生物大分子仪器分析方法

1、仪器分析法的特点：（1）、仪器分析法一般都有较强的检测能力。方法的绝对检出限可达： 微克数量级（10_6g） 纳克数量级（10_9g） 皮克数量级（10_12g） 飞克数量级（10_15g） 方法的相对检出限可达：微克数量级每毫升（gml1）纳克每毫升（ ngml1 ）皮克每毫升（ pgml1 ）适于痕量组分（1%）及微量组分（0.01% 1%）的分析2）、仪器分析的取样量一般较少。固体：从 几mg 几g液体：从几 l 几 nl可用于微量分析（0.110mg 或0.011ml ）、超微量分析（0.1mg 或 0.1g 或10ml）和半微量分析 （0.01g0.1g 或 110ml）（3）、仪器

2、分析法具有很高的分析效率。如：流动注射AAS 120个样品/h，光电直读光谱仪 20个元素/min化学分析法分析效率较低一般为数min 数h，只能分析12个样品。4）、仪器分析具有更广泛的用途，不但可用于成分分析，而且也可用于价态分析、状态分析、结构分析、无损分析、表面分析 化学分析只能用于离线的成分分析。（5）、仪器分析法的准确度一般不如化学分析法。化学分析法的相对误差0.2%;仪器分析法的相对误差一般为15，甚至达到10%。（6）、仪器分析的仪器一般比较复杂；而化学分析所用设备比较简单。仪器分析的主要性能指标：精密度准确度灵敏度检出限标准曲线及其线性范围定量校准精密度：是指在规定的条件下同

3、一样品平行分析结果相互之间的接近程度。精密度一般用标准差和相对标准差（CV）表示。精密度有不同的表现方式，即重现性、重复性、中间精密度。重现性：是指在不同实验室，不同检测人员测定结果的精密度。中间精密度：是指在同一实验室中，不同时间由不同检测人员在不同检测设备上测定结果的精密度。重复性：是指在相同条件下，由一个分析人员重复测定所得结果计算出的精密度。准确度：是指用该方法平行测定所得的均数与样品真实值或参考值的吻合程度，一般用百分回收率表示。准确度是分析过程中系统误差和随机误差的综合反映，它决定着分析结果的可靠程度，方法有较好的精密度且消除了系统误差后，才有好的准确度。灵敏度：物质单位浓度或单位

4、质量的变化引起响应信号值变化的程度，用S表示。选择性：表示共存组分对待测组分分析的影响程度。共存组分影响愈小，方法对分析组分的选择性愈高。检出限：某一方法在给定的条件下能够检出被测物质的最小质量或最小浓度，称为这种方法对该物质的检出限。以浓度表示的叫相对检出限，以质量表示的叫绝对检出限。方法的灵敏度越高，精密度越好，检出限就越低。检出限是方法的灵敏度和精密度的综合指标，它是评价仪器性能及分析方法的主要技术指标。线性范围：是指在能够达到规定的精密度、准确度和线性的条件下，测试方法适用的最高到最低限待测物质浓度或量的区间。应根据分析方法的具体应用和线性、准确度、精密度的结果和要求来确定线性范围。仪

5、器定量校准方法：内标法和外标法内标法：标准物质和被测定物质不是同一物质外标法：标准物质与被测定物质是同一物质仪器分析的样品预处理：一、目的 使样品的状态和浓度适应所选择的分析技术二、原则 防止待测组分的损失； 避免引入干扰三、依据 物质性质（生物样品的有机分子或元素等） 干扰情况（是否需要分离等） 测定方法（是否需要富集等）四、步骤 样品的采集与制备 样品的提取与消解 样品的纯化与浓缩样品的衍生化一、明确目标样品的来源：发酵液、成品、三废杂质（干扰物质）：结构类似物、降解产物样品形式：固体、液体、气体、混合物样品中待测物质的浓度：灵敏度、浓度变化范围对分析结果的要求：稳定性、准确度、精确度等样

