微生物次级代谢

1、4 4 微生物次级代谢与调节微生物次级代谢与调节4.1 引论引论初级代谢与次级代谢定义：初级代谢与次级代谢定义： 初级代谢：初级代谢：为生物提供能量、合成中间体及其关键大分为生物提供能量、合成中间体及其关键大分子，如蛋白质、核酸等的各种相互关联的代谢网络子，如蛋白质、核酸等的各种相互关联的代谢网络( (包括包括分解与合成分解与合成) )。 次级代谢：次级代谢：主要涉及合成过程，其终产物、次级代谢物主要涉及合成过程，其终产物、次级代谢物对菌生长不是必需的，对其生命活动可能具有某种意义，对菌生长不是必需的，对其生命活动可能具有某种意义，通常在生长后期开始形成。通常在生长后期开始形成。 次级代谢产物

2、次级代谢产物(Secondary Metabolites)是某些微是某些微生物在生命循环的某一个阶段产生的物质，它们一生物在生命循环的某一个阶段产生的物质，它们一般是在产生菌生长中止后合成的。般是在产生菌生长中止后合成的。微生物产生的次级代谢物有：微生物产生的次级代谢物有：抗生素抗生素: : 青霉素、万古霉素、红霉素青霉素、万古霉素、红霉素色素色素: : 放线紫红素放线紫红素(Act)(Act)、RedRed生物碱生物碱(alkaloid): (alkaloid): 吗啡、喜树碱吗啡、喜树碱毒素毒素研究微生物次级代谢的意义：研究微生物次级代谢的意义：a) 获得与次级代谢有关的基础理论知识，并用

3、于设获得与次级代谢有关的基础理论知识，并用于设计更为有效的途径来合成这类复杂的化合物或改计更为有效的途径来合成这类复杂的化合物或改造它们，以获得所需的生物性质；造它们，以获得所需的生物性质；b) 有助于优化次级代谢产物的工业生产。有助于优化次级代谢产物的工业生产。c)c) 借助于生物合成途径的知识，利用基因工程技术借助于生物合成途径的知识，利用基因工程技术可以帮助构建在遗传学上能产生新化合物的突变可以帮助构建在遗传学上能产生新化合物的突变株。株。 一般不在生长期产生，而在生长后期形成一般不在生长期产生，而在生长后期形成（一）微生物次级代谢的特性（一）微生物次级代谢的特性抗生素晚合成的原因之一可

4、能是避免生长受其抗生素晚合成的原因之一可能是避免生长受其自身产物的抑制；自身产物的抑制； 次级代谢产物的合成过程次级代谢产物的合成过程一般是在培养基中缺乏某种营养物质，菌体生一般是在培养基中缺乏某种营养物质，菌体生长受到限制时才启动的。长受到限制时才启动的。种类繁多，结构特殊，含不常见种类繁多，结构特殊，含不常见的化学键：的化学键：氨基糖、苯醌、香豆素、环氧化合物、氨基糖、苯醌、香豆素、环氧化合物、麦角生物碱、戊二酰胺、多烯、吡咯、喹啉、麦角生物碱、戊二酰胺、多烯、吡咯、喹啉、萜烯、四环类抗生素等；萜烯、四环类抗生素等； -内酰胺环、聚乙烯和多烯的不饱和内酰胺环、聚乙烯和多烯的不饱和键、大环内

5、酯的大环和含有普通键、大环内酯的大环和含有普通AA和经修和经修饰的饰的AA组成的环肽等；组成的环肽等；一种菌所合成的次级代谢物往往是一簇结构相似的化合物。一种菌所合成的次级代谢物往往是一簇结构相似的化合物。举例：举例： 产黄青霉能产生产黄青霉能产生10种具有相同母核、不同侧链的天种具有相同母核、不同侧链的天然抗生素，然抗生素，结构上的差别使它们具有不同的生物活性。结构上的差别使它们具有不同的生物活性。( (参阅参阅表表4-1/P159)4-1/P159)一簇抗生素中组分的比例取决于遗传和环境因素，这是一簇抗生素中组分的比例取决于遗传和环境因素，这是由于参与次级代谢物合成的酶的专一性不强所致；由

