环境微生物综合性实验报告

1、环境微生物综合性实验报告官洲河段不同断面微生物群落分布的测定见习类型专业见习院 别化学与环境学院专 业环境工程指导教师成文老师班 级2010级环境工程姓 名翟锦亮学 号201024001322012年12月目录1. 前言32. 实验方案与思路33. 实验方法3 3.1 仪器3 3.2 试剂 4 3.3内容44. 实验结果84.1 水样观察84.2 水样细菌总数的计算94.3 水样菌落的培养观察94.4 水样菌落数的计算114.5 微生物个体菌种形态的观察125. 实验分析135.1 实验结果分析135.2 实验存在问题145.3 实验改进意见156. 实验结论157. 实验收获15参考文献16

2、1. 前言微生物的群落结构与功能是微生物生态学的研究主题之一。水体中微生物与区域环境有着密切的联系,其数量及种群分布与水的类型、有机物含量、微生物的拮抗作用等多种因素密切相关。对它的研究将有助于了解水体的富营养现状及水域中C、N、P循环方式,并可为水体的整体治理方案提供依据2。本实验将大学城官洲河段到入珠江段分为三个断面（对照断面，控制断面，消减断面），在同一天同一时间段对各断面水体的水样分别采样比较，测定水体中微生物的种类和数量，了解官洲河段不同断面的水体中存在的微生物的种类和数量，分析各断面中微生物群落的分布特点，了解各断面水体污染情况以及污染物对水体中微生物群落的影响。2、实验方案与思路

3、2.1 采样容器的洗涤和灭菌2.2 水样的采集2.3 水样微生物的观察2.4 培养基的制备2.5 微生物的纯种分离与培养2.6 微生物菌种的革兰氏染色2.7 微生物菌种的观察与鉴定3.实验方法 3.1 实验仪器高压灭菌类：培养皿（12个）、试管（9支）、移液管（3支，1mL）、高压蒸汽灭菌器、锥形瓶（1个）制备培养基类：烧杯（1000mL）、药物天枰、玻璃棒、药匙、pH试纸、加热器、超净工作室、恒温培养箱观察类：显微镜、接种环、酒精灯、载玻片、盖玻片、血球计数板、滴管、烧杯、量筒（1个，10mL） 3.2 实验试剂肉膏胨淀粉培养基配方1：牛肉膏3g，蛋白胨10g，淀粉2g，氯化钠5g,琼脂15

4、-20g，蒸馏水1000mL，pH：7.47.8,。灭菌条件：0.101MPa(121oC，1520min)。革兰氏染色液一套：草酸铵结晶染色液，革兰氏碘液，体积分数为95%的乙醇，番红染液其他：去离子水、无菌水3.3实验内容 实验器材的洗涤与灭菌【1】将培养皿、试管、移液管用洗衣粉洗刷并用自来水冲洗干净，再用去离子水冲洗12次，然后用报纸包好放入高压蒸汽灭菌器中灭菌（121oC，相对蒸汽压力0.103MPa，1520min），灭菌后放入无菌室备用。水样的采集按下图所示分别到三个采样点进行采样。采样时，应小心开启包装纸或瓶盖，避免瓶盖或瓶颈受到杂菌污染。水样的保存为防止微生物发生质的改变, 装

5、好的样品瓶要在绝热箱中运送。当外界温度较高时还要冷却, 采样容器也不要受任何直接阳光照射, 以免紫外线杀死微生物。采好的水样应立即送往实验室, 一般从取样到检验不宜超过两小时, 否则应使用10oC以下的冷藏设备保存样品, 但不得超过6小时,实验室接到送检样品后, 应将样品立即放入冰箱, 并在两小时内进行检验, 如果因路途遥远, 送检时间超过6小时, 应考虑采用延迟培养法4。 水样微生物的观察与计数A.水样微生物的观察（1）观察比较从三个断面（对照断面、控制断面、削减断面）取回来的水样，简单描述三个水样的外观特征。（2）用压滴法分别制片观察三个断面的原水样水中微生物的种类、数量和形态。*压滴法制