6、品分析的通量要求：操作时间要求成本要求二、收集信息（查阅文献）：待测物质的理化性质可能存在杂质的理化性质待测物质的标准/通用测定方法及其适用范围可选方法的理论基础阅读仪器的使用说明书三、预实验方案实验方案包括的内容：目的和意义、实验原理、实验方案、所需资源、日程安排、实验预期结果、参考文献预实验方案考察的因子：专一性、灵敏度、定量限、线性范围（初步）、操作通量四、实验操作实验操作的描述再怎么细致也不过分；实验操作过程前要注意操作条件的验证和确认；如：摇床温度30 实验操作要具有可重复性，不仅仅是自己可以在一定的误差范围内重复实验结果，同时其他人按照实验操作进行，可以得到同样的实验结果；在实验操

7、作上，细节决定成败！五、数据记录规范实验记录实验记录需要记录：实验思路、实验方法、实验设计、实验现象、原始数据、实验结果、结果讨论 实验记录就是一份完整的实验报告六、分析方法建立的完成，不是以可以测定某物质的浓度为标准，而是以完成该分析方法的SOP为标准SOP中必备的要素：分析方法建立的依据：国标、药典分析方法所需使用的仪器、设备、器皿样品的取样量设定（线性范围）详细的操作步骤（包括器皿的清洁方法）每个操作参数都有宽容度每个工艺条件都有数据支持方法验证的原始数据紫外-可见吸收光谱分析法紫外吸收光谱：分子价电子（最外层电子）能级跃迁。波长范围：100-760 nm.(1) 远紫外光区: 100-

8、200nm (2) 近紫外光区: 200-400nm(3)可见光区:400-760nm可用于结构鉴定和定量分析。按所吸收光的波长区域不同，分为紫外分光光度法(200-400nm)和可见分光光度法(400-760nm)，合称为紫外可见分光光度法(200-760nm)。紫外可见分光光度法特点：仪器设备和操作都比较简单，费用少，分析速度较快。灵敏度较高。有较好的选择性。通过适当地选择测量条件，一般可在多种组分共存的体系中，对某一种物质进行测定。精密度和准确度较高。在仪器设备和其他测量条件较好的情况下，其相对误差可减小到1一2。 用途广泛。医药、化工、冶金、环境保护、地质等诸多领域-已成为必不可少的测

9、试手段之一。无机和有机物质-定性和定量测定,结构分析。1. 分光光度法的定量依据是朗伯比耳定律（Lambert-Beers Law ） Alg（I0/I）KCL式中：I0为入射光强度； I为透射光强度； A为吸光度； L为液层厚度(即光程长度)； C为溶液浓度； K为吸光系数； 上式是朗伯比耳定律的数学表达式，其物理意义为：当一束平行单色光通过均匀的有色溶液时，溶液的吸光度与溶液的浓度和液层厚度的乘积成正比。基本组成：紫外-可见分光光度计与可见分光光度计的异同点：相同点：均遵守朗伯-比耳定律。不同点：（1） 测定波长范围不同：可见分光光度计是400-760nm。紫外可见分光光度计是200-76

10、0nm。（2）使用的光源不同：可见分光光度计使用的是钨丝灯或卤钨灯；紫外可见分光光度计在可见区使用的是钨丝灯或卤钨灯，在紫外区使用的是氘灯。（3）使用的吸收池不同：可见分光光度计使用的是玻璃比色皿；紫外可见分光光度计在可见区使用的是玻璃比色皿，在紫外区使用的是石英比色皿。（4）单色器中的色散元件不同：可见分光光度计使用的是玻璃棱镜；紫外可见分光光度计使用的是石英棱镜在蛋白质定量分析中的应用： 除经典的凯式定氮法外，很多蛋白质定量方法是利用紫外可见光谱法，常用的是以下几种： （1）酚试剂法：其原理是根据酚试剂与蛋白质中的芳香族氨基酸（色氨酸、酪氨酸）产生显色反应，反应液在可见区的吸光度与蛋白质含

