第三章 吸附层析

1、 第三章第三章 吸附层析吸附层析 层析又称为层析又称为色谱或色层色谱或色层，是俄国植物学家，是俄国植物学家茨维茨维特特在分离植物色素时发现并最先应用的一种分离在分离植物色素时发现并最先应用的一种分离纯化方法。其纯化方法。其总的原理总的原理是根据各种被分离组分在是根据各种被分离组分在固定相和流动相的固定相和流动相的分配系数分配系数不同达到分离的目的。不同达到分离的目的。 层析法层析法根据层析类型根据层析类型分，可分为柱层析、纸层析和分，可分为柱层析、纸层析和薄层层析；薄层层析；根据具体分离原理根据具体分离原理分，可分为吸附层析、分分，可分为吸附层析、分配层析、疏水层析、离子交换层析、亲和层析、凝

2、胶过配层析、疏水层析、离子交换层析、亲和层析、凝胶过滤层析等具体层析方法滤层析等具体层析方法 吸附层析（吸附层析（absorption chromatographyabsorption chromatography）又又称色层法或色谱法；是根据各种被分离组分在固称色层法或色谱法；是根据各种被分离组分在固定相和流动相的分配系数不同达到分离的目的一定相和流动相的分配系数不同达到分离的目的一类分离纯化方法。类分离纯化方法。吸附层析的概念吸附层析的概念 教学目的教学目的掌握掌握基本原理和操作方法基本原理和操作方法 吸附柱层析吸附柱层析薄层层析薄层层析聚酰胺薄层层析聚酰胺薄层层析 层析方法的类型层析方法

3、的类型 第一节第一节 吸附柱层析吸附柱层析 吸附柱层析是以吸附柱层析是以固体吸附剂固体吸附剂为固定相制为固定相制备成色谱柱，以备成色谱柱，以有机溶剂或缓冲液有机溶剂或缓冲液为流动相，为流动相，用于分离纯化的一种层析方法用于分离纯化的一种层析方法 。吸附柱层析的概念吸附柱层析的概念吸附层析的吸附层析的固定相固定相极性极性: :如羟基磷灰石、硅胶、氧化铝、人造沸石等如羟基磷灰石、硅胶、氧化铝、人造沸石等非极性：如活性碳等非极性：如活性碳等流动相通常为有机溶剂或缓冲液流动相通常为有机溶剂或缓冲液一、常一、常 用用 术术 语语 1 1固定相固定相 固定相是由层析基质组成的。其基质包括固体物固定相是由层

4、析基质组成的。其基质包括固体物质质( (如吸附剂、离子交换剂如吸附剂、离子交换剂) )和液体物质和液体物质( (如固定在如固定在纤维素或硅胶上的溶液纤维素或硅胶上的溶液) )，这些物质，这些物质能与相关的化能与相关的化合物进行可逆性的吸附、溶解和交换作用合物进行可逆性的吸附、溶解和交换作用n2 2流动相流动相n 在层析过程中推动固定相上的物质向一定在层析过程中推动固定相上的物质向一定方向移动的液体或气体。在柱层析中又称为方向移动的液体或气体。在柱层析中又称为洗洗脱剂或洗涤剂脱剂或洗涤剂；在薄层层析中又称为；在薄层层析中又称为展开剂展开剂3 3层析层析 以基质为固定相以基质为固定相( (柱状或薄

5、层状柱状或薄层状) )，以液体或，以液体或气体为流动相，使有效成分和杂质在这两个相中气体为流动相，使有效成分和杂质在这两个相中连续多次地进行分配、吸附或交换，最终使混合连续多次地进行分配、吸附或交换，最终使混合物得到分离的过程。物得到分离的过程。4 4操作容量操作容量 是反映基质（固定相）对某种成分的结合能是反映基质（固定相）对某种成分的结合能力的指标；它表示在特定条件下，某种成分与基力的指标；它表示在特定条件下，某种成分与基质反应达到平衡时，存在于基质上的饱和容量，质反应达到平衡时，存在于基质上的饱和容量，一般以每克一般以每克( (或毫升或毫升) )基质结合某种成分的毫摩尔基质结合某种成分的