6、片方法1：如下图所示，取一片干净的载玻片放在实验台上，用滴管吸取样品于载玻片中央，用干净的盖玻片覆盖在液滴上（注意不要有气泡）即成标本片，用低倍镜和高倍镜观察，要充分利用显微镜的移片夹的移动，注意观察微生物组成。 B.水样细菌总数的测定【1】（1）血球计数板的细胞计数 1）稀释：将样品稀释至合适的浓度，一般将样品稀释至每一中格约有1520个细胞数为宜。本实验为了方便操作，故直接使用用于水样细菌稀释培养的稀释水样观察。因此，水中微生物计数应该在水中微生物纯种分离之后，以防止污染稀释水样。 2）加被测水样至血球计数板：取已洗净的血球计数板，将盖玻片盖住中央计数室，用细口滴管吸取少量已经充分摇匀的稀

7、释水样于盖玻片的边缘，水样则自行渗入计数室，静止510min，待水样自然沉降并稳定后即可计数。实验过程中，可根据各断面水样的外观初步判断取用的稀释倍数。如控制断面的水样明显较浑浊，则应先选取1000倍的稀释液计数。3）计数：先用低倍镜寻找大方格网的位置，找到计数室后将其移至视野的中央，再换高倍镜观察和计数。需不断地上、下旋动细调节轮，以便看到计数室内不同深度的菌体。为了减少误差，所选的中格位置应布点均匀，如规格为25个中格的计数室，通常取4个角上的4个中格及中央的1个中格共5个中格进行计数。当样品的细胞数较少时，应计算所有中格的细胞数。（2）计算方法 结果计算：先求得每中格菌数的平均值，乘以中

8、格数（16或25），即为一大格（0.1mm3）中的总菌数，再乘以104，则为每毫升稀释液的总菌数。如要换算成原液的总菌数，乘以稀释倍数即可。两种不同规格的血球计数板的计算方法如下：16×25的计数板计算公式：细胞数（mL）（100小格内的细胞数/100）×400×10 000×稀释倍数25×16的计数板计算公式：细胞数（mL）（80小格内的细胞数/80）×400×10 000×稀释倍数培养基的制备a.成分：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂15-20g，淀粉2g，蒸馏水1000ml。b.方法：取牛肉膏0.5

9、g，加水100ml，再加入蛋白胨、氯化钠、加热使之完全溶解，调整pH值至7.27.4，分装，高压灭菌后备用。c.向灭菌后冷却至5060oC的培养皿倒入一定量的灭菌后的溶液，将培养皿放置于无菌室冷却备用。水样微生物的纯种分离与培养水样稀释取一个试管架，将9支高压灭菌过的试管依次摆好，分别贴上标签：水样断面+稀释倍数。在无菌操作条件下，用“十倍稀释法”【1】将三个水样分别稀释10、100、1000倍。稀释时，先在无菌试管中加入9mL无菌水，然后用无菌移液管移取1mL原水样于试管中，将移液管吹洗3次，塞上橡皮塞摇匀，即为10-1浓度的水样；用1mL移液管吸取1mL10-1浓度的水样于9mL无菌水中，

10、将移液管吹洗3次，摇匀，即为10-2浓度的水样；同理稀释得到浓度为10-3的水样；注意，每个水样只用一根移液管。稀释过程如图所示。 水样微生物的培养在超净工作室中，用1mL无菌移液管按从低浓度到高浓度的顺序分别移取1mL稀释倍数为1000倍、100倍、10倍以及原水样4个水样于制备好的培养基上，按“水样断面+稀释倍数”的格式贴上标签，然后将培养皿平放在桌上，顺时针和反时针来回转动培养皿，使培养基和菌液充分混匀，冷凝后即成平板，倒置于37oC的恒温培养箱中恒温培养2448h，然后观察结果。微生物菌种的革兰氏染色通过涂片染色观察微生物个体形态。用接种环按号码顺序选择几种细菌（单菌落）做涂片，进行革

11、兰氏染色，并作镜检，确定其革兰氏染色反应，并绘出其形态图。由于只做一次分离实验，得到的单菌落可能还不太纯，镜检时会出现多种形态。a.涂片、固定 干燥过程最好在空气中自然晾干，为了加速干燥，也可在微小火焰上方烘干。烘干后再在火焰上方快速通过34次，使菌体完全固定在载玻片上。但不宜在高温上长时间烤干，否则急速失去会使菌体变形。b.初染 滴加草酸铵结晶染色液染色12min，水洗。c.媒染滴加革兰氏碘液，染12min，水洗。d.脱色 滴加体积分数为95%的乙醇，约45s后即水洗；或滴加体积分数为95%的乙醇后将玻片摇晃几下即倾出乙醇，如此重复23次后即水洗。e.复染滴加沙黄液（番红），染23min，水

