测量。在有荧光发射的同时测量磷光。量。在有荧光发射的同时测量磷光。 测量方法：测量方法：（1 1）通常借助于荧光和磷光寿命的差别，采用磷）通常借助于荧光和磷光寿命的差别，采用磷光镜的装置将荧光隔开。光镜的装置将荧光隔开。（2 2）采用脉冲光源和可控检测及时间分辨技术。）采用脉冲光源和可控检测及时间分辨技术。 室温测量时，不需要杜瓦瓶。室温测量时，不需要杜瓦瓶。2022-5-30Instrument Analysis 化学化工学院342022-5-30Instrument Analysis 化学化工学院35仪仪器器光光路路图图2022-

22、5-30Instrument Analysis 化学化工学院3612-4 12-4 荧光分析法磷光分析法的特点和应用荧光分析法磷光分析法的特点和应用1. 1. 特点特点（1 1）灵敏度高）灵敏度高：比紫外：比紫外- -可见分光光度法高可见分光光度法高2 24 4个个数量级。检测下限：数量级。检测下限：0.10.10.10.1 g/cmg/cm-3-3；相对灵敏度相对灵敏度：0.05mol/L 0.05mol/L 奎宁硫酸氢盐的硫酸溶液。奎宁硫酸氢盐的硫酸溶液。（2 2）选择性强）选择性强：既可依据特征发射光谱，又可根：既可依据特征发射光谱，又可根据特征吸收光谱；据特征吸收光谱；（3 3）试样量

23、少）试样量少 缺点缺点：应用范围小。：应用范围小。2022-5-30Instrument Analysis 化学化工学院372.2.荧光分析法和磷光分析法的应用荧光分析法和磷光分析法的应用（1 1）痕量分析）痕量分析（2 2）联用技术的检测器）联用技术的检测器（3 3）分子结构性能的测定）分子结构性能的测定2022-5-30Instrument Analysis 化学化工学院38(1)(1)无机化合物的分析无机化合物的分析 与有机试剂配合物后测量；可测量约与有机试剂配合物后测量；可测量约6060多种元素。多种元素。 铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法；铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采

24、用荧光分析法； 氟、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定；氟、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定； 铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定；铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定； 铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定；铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定； 铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定(2)(2)生物与有机化合物的分析生物与有机化合物的分析 见表见表 1）荧光分析法的应用）荧光分析法的应用2022-5-30Instrument Analysis 化学化工学院392022-5-30Instrument Analysis 化学化工学院402022-5

25、-30Instrument Analysis 化学化工学院412 2）磷光分析法的应用）磷光分析法的应用1.1.稠环芳烃分析稠环芳烃分析 采取固体表面室温磷光分析法快速灵敏测定稠采取固体表面室温磷光分析法快速灵敏测定稠环芳烃和杂环化合物（致癌物质）；见表环芳烃和杂环化合物（致癌物质）；见表2.2.农药、生物碱、植物生长激素的分析农药、生物碱、植物生长激素的分析 烟碱、降烟碱、新烟碱，烟碱、降烟碱、新烟碱，2 2，4-D4-D等分析等分析 检测限检测限0.01 0.01 g/cmg/cm-3-3 3.3.药物分析和临床分析药物分析和临床分析 见表见表2022-5-30Instrument Ana

26、lysis 化学化工学院422022-5-30Instrument Analysis 化学化工学院432022-5-30Instrument Analysis 化学化工学院4412-5 12-5 化学发光分析法化学发光分析法Chemiluminescence Analysis化学发光的反应，必须满足两个条件：化学发光的反应，必须满足两个条件：（1）化学反应必须提供足够的能量，又能被反应）化学反应必须提供足够的能量，又能被反应产物分子吸收，使之处于激发态。产物分子吸收，使之处于激发态。（2）处于激发态的分子，必须能释放出光子或能）处于激发态的分子，必须能释放出光子或能够将能量转移给另一个分子，使

27、该分子激发并以辐够将能量转移给另一个分子，使该分子激发并以辐射光子的形式回到基态。射光子的形式回到基态。2022-5-30Instrument Analysis 化学化工学院45 在化学反应过程中，某些化合物接受能量而被激在化学反应过程中，某些化合物接受能量而被激发，从激发态返回基态时，发射出一定波长的光。发，从激发态返回基态时，发射出一定波长的光。 A +B = C + D* D* D + h （1）能够发光的化合物大多为有机化合物，芳香族）能够发光的化合物大多为有机化合物，芳香族化合物；化合物；（2）化学发光反应多为氧化还原反应，激发能与反）化学发光反应多为氧化还原反应，激发能与反应能相当