6、毫摩尔数或毫克数来表示。数或毫克数来表示。其数值大，表明基质对某种其数值大，表明基质对某种成分的结合力强；否则反之。成分的结合力强；否则反之。5 5床体积床体积( (V Vt t) ) 是指膨胀后的基质在层析柱中所占有是指膨胀后的基质在层析柱中所占有的体积的体积( (V Vt t) )。它是基质的外水体积它是基质的外水体积( (V Vo o) )和内水体积和内水体积( (V Vi i) )以及自身体积以及自身体积( (V Vg g) )的总的总和，详见图和，详见图3-13-1，即，即V=VV=Vo o+V+Vi i+V+Vg gn6洗脱体积洗脱体积(Ve)n 是指某一成分从柱顶部到底部的洗脱液

7、中是指某一成分从柱顶部到底部的洗脱液中出现浓度达到最大值时的流动相体积。用出现浓度达到最大值时的流动相体积。用V Ve e 表示表示( (见图见图3-73-7中中OB) OB) 7 7外水体积外水体积( (V Vo o) ) 外水体积指基质颗粒之间体积的总和外水体积指基质颗粒之间体积的总和8 8内水体积内水体积( (V Vi i) ) 内水体积是指基质颗粒内部体积的总和内水体积是指基质颗粒内部体积的总和 9基质体积基质体积(Vg) 基质体积是指基质自身所具有的体积。基质体积是指基质自身所具有的体积。 V Vo o、V Vi i和和V Vg g都是随着床体积和基质性质变化而都是随着床体积和基质性

8、质变化而变化的变化的1010膨胀度膨胀度 在一定溶液中，单位重量的基质充分溶胀后所占有的体积在一定溶液中，单位重量的基质充分溶胀后所占有的体积（用（用V V表示）。即每克溶胀基质所具有的床体积表示）。即每克溶胀基质所具有的床体积 一般亲水性基质的膨胀度比疏水性的大一般亲水性基质的膨胀度比疏水性的大1111分配系数分配系数 是指一组分在固定相与流动相中含量的比值，常用是指一组分在固定相与流动相中含量的比值，常用K K表示表示12.12.迁移率迁移率 指一组分在相同时间内，在固定相移动的距离与流动相移指一组分在相同时间内，在固定相移动的距离与流动相移动距离之比值。常用动距离之比值。常用R Rf f

9、表示表示 二、基本原理二、基本原理 利用被分离样品中利用被分离样品中不同组分与吸附剂之间吸附能力不同组分与吸附剂之间吸附能力的的差异（或各组分的分配系数不同）进行分离。吸附能力大差异（或各组分的分配系数不同）进行分离。吸附能力大（或分配系数大）的组分在柱子上的保留时间长，吸附能力（或分配系数大）的组分在柱子上的保留时间长，吸附能力小（或分配系数小）的组分很快被洗脱。小（或分配系数小）的组分很快被洗脱。 混合物在层析柱中分离的过程实质上是吸附与解吸附的过混合物在层析柱中分离的过程实质上是吸附与解吸附的过程程三、吸三、吸 附附 剂剂 （一）吸附剂的选择（一）吸附剂的选择1.1.具备条件：具备条件：

10、表面积大、吸附选择性好、稳定性强、成本表面积大、吸附选择性好、稳定性强、成本低廉等低廉等2.2.选择原则：由吸附剂本身和被吸附物质的理化性质而定。选择原则：由吸附剂本身和被吸附物质的理化性质而定。根据根据“相似相溶相似相溶”原理，为了便于解吸附（洗脱），对于原理，为了便于解吸附（洗脱），对于极性强的分离物，应选择极性小的吸附剂；而对于极性弱极性强的分离物，应选择极性小的吸附剂；而对于极性弱的分离物则选择极性强的吸附剂。的分离物则选择极性强的吸附剂。（二）吸附剂的性质（二）吸附剂的性质2020世纪世纪5050年代初期，年代初期，TiseliusTiselius等用制备的羟基磷等用制备的羟基磷灰石

11、灰石 CaCa5 5(P0(P04 4) )3 3OHOH2 2（HAHA）分离蛋白质。目前国内）分离蛋白质。目前国内已有商品出售已有商品出售 1.羟基磷灰石羟基磷灰石 （1）性质）性质 吸附容量高吸附容量高稳定性好（稳定性好（T T8585，pH5.510.0pH5.510.0均可使用）均可使用）使用广泛（可用于制备和纯化使用广泛（可用于制备和纯化propro、酶、核酸等）、酶、核酸等）分离效果好分离效果好HAHA的的CaCa基团与生物分子表面的负电荷基团的作用，基团与生物分子表面的负电荷基团的作用，对分离起重要作用；而对分离起重要作用；而POPO4 4基团与生物分子表面的正基团与生物分子表