12、洗并使之干燥。微生物菌种的观察与鉴定 观察菌落的大小、形状、表面结构、隆起度、边缘结构、菌从高度、表面性状、颜色、透明度、气味、质地软硬情况、表面光滑与粗糙情况和干湿度等综合情况。将上述步骤染色的微生物按显微镜的操作步骤观察菌体形态，及时记录，并进行形态图的绘制。4、 实验结果4.1 水样观察（1）对照断面（小洲村）：水样较清，无色透明；用显微镜观察，可观察到很多藻类，藻类种类不多，体积比较大，以圆形藻，球形藻为主。（2）控制断面（中大）：水样呈浅绿色，可明显观察到有绿色丝状悬浮生物；用显微镜观察，可观察到很多不同种类的藻类；藻类的体积普遍比较小，形状有长杆状、链球状等。（3）削减断面（商业北

13、区）：水样无色，有轻微白色浑浊；用显微镜观察，可观察到藻类；藻类的种类不多，体积较大，以线状发散生长的藻类为主。4.2 水样细菌总数的计算水样来源中格1（个）中格2（个）中格3（个）中格4（个）中格5（个）平均值（个）总数（个/mL）对照断面（小洲）（稀释10倍）2012252921225.5×107控制断面（中大）（稀释1000倍）2642275819358.75×109削减断面（商业北区）（稀释100倍）2736332229307.5×108小结：各断面细菌总数关系：控制断面>削减断面>对照断面，说明水体污染程度越高，细菌总数越多。4.3 水样菌落

14、培养观察（1）对照断面（小洲村）：水样菌落培养基照片:说明：由于倒平板时水样扩散不均匀，所以恒温培养时培养基分离出来的菌落大多呈片状生长，分离出来的纯种菌落数目较少。4个培养基都有一定的臭味，以原水样培养基的臭味最浓；不同稀释浓度分离出的纯种菌落差异不大，下面挑选一些特征比较明显的菌落描述：特征编号菌落大小菌落形状菌落颜色边缘特征纵剖面特征表面（粗糙/光滑）菌落一中等粒状成团乳黄色不规则边缘波浪粗糙菌落二较大半球形乳黄色规则，圆滑边缘圆滑，高突起光滑（2）控制断面（中大）：水样菌落培养基照片:说明：4个培养基都有一定的臭味，以原水样培养基的臭味最浓。由于水样扩散不均，原水样和10倍稀释度的水样

15、菌落呈片状生长，没有分理出纯种菌落。100倍和1000倍稀释度的水样分离出的纯种菌落种类比较多，大小差异也比较大，下面挑选一些特征比较明显的菌落描述：特征编号菌落大小菌落形状菌落颜色边缘特征纵剖面特征表面（粗糙/光滑）菌落一较大针状成团乳黄色不规则有小突起粗糙菌落二较大半球状乳黄色规则隆起光滑菌落三较小球状黄色透明规则隆起光滑菌落四较小球状白色规则隆起光滑（3）削减断面（商业北区）：水样菌落培养基照片:说明：本组培养基的水样培养的比较好，有明显的纯种菌落独立分离出来。4个培养基都有一定的臭味，以原水样培养基的臭味最浓。随着稀释倍数的增大，培养基上的菌落数目也不断增加，各菌落的差异性也比较大，下

16、面挑选一些特征比较明显的菌落描述：特征编号菌落大小菌落形状菌落颜色边缘特征纵剖面特征表面（粗糙/光滑）其他菌落一较大圆形白色规则扁平光滑/菌落二较大圆形黄色规则扁平光滑中间有下凹点，枚红色菌落三中等球状乳黄色规则隆起光滑/菌落三较小球状黄色规则隆起光滑中间有一个枚红色的下凹点4.4 水样菌落数的计算：不同稀释倍数的菌落数/个菌落总数/（CFU/mL）报告方式/(CFU/mL)10倍100倍1000倍对照断面（小洲）无法计算32无法计算32003.2×103控制断面（中大）无法计算无法计算1861860001.9×105削减断面（商业北区）无法计算11430207002.1&