11、量成正比。分析波长的选用与样品浓度有关：低浓度时可用750nm，高浓度时可用500nm。 （2）双缩脲法：其原理是蛋白质分子中的肽健在碱性溶液中能与二价铜离子形成兰色的络合物。分析波长可选用550nm。 （3）紫外吸收光谱测定蛋白质含量：其原理是蛋白质分子中的色氨酸和酪氨酸在280nm处有较强的吸收。此外还可用样品在215nm与225nm吸光度之差来测定蛋白质含量。双向电泳：Proteome (蛋白质组) : 1994年提出，最早见于文献是1995年7月的“Electrophoresis”杂志上。由1个细胞，或1种器官或组织的基因组所表达的全部相应的蛋白质。Proteomics（蛋白质组学）:

12、 研究在某个时间或某种特定条件下细胞或组织的蛋白表达及其活动规律的科学。蛋白质组具有多样性和可变性的特点（1）蛋白质的种类和数量在同一机体的不同细胞中是各不相同的。（2）同一细胞，在不同时期、不同条件下，蛋白质组也是在不断改变的。（3）在病理或治疗过程中，细胞蛋白质的组成及其变化与正常生理过程的也不同。二、蛋白质组学的研究内容1. 细胞或组织内蛋白质的表达模式及修饰（表达蛋白质组学） ：关键技术：2-D电泳2.蛋白质的胞内分布及移位（细胞图谱蛋白质组学）：确定蛋白质在亚细胞结构中的位置，通过纯化细胞器或用质谱仪鉴定蛋白复合物组成等。3.蛋白质的序列和高级结构（结构蛋白质组学）：X-射线单晶衍射

13、分析（晶体结构分析）、多维核磁共振波谱分析、电镜二维晶体三维重构术（电子晶体学）。4. 蛋白质的功能模式（功能蛋白质组学）：蛋白质与蛋白质及其与其他分子的相互作用。研究细胞或组织内蛋白质表达模式的技术： 2-D电泳 1. 1975年，Patrick OFarrel发明了二维凝胶电泳。 2. 操作（1）等电聚焦。（2）平衡胶条。（3）第二相SDS-PAGE。 （4）2-D胶上蛋白质鉴定 A 早期Western blot鉴定 B Edman降解法鉴定 C 肽质量指纹鉴定 D 蛋白质组信息学研究蛋白质功能模式的技术 酵母双杂交系统 选择性噬菌体感染技术 质谱技术蛋白质组学研究中的困难2-D电泳胶上的

14、点只是细胞蛋白质中的一小部分，大部分不 能被显示。 2-D胶上显示的蛋白质有偏向性。难溶于水或分子量大于18万的蛋白质难于在2-D胶上显示。 质谱技术虽有较高的灵敏度，但对来自2-D胶上的许多低丰度的蛋白质仍不能鉴定。溶解所有的蛋白质，包括疏水性蛋白避免溶解性低的蛋白在等电聚焦时由于溶解度降低而沉淀析出防止蛋白质的化学修饰排除核酸，多糖，脂类和其他干扰分子细胞破碎方法细胞器的分离一般采用差速离心法，即将破碎后的细胞在适当的介质中进行离心，常用的介质有蔗糖、甘露醇、柠檬酸、聚乙二醇等。第一向等电聚焦pH 梯度选择: 固相干胶条的种类:第二向SDS-PAGESDS 十二烷基硫酸钠：断裂分子内和分子

15、间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，使蛋白质变性.强还原剂：使半胱氨酸之间的二硫键断裂，由于SDS与蛋白质的结合是按质量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。染色:考染法 银染法 荧光染料法 放射自显影毛细管电泳分离技术原理 是经典电泳技术与现代微柱分离相结合的产物.是离子或荷电粒子以电场为驱动力,在毛细管中按其淌度或/和分配系数不同进行高效,快速分离的一种电泳新技术.特点 由于毛细管具有良好的散热效能,允许在窄内径毛细管两端加上高达30kV的高电压,分离毛细管的纵向电场强度可达400V/cm以上,可以在很短的时间内达到很高的分离效率,具有以下特点: (1)分离速度快