12、面的正电荷的作用仅起次要作用电荷的作用仅起次要作用u使用使用HA作为固定相基质时应注意作为固定相基质时应注意HAHA为干粉时，需事先浸泡膨胀达到为干粉时，需事先浸泡膨胀达到23ml/g23ml/g后，按后，按1616加加入缓冲液悬浮，除去细小的颗粒入缓冲液悬浮，除去细小的颗粒HAHA悬浮液需用旋涡振荡器混合，因为其他搅拌器如磁棒、悬浮液需用旋涡振荡器混合，因为其他搅拌器如磁棒、玻棒等易破坏其晶体结构玻棒等易破坏其晶体结构忌用柠檬酸缓冲液和忌用柠檬酸缓冲液和pHpH5.55.5的缓冲液处理的缓冲液处理色谱柱再生时，先用色谱柱再生时，先用1 mol/L NaCl1 mol/L NaCl洗涤，然后用

13、洗涤，然后用4 4倍床体倍床体积的平衡缓冲液冲洗即可积的平衡缓冲液冲洗即可细颗粒细颗粒HAHA的操作容量和分辨率均较大颗粒高，但须采用较的操作容量和分辨率均较大颗粒高，但须采用较大直径的柱子大直径的柱子2.2.硅胶硅胶（1）性质）性质含水量：含水量高，则吸附性（活性）小，当含水量：含水量高，则吸附性（活性）小，当其表面游离水含量其表面游离水含量17%17%时，其结合力很小；此时时，其结合力很小；此时仅能作为分配层析的固定相仅能作为分配层析的固定相粒度：粒度小，则分离效果较好（如用粒度：粒度小，则分离效果较好（如用200400200400目的硅胶能有效地分离多种主物的有效成分）目的硅胶能有效地分

14、离多种主物的有效成分）（2 2）活化：）活化：110110烘烤烘烤0.51h0.51h。活化后立即使用或短期贮存。活化后立即使用或短期贮存与干燥器中与干燥器中四、洗脱剂四、洗脱剂条件条件 纯度较高纯度较高稳定性好稳定性好能较完全地洗脱下被分离的成分能较完全地洗脱下被分离的成分黏度小黏度小易和所需的成分分开易和所需的成分分开选择洗脱剂的顺序应从极性小选择洗脱剂的顺序应从极性小 大大 一般，一般，pro或核酸被极性强的或核酸被极性强的HA吸附后，要用含有吸附后，要用含有盐梯度的缓冲液洗脱；而甾体、色素等化合物被极性较盐梯度的缓冲液洗脱；而甾体、色素等化合物被极性较弱的硅胶吸附后，则可用有机溶剂洗脱

15、。弱的硅胶吸附后，则可用有机溶剂洗脱。五、层析柱的制备和层析操作五、层析柱的制备和层析操作（一）层析柱（一）层析柱 层析柱是下端为细口并带有筛板的玻管。柱子的直径层析柱是下端为细口并带有筛板的玻管。柱子的直径与长度之比一般为与长度之比一般为110110- -140140；吸附剂颗粒极细时，宜选用；吸附剂颗粒极细时，宜选用大比例（粗）的层析柱，反之用细层析柱，这样可节省时间大比例（粗）的层析柱，反之用细层析柱，这样可节省时间和提高分辨率。层析柱的床体积由吸附剂的量和膨胀度决定和提高分辨率。层析柱的床体积由吸附剂的量和膨胀度决定n 吸附剂的用量主要由吸附剂自身的操作容量和分离物吸附剂的用量主要由吸

16、附剂自身的操作容量和分离物中各成分的性质决定（一般为被分离样品的中各成分的性质决定（一般为被分离样品的3030- -5050倍）。倍）。n当操作容量小时，则吸附剂用量要大；另外，当样品中各当操作容量小时，则吸附剂用量要大；另外，当样品中各组分的性质相似，难以分开时，应加大吸附剂的用量，有组分的性质相似，难以分开时，应加大吸附剂的用量，有时甚至超过时甚至超过100100倍。倍。（二）吸附剂的用量（二）吸附剂的用量（三）装柱（三）装柱1.干法装柱干法装柱 直接加吸附剂至柱中，然后倒入溶剂，此法直接加吸附剂至柱中，然后倒入溶剂，此法不易排尽气泡，容易导致层析不均匀不易排尽气泡，容易导致层析不均匀2.