6、于参与次级代谢物合成的酶的专一性不强所致；而初而初级代谢方面的特异性总是很高，因差错会导致致命性的级代谢方面的特异性总是很高，因差错会导致致命性的后果。次级代谢方面的差错对细胞的生长无关紧要，改后果。次级代谢方面的差错对细胞的生长无关紧要，改变后的代谢产物有些还保留生物活性。变后的代谢产物有些还保留生物活性。 一种微生物的不同菌株可以产生分子结构迥异的次级一种微生物的不同菌株可以产生分子结构迥异的次级代谢物。代谢物。 例如：例如：灰色链霉菌可生产链霉素、白霉素、吲哚霉素、灰色链霉菌可生产链霉素、白霉素、吲哚霉素、灰霉素、灰绿霉素和灰争霉素等；灰霉素、灰绿霉素和灰争霉素等；不同种类的微生物亦能产

7、生同一种次级代谢物。不同种类的微生物亦能产生同一种次级代谢物。 例如：例如：如产黄青霉、点青霉、土曲霉、构巢曲霉、如产黄青霉、点青霉、土曲霉、构巢曲霉、发癣霉属的一些真菌都能产生青霉素；发癣霉属的一些真菌都能产生青霉素；微生物由生长期向生产期过渡时，菌体在形态学上微生物由生长期向生产期过渡时，菌体在形态学上会发生一些变化会发生一些变化。例如，一些产芽胞的细菌在此时会形成芽胞，真菌和例如，一些产芽胞的细菌在此时会形成芽胞，真菌和放线菌会形成孢子。因此，有人把次级代谢产物的合放线菌会形成孢子。因此，有人把次级代谢产物的合成作用看作是成作用看作是细胞分化的伴随现象细胞分化的伴随现象。次级代谢产物的合

8、成比生长对环境因素更敏感。次级代谢产物的合成比生长对环境因素更敏感。其合其合成信息的表达受环境因素调节。成信息的表达受环境因素调节。例如：例如：菌体生长可在菌体生长可在0.3300 mmol/L磷酸磷酸盐浓度下进行，而次级代谢物合成的最适浓度盐浓度下进行，而次级代谢物合成的最适浓度为为0.110mmol/L。 次级代谢产物的合成是由多基因控制的代谢过程。次级代谢产物的合成是由多基因控制的代谢过程。这些基因不仅位于微生物的染色体中，也位于这些基因不仅位于微生物的染色体中，也位于质粒中，并且染色体外的基因在次级代谢产物质粒中，并且染色体外的基因在次级代谢产物的合成中往往起主导作用。的合成中往往起主

9、导作用。（二）次级代谢物的生物合成（二）次级代谢物的生物合成生源学生源学(biogenesis)指的是代谢产物分子中构建单位的各指的是代谢产物分子中构建单位的各种原子的起源；种原子的起源； （有机化学）（有机化学）生源学又称为生物发生学，是指一些天然物质（包括有生生源学又称为生物发生学，是指一些天然物质（包括有生命的物质）为什么会发生、存在的原因，及它对宿主，环境命的物质）为什么会发生、存在的原因，及它对宿主，环境有何作用的科学。有何作用的科学。 （生物化学）（生物化学）生物合成生物合成指的是各构建单位在多种酶的作用下合成次级代指的是各构建单位在多种酶的作用下合成次级代 谢产物的过程。谢产物的

10、过程。（生物化学）（生物化学）次级代谢物生物合成步骤次级代谢物生物合成步骤： 养分摄入细胞内；养分摄入细胞内； 通过中枢代谢途径养分转化为通过中枢代谢途径养分转化为中间体中间体； 次级代谢物次级代谢物前体前体的生物合成；的生物合成；u 中间体中间体 ：对初级代谢而言；：对初级代谢而言；u 前体：前体： 对次级代谢而言；对次级代谢而言；u有时二者是同一物质，有时前体在中间体的基础上结构略有改变。有时二者是同一物质，有时前体在中间体的基础上结构略有改变。 如有必要，改变其中的一些中间体；如有必要，改变其中的一些中间体； 前体进入次级代谢物生物合成的前体进入次级代谢物生物合成的专有途径专有途径； 次

11、级代谢的主要骨架形成后，作最后的修饰，成为产物。次级代谢的主要骨架形成后，作最后的修饰，成为产物。 次级代谢物通常由次级代谢物通常由初级代谢中间体初级代谢中间体产生产生 氧化还原反应：氧化还原反应：一般涉及醇的氧化或羰基的还原，一般涉及醇的氧化或羰基的还原，双键的引入或还原，氧原子的引入和芳香环的氧化裂解，双键的引入或还原，氧原子的引入和芳香环的氧化裂解，这些反应是由脱氢酶或加氧酶催化的。这些反应是由脱氢酶或加氧酶催化的。 生物甲基化生物甲基化是各种代谢物，特别是聚酮化物的生是各种代谢物，特别是聚酮化物的生物合成中的重要反应。甲基的主要来源为甲硫氨酸、高物合成中的重要反应。甲基的主要来源为甲硫

