免疫酶法测定桔霉素

1、免疫酶法测定桔霉素摘要：一种快速测定饲料当中的桔霉素的方法，采用间接竞争酶联免疫吸附实验，分析提取乙腈水试验样品。桔霉素所分析的浓度范围是20-500g/kg，相对重复性（精密度）和实验室中等精密度（重复性）的分析结果分别为0.11和0.16。桔霉素（3R,4S)-4,6-二氢-8-羟基-3,4,5-三甲基-6-羰-3氢-2-苯吡-7-羧酸是青霉、曲霉和红曲霉等丝状霉菌代谢产生的一种毒素，这类霉菌主要污染饲料和谷类食品。这种化合物在商业上被称为“红曲”，谷物饲料和配合的饲料是主要的被污染物。免疫化学检测技术的发展是Vrabcheva等人进行的谷物污染检查，这是执行的第一次大规模粮食污染检查。

2、这项工作的目的是开发一个快速的方法测定各种饲料中的桔霉素，材料和混合材料是基于间接竞争酶联免疫吸附试验。试验桔霉素（C1017; Sigma公司，美国），甲醛（33号220; Fluka公司，德国），牛血清白蛋白（BSA），卵白蛋白（EA），兔血清白蛋白（RSA），明胶，葡萄糖氧化酶（GOX EC1.1.3.4）（G2133; Sigma公司，美国）这些药品是用于制备免疫试剂。国内生产的辣根过氧化物酶（EC1.11.1.7）和驴兔免疫球蛋白血清是用于酶联免疫吸附实验中抗物种酶的结合物。紫外光谱是用于记录的仪器日立-557（日本日立公司），进行酶联免疫吸附试验使用的聚苯乙烯板（第9018号;联合

3、，美国）和AKI-TS-01（俄罗斯），IFA-OEP-A（俄罗斯），Dynatec公司的MR-250（德国）光度计。活性酯法和甲醛缩合法，如先前所描述的，可以在自发结合的条件下，被用来合成桔霉素结合物和蛋白质。对于甲醛缩合反应，是用于计算溶液当中桔霉素的含量，2ml二甲基甲酰胺溶液和37的甲醛水溶液100，200，和300L（相当于1230，2460， 3690摩尔），在加入牛血清白蛋白溶液（0.07mol），卵白蛋白（0.1mol），兔血清白蛋白（0.08mol），明胶（0.05mol）和葡萄糖氧化酶（0.05mol）。将混合液在室温下静置16h或者加热至3033C并不断搅拌24h。然后透

4、析三个1000体积0.2的氯化钠溶液。用紫外吸收光谱法测定溶液的抗原表位密度（每摩尔的半抗原载体蛋白的摩尔数）（= 333 nm处的摩尔吸收系数为16000）牛血清白蛋白结合物，能与286倍摩尔质量毒素蛋白合成牛血清白蛋白 (286)，与葡萄糖氧化酶（400）经甲醛缩合后用于动物免疫接种。雄性灰兔（23公斤），第一次注射100ug弗氏完全佐剂免疫原，第二次注射100ug的生理溶液。所有合成的结合物吸附在聚苯乙烯孔中，在0.05米处加入碳酸盐-碳酸氢盐缓冲溶液（PH9.5）浓度为0.15ug/ml作为固相抗原。对免疫试剂进行测试，并按照前面描述的程序对分析条件进行了优化。饲料混合物（粮食、 添加

5、剂、 和浓缩物），谷物（小麦，大麦，黑麦，燕麦，小黑麦和玉米）， 谷物产品（米糠和面筋），葵花粕，和葵花油被选为试验材料。将样品研磨成粉末，通过孔径大小为1毫米的筛子。此后，50毫升乙腈和水按体积比为6：1混合，再加入10g的样品，批量提取14h，快速搅动，在整个过程中。分别进行描述分析。准确性、重复性（精度）和中等精密度（重复性）评价方法，根据GOSTRISO 5725-2002.。在粮食、饲料混合物、玉米蛋白等中加入20，100，和500g/kg的桔霉素进行实验评价。由于测定的时间不同，操作者不同，以及仪器误差，测定被污染的样品当中桔霉素的含量，来确定其中等精密度特性。结果与讨论免疫试剂的

6、制备。使用活性酯法就是将桔霉素与牛血清白蛋白，兔血清白蛋白，和明胶结合，这种毒素与牛血清白蛋白通过与黄曲霉毒素类比，发生自发的相互作用，而这种方法是不成功的。我们用分光光度法和免疫化学分析法并没有发现结合物的形成。据此前报道，许多人尝试使用不同的方法修饰桔霉素的官能团而制备半抗原是不成功的。特别是，C6位羰基与羧甲氧基胺或氨基苯甲醛肼所发生的反应，C8位羟基与琥珀或戊二酸酐发生酯化反应，C6位羰基与氢化铝锂发生还原反应，降低分子的共振稳定性，C14位羧基与-氨二环己基碳二亚胺赖氨酸残基毒素在载体蛋白上发生直接反应被发现是无效的。葡萄糖氧化酶偶联物与血蓝蛋白在22和超过1000000倍摩尔质量的