16、(高压,高电场强度)在3.1min内分离36种无机及有机阴离子,4.1min内分离了24种阳离子(2)分离效率高(3)运行成本低 (4)样品与试剂消耗量少(150nL)(5)可供选择的分离模式多,应用范围广 (6)分离一般在水溶液介质中进行 (7)方法简单,仪器自动化程度高 (8)环境污染小 进样方式:流体动力学进样 也称为虹吸进样、压差进样;电动进样 也称电迁移进样分离模式 1 毛细管区带电泳:样品在电解液中泳动,根据物质的荷/质比差异来进行分离,比值愈大,跑得愈快. 带电粒子的迁移速度=电泳和电渗流速度的矢量和。;最基本、应用广的分离模式 2 胶束电动色谱: 3 毛细管凝胶电泳; 4 毛细

17、管等速电泳 5 毛细管等电聚焦; 6 毛细管电色谱:电渗是指在电场作用下，毛细管或固相多孔物质内液体沿固体表面移动的现象。电渗流的方向取决于毛细管内表面电荷的性质:内表面带负电荷,溶液带正电荷,电渗流流向阴极;内表面带正电荷,溶液带负电荷,电渗流流向阳极;毛细管电泳的应用:1. 阴离子分析2.药物分析3.手性化合物分析4. 氨基酸与蛋白质分析5.核酸分析及DNA排序实时荧光定量PCR定义：在PCR反应体系中加入荧光基团, 利用荧光信号累积实现了实时监测, 整个PCR进程，对起始模板进行定量分析的方法。常规PCR技术：对PCR扩增反应的终产物进行定量及定性分析定量PCR技术：对PCR扩增反应中每

18、一个循环的产物进行定量及定性分析荧光定量PCR常用的三个概念扩增曲线、阈值、Ct值（1）扩增曲线的两种形式随着PCR 反应的进行相应的荧光信号的变化，比较直观，但是指数期很短.（2）阈值线在荧光定量PCR扩增的指数期，画一条线，在此直线上，所有样品的荧光强度与其本底荧光强度的差值全部相同。(3)Ct值的定义：扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环数。相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定；Ct值则极具重现性3、荧光定量PCR的化学基础荧光定量PCR是随着PCR循环的进行，以荧光信号强度的积累来实时反映PCR反应进程的。理想的荧光物质需具备以下特点： 本底低 荧光强度高 每轮PC

19、R反应完成后都有荧光强度的增高，而且这种荧光强度的增高和每轮循环后PCR产物的量成线性关系 没有PCR产物时，没有荧光 该荧光物质的受激发后其发射光的波长范围窄，各种荧光不会产生荧光的交叉干扰最后结论：Log X0与Ct呈线性关系，根据样品扩增的Ct值就可计算出样品中所含的模板量确定初始模板的浓度初始DNA量越多, 荧光达到某一值（域值）时所需要的循环数越少Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数就可计算出样品中所含的模板量工作原理:1、荧光染料类：目前常用的荧光染料为SYBR Green、SYBR Green、SYTO9、HRM等。其共同性质为：（a）结合于双链核酸的小沟处

20、（b）与双链DNA结合后受激产生荧光（c）在变性条件下双链分开，荧光消失SYBR Green法工作原理:SYBR Green只有和双链DNA结合后才发荧光l变性时，DNA双链分开，无荧光l在延伸结束阶段采集荧光信号。l SYBR Green也能和非特异的双链DNA结合发光，所以必须在反应结束时做熔解曲线分析。熔解曲线(Dissociation curve)：随温度升高DNA的双螺旋结构降解程度的曲线。总的DNA双螺旋结构降解一半的温度称为熔解温度（Tm），不同序列的DNA，Tm值不同。DNA中GC含量越高，Tm值越高，成正比关系2、荧光探针类（1）TaqMan-水解型杂交探针TaqMan法工作