12、氨酸、高半胱氨酸、甘氨酸和丝氨酸。半胱氨酸、甘氨酸和丝氨酸。 卤化作用卤化作用对分子中含卤元素对分子中含卤元素(大多数是氯大多数是氯)的次级代的次级代谢物是很重要的。谢物是很重要的。将初级代谢中间体转化为次级代谢终产物有三个生化过程：将初级代谢中间体转化为次级代谢终产物有三个生化过程：抗生素的生源学n抗生素生源学研究一些微生物会产生这类抗生素生源学研究一些微生物会产生这类对其它微生物、甚至对其自身有害物质的原对其它微生物、甚至对其自身有害物质的原因及这类物质的功能。因及这类物质的功能。n在这方面的了解将有助于解释抗生素的形在这方面的了解将有助于解释抗生素的形成机制和控制其生产。成机制和控制其生

13、产。抗生素的生源学(Biogenesis)1)合成次级代谢物是作为储藏物。合成次级代谢物是作为储藏物。2)作为正常代谢的无用的副产物。作为正常代谢的无用的副产物。3)大分子消化后残留的碎片。大分子消化后残留的碎片。4)解除体内有害代谢物的毒性。解除体内有害代谢物的毒性。5)支路代谢物。支路代谢物。6)竞争需要，用于抑制其它微生物，争夺竞争需要，用于抑制其它微生物，争夺有限的养分。有限的养分。抗生素的生源学(Biogenesis)7)进化遗留所致。进化遗留所致。8)在自然界具有生态上功能。在自然界具有生态上功能。9)调节功能，至少与形态学，分化方面调节功能，至少与形态学，分化方面有关。有关。10

14、) 代谢维持产物，其作用主是代谢过代谢维持产物，其作用主是代谢过程，而不是产物本身。程，而不是产物本身。 n可根据次级代谢产物分子中的主要可根据次级代谢产物分子中的主要组分与初级代谢的关系，把次级代组分与初级代谢的关系，把次级代谢产物分成五个基本类型：谢产物分成五个基本类型：（二）次级代谢物的类型（二）次级代谢物的类型次级代谢产物的类型 n糖类糖类 许多次级代谢产物在结构上明显与糖类物质有关。它们的前体物质都是葡萄糖，但是它们的结构在次级代谢过程中被修饰了。例如，链霉素，新霉素和卡那霉素等均是分子结构被修饰了的寡糖类抗生素。次级代谢产物的类型n多肽类多肽类 同糖类物质一样，氨基酸或其聚合物(多

15、肽)在次级代谢过程中常常被修饰，形成多肽类抗生素。例如链霉菌产生的放线菌素是由寡肽构成的。还包括芳香族氨基酸或其他氨基酸合成途径的中间体产物被修饰后形成的抗生素。例如，委内瑞拉链霉菌产生的氯霉素和头状链霉菌产生的丝裂霉素C等。次级代谢产物的类型n聚脂酰类聚脂酰类 这类化合物均以活性脂酰作为前体，通过聚合作用形成的。由乙酰辅酶A可以形成两类自身缩合产物：一类是通过头尾联接的聚乙酮(酰)化合物；另一类是通过新形成的活性异戊二烯的寡聚作用形成的化合物。这类化合物可形成萜类、甾类和类胡萝卜素类次级代谢产物。属于这类次级产物的有水稻恶苗病菌产生的赤霉素等。次级代谢产物的类型n核酸碱基类似物类核酸碱基类似

16、物类 此类次级代谢产物的合成明显地与核酸碱基的合成相关。它们或者由细胞中现成的核苷酸经化学修饰转变而来，或者通过与核苷酸生物合成相似的过程合成而来。例如6-氨基嘌呤，焦土霉素，狭霉素，蛹螬菌素等。次级代谢产物的类型n其它类型其它类型 微生物还产生一些不属于上述四种类型的次级代谢产物。因为人们很难根据这类化合物分子中的组分的来源，把它们归于上述任何一种类型的次级代谢产物。4.2 次级代谢物生物合成的前体次级代谢物生物合成的前体1、前体的定义、前体的定义（一）前体的概况和来源（一）前体的概况和来源Rose的定义（的定义（1979）：）：前体前体(precursor)是在细胞内生成的，或由培养基是在