7、蛋白质所对应甲醛进行72h反应，通过甲醛缩合反应成功的诱导抗桔霉素，然而，在这种情况下，半抗原负荷密度约为3。在这项工作中，甲醛缩合桔霉素，然后与牛血清白蛋白，葡萄糖氧化酶，卵白蛋白和明胶进行混合，在30-33C.下培养24h.该方法是通过分光光法证明结合物中毒素的存在（图1）。结合物具有许多半抗原是由牛血清白蛋白与桔霉素（在6-286倍摩尔质量）和甲醛（52700倍摩尔质量）或葡萄糖氧化酶与桔霉素（在8-400倍摩尔质量）和甲醛（在73-800倍摩尔质量）反应制得（图1）。桔霉素结合物与明胶和卵白蛋白在相同的倍数：73800倍和36900倍与过量的甲醛反应，他的抗原表位密度下降（表1）。牛血

8、清白蛋白甲醛缩合，如先前在20-，57-和86倍摩尔质量的桔霉素和17570倍过量的甲醛进行缩合，导致表位密度分别降至1.1，1.4，和2.8。免疫动物与牛血清白蛋白结合，而免疫的效果却不是很好，令人不满意，这是由于抗血清没有充足的分析造成的。图1.紫外吸收光谱图 （1）牛血清白蛋白；（2）牛血清白蛋白（6）；（3）牛血清白蛋白（17），（4）牛血清白蛋白（57），（5）牛血清白蛋白（171），和（6）牛血清白蛋白（286）和桔霉素（10ug/ml,水）抗原结合（0.1mg/ml;水）.表1.甲醛缩合条件和桔霉素结合物分光光度法评价条件及结果在8个月的周期内，免疫动物与兔血清白蛋白（286）结

9、合或者在6个月的周期内，免疫结合葡萄糖氧化酶（400），免疫反应在发展过程中显示出相同的特点（图2）。固化的卵白蛋白（12）结合物的最初评价结果显示，血液样本当中的抗血清能够提供几乎相等酶联免疫吸附能力。图2.在桔霉素的测定中，(a)抗牛血清白蛋白(286)的第一个到第八个血样本与(b)抗葡萄糖氧化酶（400）的第一个到第六和血样本与固相抗原卵白蛋白（12）发生酶联免疫竞争反应。测定桔霉素酶联免疫吸附试验程序的优化。在抗血清测试中，抑制结合最好的方法就是观察固化的结合物异源和外源免疫原载体类型，以及最低半抗原载体类型。抗牛血清白蛋白（286）与固相结合卵白蛋白（12）和葡萄糖氧化酶（8），以及

10、抗血清葡萄糖氧化酶（400）和卵白蛋白（12）和明胶（240），在0.4ng/ml的水平上测定桔霉素（表2）。表2.抗牛血清白蛋白（286）和抗葡萄糖氧化酶（400）与桔霉素的各种固相抗原之间的竞争相互作用。这两种类型的抗体，在农业产品中交叉反应对其他霉菌毒素（T-2毒素，4 - 脱氧雪腐镰刀菌烯醇，玉米赤霉烯酮，黄曲霉毒素，赭曲霉毒素A，杂色曲霉素和伏马菌素）的浓度调节，没有检测到。这表明，桔霉素可以有选择性地确定。将抗血清添加到牛血清白蛋白（286）和固相结合卵白蛋白（12），这能使我们确定桔霉素溶液浓度0.4-10ng/ml。图3显示了桔霉素测定的校准曲线图。它显示了平均（N=40）抗体

11、的结合率（在中等精密度的条件下每一天或一到两天的时间间隔下制备抗体）对桔霉素的浓度作对数图。该抗体结合的百分比，其中有不高于5的相对标准偏差（RSD），在实验室条件下的外部因素，用波动表示测试系统稳定运行）桔霉素的测定是对提取相应物质效果的评价。在研究所有类型的测试材料中有代表性的样品，我们发现样品中的桔霉素并没有被检测到，抗体结合百分率等于或高于90（表3）。其中所有的样品中并不包含其他的霉菌毒素或样品被1个或几个霉菌毒素所污染: T-2毒素，4 - 脱氧雪腐镰刀菌烯醇，玉米赤霉烯酮，黄曲霉毒素B1，赭曲霉毒素A，杂色曲霉素和伏马菌素。这两组样品有相似范围的抗体结合率（94111和94103%）和几乎相等的平均值101和100%，不但没有干扰的提取物也没有试验化合物，而且抗体的特异性高，这允许我们在其他霉菌毒素存在的情况下，定量测定桔霉素。表3.样品中抗体结合率就是桔霉素的含量桔霉素的测定过程。该过程包括两个阶段：在酶联免疫吸附之前，提取分析试样当中的乙腈水溶液和稀释的缓冲提取液，这一点在其他地方已经详细描述过了。在考 虑到部分称重体积和萃取剂体积比为5，在分析前，十倍稀释的提取物，校准曲线的线性部分对应样本中毒素的分析范围 20 -500 mg/kg。该方法的精确性评价。在实验中发现，评价测定桔霉素准确性时