21、原理:l5端标记有报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等l3端标记有荧光淬灭基团(Quencher, Q)l探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光，R与Q分开，发荧光lTaq酶有53外切核酸酶活性，可水解探针TaqMan法应用:l定量起始模板浓度 基因型分析 产物鉴定 SNP分析l绝对定量检测起始模板数的精确拷贝数:标准曲线法l相对定量是确定经过不同处理的样本之间基因的表达差异双标准曲线法绝对定量通过标准品定量绝对定量的标准样品：已知拷贝数的质粒DNA，做系列稀释。标准样品的种类：含有和待测样品相同扩增片段的克隆质粒含有和待测样品相同扩增片段的cDNAPCR的产物相

22、对定量通过内标定量l内标通常是-actin、GAPDH基因等看家基因l在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响小l内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量（1）双标准曲线法所谓的双标准曲线法就是对每个样品的内参基因和目的基因都做绝对定量，求出每个样品中内参基因和目的基因的绝对数量，然后根据相对定量的基本公式来求出目的基因的差异表达。 1、理想的内参基因具有的特点（1）不存在假基因；（2）高度或中度表达，排除太高或低表达（3）稳定表达于不同类型的细胞和组织(如正常细胞和癌细胞)，而且其表达量是近似的，无显著性差别；（4）表达水平与细胞周期以及细胞是否活化无关；（5）其稳定的表

23、达水平与目标基因相似；（6）不受任何内源性或外源性因素的影响，如不受任何实验处理措施的影响。理想的内参基因很少或者说不存在，因为所有基因在不同的细胞或组织中、在细胞的不同生理时期、在不同的理化等外界刺激下，其表达量都会有所差异，有时可以是几倍、几十倍甚至是上百倍的差异。盲目地使用一种看家基因作为内参，一方面可能使基因表达的微小差异难以发现，另一方面可能引致错误甚至相反的结论。3、内参基因的选择策略根据实验的实际情况，不同组织、不同细胞、细胞的不同生理时期、不同的理化条件刺激等，查阅相关资料，选取三、四合适的内参基因，做荧光定量PCR，先以CT值最小的那条基因作为内参，其他几条内参基因与其相比，

24、分析所得的比值，找出比值稳定的几条基因，比值稳定说明该基因表达稳定，适合作为理想的内参。对于比较精确的实验，最好采用两种或两种以上表达稳定的基因作为内参，对每种内参基因测得的基因表达变化求方差和平均值。也可用geNorm内参分析软件来选择合适的内参基因:1、染料法引物的设计原则：（1）序列选取应在基因的保守区段，不能有碱基变异；（2）避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对，避免引物自身形成环状发卡结构；（3）检测mRNA时，为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显子；（4）引物之间的TM相差避免超过2；（5）典型的引物18到24个核苷长；（6）目的基因和内参基因所扩增的PCR产

25、物长度尽量一致，不大于300bp，这样有利于使两种基因PCR效率相同；（7）将设计好的引物用序列分析软件分析其二级结构并做BLAST分析其特异性。2、Taqman探针及引物的设计原则：（1）序列选取应在基因的保守区段，不能有碱基变异；（2）检测mRNA时，为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显子；（3）引物TM值为60左右，探针的TM值为70左右；（4）探针的5端应避免使用鸟嘌呤G，因为5G会有淬灭作用，而且即使是被切割下来还会存在淬灭作用；（5）整条探针中，碱基C的含量要明显高于G的含量G含量高会降低反应效率，这时就应选择配对的另一条链作为探针；（6）引物之间的TM相差避免超过2；（7

26、）典型的引物长度为18-24bp，探针长度为15-45bp；（8）PCR产物长度在50-150bp之间，这样有利于使PCR效率相同；（9）将设计好的引物用序列分析软件分析其二级结构并做BLAST分析其特异性色谱技术作用力包括：吸附力；溶解能力；离子交换能力；渗透能力等。（一）、固定相和流动相的状态分类气相色谱（GC）气固色谱：流动相为气体 固定相为固体吸附剂气液色谱：流动相为气体，固定相为液体（涂在担体上或毛细管壁上）液相色谱（LC）液固色谱：流动相为液体 固定相为固体吸附剂液液色谱：流动相为液体 固定相为液体（涂在担体上）（二）、按样品组分在两相间分离机理分类（1）吸附色谱：利用吸附剂表面对