17、细胞内生成的，或由培养基提供的，能被代谢形成某种终产物的物质。提供的，能被代谢形成某种终产物的物质。Stanbury等的定义等的定义(1984)：前体指加入到某一培养基中的一些化学物质被直接前体指加入到某一培养基中的一些化学物质被直接结合到所需产物中。结合到所需产物中。前体现代定义：前体现代定义： 指加入到发酵培养基中的某些化合物，它能指加入到发酵培养基中的某些化合物，它能被被微生物微生物直接结合到产物分子中去，而自身的结直接结合到产物分子中去，而自身的结构无多大变化，且具有促进产物合成的作用。构无多大变化，且具有促进产物合成的作用。 中间体：中间体： 指养分或基质进入一途径后被转化为一种或多

18、种指养分或基质进入一途径后被转化为一种或多种不同的物质，它们均被进一步代谢，最终获得该途径不同的物质，它们均被进一步代谢，最终获得该途径的终产物。的终产物。 前体与中间体的区别：前体与中间体的区别： 前体的结构往往略需改变后才进入到代谢途径中前体的结构往往略需改变后才进入到代谢途径中去；有时指同一物质。去；有时指同一物质。有些中间体可直接用作前体。但有些需经修饰才能作有些中间体可直接用作前体。但有些需经修饰才能作为前体。为前体。 次级代谢物前体的种类：次级代谢物前体的种类： Betina认为，次级代谢物的前体大多数源自初级代谢的认为，次级代谢物的前体大多数源自初级代谢的中间体：中间体：糖类；糖

19、类；莽草酸和莽草酸和(或或)芳香芳香AA；非芳香非芳香AA；C1化合物；化合物；脂肪酸脂肪酸(尤其是乙酸和丙酸尤其是乙酸和丙酸)；TCA循循环的中间体；环的中间体；嘌呤和嘧啶。嘌呤和嘧啶。 Martin等将可作为次级代谢物前体的初级代谢的中等将可作为次级代谢物前体的初级代谢的中间体分为：间体分为：短链脂肪酸；短链脂肪酸；异戊二烯单位；异戊二烯单位；AA；糖与氨基糖；糖与氨基糖；环己醇与氨基环己醇；环己醇与氨基环己醇；脒基；脒基；嘌呤与嘧啶碱；嘌呤与嘧啶碱；芳香中间体与芳香芳香中间体与芳香AA；甲基甲基(C1库库)。 次级代谢物的生物合成过程，除了在前体的形成和聚次级代谢物的生物合成过程，除了在

20、前体的形成和聚合过程外，遵循一般的生物合成规律。合过程外，遵循一般的生物合成规律。 次级代谢途径同初级代谢的分解代谢、无定向代谢和次级代谢途径同初级代谢的分解代谢、无定向代谢和组成代谢紧密相关。其前体通常是正常的或经修饰的初级组成代谢紧密相关。其前体通常是正常的或经修饰的初级代谢的中间体。代谢的中间体。小结：小结： 乙酸、丙酸、丙二酸、甲基丙二酸，形成乙酰乙酸、丙酸、丙二酸、甲基丙二酸，形成乙酰 CoA、丙、丙二酰二酰 CoA、甲基丙二酰、甲基丙二酰 CoA 等前体，作为抗生素建筑材料等前体，作为抗生素建筑材料进入次级代谢途径。进入次级代谢途径。乙酰乙酰CoA与几个分子丙二酰与几个分子丙二酰C

21、oA或甲基丙二酰或甲基丙二酰CoA线性缩线性缩 合生成合生成聚酮聚酮（polyketide）代谢物。如：四环素簇，大环）代谢物。如：四环素簇，大环 内酯和多烯大环内酯环骨架。内酯和多烯大环内酯环骨架。2、前体的来源、前体的来源由初级代谢物衍生次级代谢物的途径由初级代谢物衍生次级代谢物的途径 （1）短链脂肪酸途径）短链脂肪酸途径（2）芳香中间体）芳香中间体n莽草酸途径的中间体或终产物：莽草酸途径的中间体或终产物：莽草酸，对氨基苯甲莽草酸，对氨基苯甲酸，色氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸，酸，色氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸，形成许多次级代谢物形成许多次级代谢物的芳香部分的芳香部分 。n莽草酸途径负责大多数放线菌和