28、应能相当 E=150400 kJ/mol；位于可见光区；位于可见光区；（3）发光持续时间较长，反应持续进行；发光持续时间较长，反应持续进行； 化学发光反应存在于生物体化学发光反应存在于生物体(萤火虫、海洋发光生萤火虫、海洋发光生物物)中，称生物发光中，称生物发光(bioluminescence)。2022-5-30Instrument Analysis 化学化工学院46化学发光强度与化学发光分析的依据化学发光强度与化学发光分析的依据 在化学发光分析中，被分析物相对于发光试剂小在化学发光分析中，被分析物相对于发光试剂小得多，得多，对于一级动力学反应：对于一级动力学反应： dc/dt =Kc； K

29、 为反应速率常数。为反应速率常数。定性依据：定性依据：（1 1）在一定条件下，峰值光）在一定条件下，峰值光强度与被测物浓度成线性；强度与被测物浓度成线性；2022-5-30Instrument Analysis 化学化工学院47（2）在一定条件下，在一定条件下，曲线下面积为发光总强度曲线下面积为发光总强度(S)，其其与被测物浓度成线性：与被测物浓度成线性： cttcttIAttcl0cl0cldddd液相中的化学发光反应液相中的化学发光反应机理研究较多，在分析中应用最多；可测痕量的机理研究较多，在分析中应用最多；可测痕量的H2O2 、Cu、Mn、Co、V、Fe、Cr、Ce、Hg、Th等。等。2

30、022-5-30Instrument Analysis 化学化工学院48 应用最多的发光试剂：鲁米诺（应用最多的发光试剂：鲁米诺（3-氨基苯二甲酰氨基苯二甲酰肼）；肼）； 化学发光反应效率：化学发光反应效率：0.150. 05； 鲁米诺在碱性溶液中与双氧水的反应过程：鲁米诺在碱性溶液中与双氧水的反应过程：2022-5-30Instrument Analysis 化学化工学院49 该发光反应速度慢，某些金属离子可催化反应该发光反应速度慢，某些金属离子可催化反应；利用这一现象可测定这些金属离子。；利用这一现象可测定这些金属离子。（1） 该发光反应速度慢，某些金属离子可催化反该发光反应速度慢，某些金

31、属离子可催化反应；利用这一现象可间接测定这些金属离子。可测应；利用这一现象可间接测定这些金属离子。可测痕量的痕量的Cu2+ 、Mn2+、Co2+、V4+、Fe2+、 Fe3+、 Ni2+、Ag+、Au3+、Hg2+等等化学与生物发光分析的应用化学与生物发光分析的应用2022-5-30Instrument Analysis 化学化工学院50氨基酸氨基酸 + O2 酮酸酮酸 +NH3 + H2O2 氨基酸氧化酶葡萄糖葡萄糖 + O2 + H2O 葡萄糖酸葡萄糖酸 + H2O2 通过测定生成的通过测定生成的H2O2 ，确定氨基酸、葡萄糖含量。，确定氨基酸、葡萄糖含量。葡萄糖氧化酶（2） 可检测低至可

32、检测低至 10-9 mol/L 的的H2O2；（3） 间接测定某些生物试样间接测定某些生物试样2022-5-30Instrument Analysis 化学化工学院51生物发光分析应用生物发光分析应用 1 1 在在pH 78；荧光素酶；荧光素酶(E)和和Mg2+的存在下，荧的存在下，荧光素光素(LH2)与磷酸三腺甙与磷酸三腺甙(ATP)的反应，生成磷酸腺的反应，生成磷酸腺甙甙(AMP)荧光素和荧光素酸的复合物和镁的焦磷酸荧光素和荧光素酸的复合物和镁的焦磷酸盐盐(ppi)： ATP + LH2 + E + Mg2+ AMP LH2 E +Mg ppi + 2H+pH7 - 8复合物与氧反应，产生化学发光：复合物与氧反应，产生化学发光：2022-5-30Instrument Analysis 化学化工学院52 AMP LH2 E + O2 氧化氧化荧光素荧光素* + AMP+C