27、被分离的各组分吸附能力不同进行分离。（2）分配色谱：利用不同组分在两相分配系数或溶解度不同进行分离。（3）离子交换色谱：利用不同组分对离子交换剂亲和力不同进行分离。（4）凝胶色谱：利用凝胶对分子的大小和形状不同的组分所产生的阻碍作用不同而进行分离的色谱法。（三）、按操作形式分类(1）柱色谱：填充柱色谱固定相填充到柱管内毛细管柱色谱把固定相涂在毛细管内壁上， 中间是空的。（2）纸色谱：滤纸为固定相的色谱法，流动相是含一定比例水的有机溶剂，样品在滤纸上展开进行分离。（3）薄层色谱：把固体固定相压成或涂成薄膜的色谱法。三、色谱法的特点（1）分离效率高复杂混合物，有机同系物、异构体。手性异构体。（2）

28、灵敏度高可以检测出g.g-1(10-6)级甚至ng.g-1(10-9)级的物质量。（3）分析速度快一般在几分钟或几十分钟内可以完成一个试样的分析。（4）应用范围广气相色谱：沸点低于400的各种有机或无机试样的分析。液相色谱：高沸点、热不稳定、生物试样的分离分析。不足之处：被分离组分的定性较为困难。气相色谱仪:常用的载气有：氢气、氮气、氦气液体进样器：不同规格的专用注射器，填充柱色谱常用10L；毛细管色谱常用1L；新型仪器带有全自动液体进样器，清洗、润冲、取样、进样、换样等过程自动完成，一次可放置数十个试样。气化室：将液体试样瞬间气化的装置。无催化作用。检测器：广普型对所有物质均有响应；专属型对

29、特定物质有高灵敏响应；常用的检测器：热导检测器、氢火焰离子化检测器 温度控制系统温度是色谱分离条件的重要选择参数；气化室、分离室、检测器三部分在色谱仪操作时均需控制温度；气化室：保证液体试样瞬间气化；分离室：准确控制分离需要的温度。当试样复杂时，分离室温度需要按一定程序控制温度变化，各组分在最佳温度下分离；检测器：保证被分离后的组分通过时不在此冷凝；高效液相色谱法液-固吸附色谱固定相：固体吸附剂为，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是510m的硅胶吸附剂；流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸；适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有官能团的化合物和异

30、构体有较高选择性；缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾；液-液分配色谱固定相与流动相均为液体（互不相溶）；基本原理：组分在固定相和流动相上的分配；流动相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定液的极性（正相 normal phase），反之，流动相的极性大于固定液的极性（反相 reverse phase）。正相与反相的出峰顺序相反；固定相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用；压力：150350105 Pa 为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（ 甲酰胺 乙腈 甲醇 乙醇 丙醇 丙酮 二氧六环 四氢呋喃 甲乙酮 正丁醇 乙酸乙酯 乙醚 异丙醚 二氯甲烷氯仿溴乙烷苯四氯化碳二硫

31、化碳环己烷己烷煤油(最小)排阻色谱固定相：凝胶(具有一定大小孔隙分布)；原理：按分子大小分离。小分子可以扩散到凝胶空隙，由其中通过，出峰最慢；中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰。可对相对分子质量在100-105范围内的化合物按质量分离离子色谱:根据三种不同分离机理，离子色谱可分为以下三种：离子交换色谱（HPIC） 离子排斥色谱（HPIEC） 离子对色谱（MPIC）离子交换色谱基本原理HPIC的分离机理主要是离子交换，是基于离子交换树脂上可离解的离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子之间进行的可逆交换，依据这些离子对交换剂（固定相）有不同