22、许多植物次生代谢物莽草酸途径负责大多数放线菌和许多植物次生代谢物的生物合成；而大多数真菌产生的芳香代谢物是由乙酸的生物合成；而大多数真菌产生的芳香代谢物是由乙酸通过聚酮（通过聚酮（polyketide）途径合成。）途径合成。举例：举例： 氯胺苯醇和棒杆菌素的生色团是由分枝酸衍生的。氯胺苯醇和棒杆菌素的生色团是由分枝酸衍生的。 利福霉素的芳香成分来自莽草酸。利福霉素的芳香成分来自莽草酸。 绿脓菌素的吩嗪骨架源自邻氨基苯甲酸。绿脓菌素的吩嗪骨架源自邻氨基苯甲酸。 新生霉素和黄青霉素的芳香部分来自酪氨酸。新生霉素和黄青霉素的芳香部分来自酪氨酸。 放线菌素、吲哚霉素、硝吡咯菌素的芳香环源自色氨酸。放线

23、菌素、吲哚霉素、硝吡咯菌素的芳香环源自色氨酸。 （3）经修饰的糖前体）经修饰的糖前体 氨基糖苷类抗生素：氨基糖苷类抗生素： 其糖其糖大多数来自葡萄糖，其碳架以整体方式结合到抗生素中。但往往需要经过修饰或转化。 糖的修饰：糖的修饰：差向异构化，异构化，氨化，去羟基，重排(生成分枝糖)，脱羧，氧化和还原。 糖的转化：糖的转化：以核苷二磷酸衍生物，如UDP-葡萄糖形式进行。UDP-葡萄糖由葡萄糖-1-P的葡萄糖基转给UTP获得。但是，大环内酯类抗生素的糖的生物合成大环内酯类抗生素的糖的生物合成是以TDP-衍生物作为中间体形式进行的。己糖胺的形成己糖胺的形成是通过己酮糖和谷氨酰胺的转氨作用完成的。 （

24、4）异戊二烯单位）异戊二烯单位异戊二烯单位是甾体化合物和萜类的形成单位。异戊二烯单位是甾体化合物和萜类的形成单位。（5）甲基的来源）甲基的来源 抗生素生物合成中的所有甲基化作用均以抗生素生物合成中的所有甲基化作用均以甲硫氨酸甲硫氨酸（Met）作为甲基供体，通过作为甲基供体，通过甲基转移酶甲基转移酶进行。进行。 而而Met的甲基源自的甲基源自N5-四氢叶酸四氢叶酸。 转甲基时转甲基时Met先活化，即在先活化，即在Mg2+和和ATP存在下生成高能存在下生成高能甲基供体：甲基供体：S-腺苷酰甲硫氨酸腺苷酰甲硫氨酸(SAM)。以。以SAM进行甲基化进行甲基化后自己变成后自己变成S-腺苷酰高半胱氨酸腺苷

25、酰高半胱氨酸(SAH)，后者可被水解为腺，后者可被水解为腺苷和高半胱氨酸。苷和高半胱氨酸。形式：形式：N-甲基化；甲基化；O-甲基化甲基化（1）抗生素建筑材料）抗生素建筑材料（二）前体的作用（二）前体的作用例如：例如： 丙酮酸可用于丙酮酸可用于Ala、Val、Leu等等的合成，是几种的合成，是几种肽类抗生素肽类抗生素（头孢菌素簇或青霉素簇）（头孢菌素簇或青霉素簇）合成的重要合成的重要中间体。中间体。许多次级代谢物是用不同的中间体作为建筑单位合成的许多次级代谢物是用不同的中间体作为建筑单位合成的。例如：例如： 大环内酯类抗生素：大环内酯类抗生素：其糖苷配基是由脂肪酸衍生的，其糖苷配基是由脂肪酸衍

26、生的，其糖部分是由葡萄糖衍生的。其糖部分是由葡萄糖衍生的。 真菌毒素和橘霉素：真菌毒素和橘霉素：是由五个是由五个C2单位单位(Ac-CoA加上加上4个丙二酰个丙二酰CoA)，2个甲基和由个甲基和由C1库来的羧基合成的。库来的羧基合成的。 新生霉素：新生霉素：具有更为复杂的来源，它是由葡萄糖、具有更为复杂的来源，它是由葡萄糖、莽草酸、莽草酸、GLN、C1库、库、Tyr和乙酸或和乙酸或Leu合成的。合成的。（2）诱导抗生素生物合成）诱导抗生素生物合成 前体具有调节抗生素生产的作用，尤其在细胞前体具有调节抗生素生产的作用，尤其在细胞中的特殊合成酶的活性已被激活的情况下。中的特殊合成酶的活性已被激活的