17、#215;104小结：随着断面污染程度的增加，培养基的菌落数目也随之增多。说明水体污染程度在一定程度上影响了水中微生物的数量与种类。4.5 微生物个体菌种形态的观察在三个水样的培养基中分别选出3个纯种菌落进行革兰氏染色观察，结果如下表所示：（1）对照断面（小洲）：细菌形态细菌颜色G+ /G-细菌图片菌落一链杆状紫红色革兰氏阴性菌落二圆形紫蓝色革兰氏阳性菌落三圆形紫红色革兰氏阴性（2）控制断面（中大）：细菌形态细菌颜色G+ /G-细菌图片菌落一长杆状紫红色革兰氏阴性菌落二圆形紫蓝色革兰氏阳性菌落三/紫蓝色革兰氏阳性（3）削减断面（商业北区）：细菌形态细菌颜色G+ /G-细菌图片菌落一短杆状紫蓝色

18、革兰氏阳性菌落三/紫蓝色革兰氏阳性5. 实验分析5.1 实验结果分析各断面的水体污染程度不同，其外观、微生物种类与数量、细菌总数、菌落种类与数量等各种参数都有明显的差异。从实验结果可见，控制断面的水体由于污染源来源最多，污染程度最深，因此各参数也最高；对照断面的水体污染程度最轻，因此各参数最低；削减断面由于河流本身的自净作用以及污染物的扩散减少，相对污染程度比控制断面低，各参数较之控制断面都明显降低。（1）查看资料可知,线虫是水体净化程度差的指示生物；钟虫、轮虫、苔藓虫都要求较高的溶解氧量，是污水生物处理效果好的指示生物；而胞囊是原生动物抵抗不良环境的休眠体。通过对水样的观察，发现三种水样中的

19、原生动物种类都差不多，无法通过原生动物的种类看出三种水样分别位于河流的哪一个位置。（2）同一水样，不同稀释倍数所培养的细菌种类各异，大小各异。虽随着稀释倍数的增加，菌落种类有减少，但无规律变化，菌落总数无较大区别。不同水样，细菌总数有明显的差异，所培养的菌落总数稍有差异，菌落种类也各有差异，水样三最多，水样二次之，水样三最少，但最后经染色观察，不同水样中的微生物形态无较大差异。造成的原因可能是水样不具代表性，或是实验操作不当，具体叙述如下。5.2 实验存在问题（1）水样采集：由于实验条件有限，因此各断面水样只能在岸边水面采集，采样地点位置不精准，因此水样代表性不够高。（2）水样观察：由于水样是

20、水面采集，所以在显微镜下观察到的微生物只有一些藻类，水体中比较常见的一些微生物无法看到。（3）细菌总数：由于水样不均匀，进行水体细菌总数计算时，往往会有一些沉淀、大颗粒干扰试验观察计数。（4）微生物培养：稀释水样时没有使用灭菌的无菌水，直接使用去离子水，破坏了无菌环境，给实验带来了较大误差。而且培养基恒温培养时，没有倒置培养基，导致大部分培养基出现积水问题，没能分离出纯种菌落。（5）革兰氏染色：部分菌种在革兰氏染色时不够均匀，无法看出菌种的具体形态。而且当脱色不完全时，整个视野都呈紫色，连细菌也找不到。（6）菌落种类和特征：三个断面的水体污染程度不同，理论上培养出来的菌落种类以及数量应该有明显

21、的差别。但是由于实验操作比较粗糙，所以三个水样培养出的菌落形态并没有明显的区别，而且革兰氏染色时观察到的细菌形态也没有明显的差别。5.3 实验改进意见（1） 改善取水条件，增加设备采样。（2） 显微镜观察前充分摇匀水样，以便观察结果更具代表性。（3）提高无菌操作精度，使用无菌水作稀释水。（4）恒温培养要严格倒置培养基，因此要等水样在培养基上风干再倒置在培养箱培养。（5）革兰氏染色要严格按步骤执行，每次脱色要完全，使每个涂片可以清晰分辨细菌形态颜色。6. 实验结论本实验对官洲河段三个断面的水体进行分析比较，从实验结果可知，水体污染程度：控制断面>削减断面>对照断面。同时，随着污染程度的不同，各水体的微生物群落分布也有差异，表