17、湿法装柱湿法装柱 先加适量溶剂至柱内，排走空气，然后将预先浸泡先加适量溶剂至柱内，排走空气，然后将预先浸泡好的吸附剂搅均，随即将此混悬液倾入柱中（图好的吸附剂搅均，随即将此混悬液倾入柱中（图3-53-5）；）；待其自然沉淀至柱高的待其自然沉淀至柱高的1/4 1/4 - - 1/3 1/3 时，打开下端出口，时，打开下端出口，让溶剂慢慢流出，使柱子上端悬浮液徐徐下降至需要的让溶剂慢慢流出，使柱子上端悬浮液徐徐下降至需要的高度；并用高度；并用2 2- -3 3倍量的洗脱剂流过层析柱，使其达到平衡倍量的洗脱剂流过层析柱，使其达到平衡注：注：吸附剂表面要平整，应一直浸泡在溶剂液面以下，严吸附剂表面要平

18、整，应一直浸泡在溶剂液面以下，严防产生气泡。湿法装柱均匀，不易留有气泡防产生气泡。湿法装柱均匀，不易留有气泡（四）上样和洗脱（四）上样和洗脱经平衡好的层析柱，当平衡液到达固定相表面时，经平衡好的层析柱，当平衡液到达固定相表面时，用滴管轻轻地将待分离样品液加置固定相表面（注意用滴管轻轻地将待分离样品液加置固定相表面（注意避免冲动基质，且样品液体积应小于床体积的避免冲动基质，且样品液体积应小于床体积的1/21/2）；）；待样品液进入固定相时，用滴管加洗脱剂，并在上端待样品液进入固定相时，用滴管加洗脱剂，并在上端连接洗脱剂瓶连续洗脱，同时下端与部分收集器接通，连接洗脱剂瓶连续洗脱，同时下端与部分收集

19、器接通，分级收集。分级收集。n将收集的每管溶液进行浓缩和活性测定。以管号或洗脱体积将收集的每管溶液进行浓缩和活性测定。以管号或洗脱体积为横坐标，每管样品的浓度或活度为纵坐标，若层析峰无重叠，为横坐标，每管样品的浓度或活度为纵坐标，若层析峰无重叠，则各成分能完全分离（图则各成分能完全分离（图3-73-7）n为了获得满意分离效果，洗脱速度恰当控制（若太快，洗脱为了获得满意分离效果，洗脱速度恰当控制（若太快，洗脱物在两相中平衡不完全；太慢，则洗脱物会扩散；结果都会导物在两相中平衡不完全；太慢，则洗脱物会扩散；结果都会导致分离度下降）致分离度下降）n分离出的样品经浓缩或冻干处理后，可进行纯度测定及保存

20、分离出的样品经浓缩或冻干处理后，可进行纯度测定及保存 加加 样样 操操 作作 示示 意意 图图（五）柱子再生（五）柱子再生各种层析柱，其再生方法因固定相不同而异各种层析柱，其再生方法因固定相不同而异(1)纯化生命物质纯化生命物质72： 天然的双链天然的双链(ds)和热变性单链和热变性单链(ss)小牛胸腺小牛胸腺DNA在在HA层析柱层析柱的分离图谱的分离图谱 六、实例应用六、实例应用(2)分离蛋白质的亚基分离蛋白质的亚基114 14C-组氨酸标记的兔球蛋白亚基在组氨酸标记的兔球蛋白亚基在HA层析柱的分离图谱层析柱的分离图谱 第二节第二节 薄薄 层层 层层 析析 薄层层析薄层层析( (thin layer chromatographythin layer chromatography，TLC)TLC)是以涂布于玻板或涤纶片等载体上的基质为固是以涂布于玻板或涤纶片等载体上的基质为固定相，以液体为流动相的一种层析方法定相，以液体为流动相的一种层析方法薄层层析的概念薄层层析的概念 1 1展层时间短