32、的亲和力而被分离.固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂；流动相：阴离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；阳离子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液；阳离子、阴离子对固定相亲和力（保留时间）大小的顺序：碱金属的亲和力顺序为：Cs+Rb+K+Na+Li+碱土金属的亲和力顺序为：Ba2+Sr2+Ca2+Mg2+卤素离子的亲和力顺序为：I-Br-Cl-F-对无机和有机阴离子，一般是有机阴离子和一价无机阴离子先出峰，二价和三价的无机阴离子和有机酸后出峰，价数越高保留越强，出峰时间越长。常见阴阳离子的出峰顺序：F-、Cl-、NO2-、SO42-、Br-、NO3-、PO43- 、 Li+、Na

33、+、NH4+、K+、Mg2+、Ca2+离子色谱与高效液相色谱相同的是：离子色谱系统的组成与HPLC相同。仪器由流动相传送部分、分离柱、检测器和数据处理四个部分组成。离子色谱与高效液相色谱不同的是：1离子色谱有抑制器和电导检测器2离子色谱用的管路、阀门、泵、柱子及接头等要求耐酸碱腐蚀，为匹克（PEEK）材料全塑系统。3离子色谱的流动相一般是酸、碱和缓冲溶液或者含有少量的有机试剂（甲醇、乙腈）。主要分离极性和部分弱极性的化合物。4的流动相一般是水、缓冲溶液和有机试剂。主要分离非极性的有机化合物。离子交换色谱系统中的主要部分：1. 淋洗液2. 分离柱3. 检测器4. 抑制器1 淋洗液：阴离子分析：氢

34、氧化物、硼酸盐、碳酸盐等。阳离子分析：硫酸、甲基磺酸等。2. 分离柱 柱填料是由苯乙烯-二乙烯基苯共聚物制得的离子交换树脂。3. 检测器电化学检测器（电导、安培）光学检测器（紫外-可见、荧光）。电导检测器主要用于有机和无机阴离子和阳离子的测定安培检测器用于糖类、氨基酸的检测；紫外检测器主要用于多价阴离子、硅、过渡金属、重金属和稀有元素的测定；荧光检测器主要用于氨基酸的分析。4.抑制器阳离子抑制器阴离子抑制器主要作用：1）降低淋洗液的背景电导2）增加被测离子的电导值(增加灵敏度)，改善信噪比离子色谱的优点：1.快速、方便：一般10min即可分别完成阴、阳离子的剖面。2.灵敏度高：直接进样可达pp

35、b级，用浓缩柱可达ppt级。3.选择性好：已有多种成熟的固定相，以及选择性的检测器。4.可同时分析多种离子化合物。5.分离柱的稳定性好、容量高：柱填料在广的PH范围内和对有机试剂的稳定性，广的应用范围及对复杂基体分析的可行性。 质谱技术质谱的种类vGCMS 气相色谱质谱联用仪Gas Chromatography Mass SpectrometryvLCMS 液相色谱质谱联用仪Liquid Chromatography Mass Spectrometryv飞行时间质谱仪Time of Flight Mass Spectrometryv磁质谱Magnetic Sector Mass Spectro

36、metryv二次离子质谱SIMSSecond Ion Mass Spectrometry质谱法是将被测物质离子化，按离子的质核比分离，测量各种离子峰的强度而实现分析目的的一种方法。质量是物质的固有特征之一，不同的物质有不同的质量谱质谱，利用这一性质可进行定性分析；利用谱峰的强度可做定量分析。质谱仪的基本构成电子电离源(EI) 化学电离源(CI) 电喷雾离子化(ESI) 大气压化学离子化(APCI)电子电离源(EI)一定能量的电子碰撞气态或蒸汽态样品，使样品产生电离。M + e-= M+ 2e- M+=F+ A （碎片离子）一般有机化合物的电离电位是10eV左右，而I电离常用能量是0eV，样品分子获较高能量，分子离子进一步破裂成碎片离子。故称“硬电离技术”。优点：l 应用范围最广，样品能气化即能被电离，离子化效率高，灵敏度高，EI谱提供丰富结构信息，可分析化合物结构。缺点：l 不适于难挥发，热不稳定样品，分子离子易破碎，得不到分子量信息，谱图复杂。流式细胞技术流