27、情况下。例例1： 在棒状链霉菌在棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)中头霉中头霉素素C的一种前体，的一种前体，-氨基己二酸是由赖氨酸合成途径氨基己二酸是由赖氨酸合成途径来的。它与蛋白质合成竞争此前体的供应。加入过量来的。它与蛋白质合成竞争此前体的供应。加入过量的的Lys， Lys途径中间体，二氨基庚二酸或途径中间体，二氨基庚二酸或-氨基己氨基己二酸到发酵液中可增加头霉素的发酵单位。二酸到发酵液中可增加头霉素的发酵单位。例例2： 产黄青霉的青霉素酰基转移酶可转化异青霉素产黄青霉的青霉素酰基转移酶可转化异青霉素N，除去青霉素除去青霉素N的侧链，换上天然青霉素的其他侧链。

28、侧的侧链，换上天然青霉素的其他侧链。侧链的置换取决于发酵液中含有适当的前体，如苯乙酸或链的置换取决于发酵液中含有适当的前体，如苯乙酸或苯氧乙酸等。故苄青霉素的发酵单位随发酵液中的限制苯氧乙酸等。故苄青霉素的发酵单位随发酵液中的限制性苯乙酸的增加而提高。性苯乙酸的增加而提高。例例3： L-Val被认为是环孢菌素被认为是环孢菌素A的前体和生物合成的的前体和生物合成的诱导物。加入诱导物。加入Val可促进可促进T. inflatum固定化细胞合成环固定化细胞合成环孢菌素孢菌素A。例例4： 赤霉素受葡萄糖的阻遏。这可通过加入赤霉素受葡萄糖的阻遏。这可通过加入3-甲基甲基-3,5-二羟基戊酸克服。二羟基戊

29、酸克服。例例5： 丙醇和丙酸具有促进红霉素生产的作用，丙酸的丙醇和丙酸具有促进红霉素生产的作用，丙酸的作用稍差些。在发酵前期加入丙醇会干扰生长，从而作用稍差些。在发酵前期加入丙醇会干扰生长，从而降低抗生素的合成。先前认为，丙醇的促进作用完全降低抗生素的合成。先前认为，丙醇的促进作用完全是由于起前体的作用，现已清楚，除了作为前体外，是由于起前体的作用，现已清楚，除了作为前体外，它还能诱导红霉素链霉菌的它还能诱导红霉素链霉菌的Ac-CoA羧化酶。此诱导作羧化酶。此诱导作用似乎发生在转录水平，因在发酵中加入放线菌素用似乎发生在转录水平，因在发酵中加入放线菌素D可可以阻抑这种作用。以阻抑这种作用。（3

30、）前体与诱导物的区别）前体与诱导物的区别 诱导作用在次级代谢物的合成控制上起重要作诱导作用在次级代谢物的合成控制上起重要作用。有时难于区分这种促进作用是真的诱导物的作用。有时难于区分这种促进作用是真的诱导物的作用还是前体的作用。用还是前体的作用。诱导物与前体的作用时期不同。诱导物与前体的作用时期不同。 一般把那些能在一般把那些能在生长期生长期内，生产期前促进抗生素生内，生产期前促进抗生素生物合成的化合物看做物合成的化合物看做诱导物诱导物，而，而前体前体往往只在往往只在生产期生产期内内起作用，甚至起作用，甚至蛋白质蛋白质合成受阻的情况下也行。合成受阻的情况下也行。 诱导物应能被非前体的结构类似物

31、取代。诱导物应能被非前体的结构类似物取代。 如如Met除了可作为头孢菌素合成的前体，提供除了可作为头孢菌素合成的前体，提供S的的作用，更为重要的作用在于诱导节孢子的形成，而后者作用，更为重要的作用在于诱导节孢子的形成，而后者的多寡影响头孢菌素的合成。的多寡影响头孢菌素的合成。 Met可被可被Leu取代。取代。 诱导物的另一个特征是其诱导系数特别高。诱导物的另一个特征是其诱导系数特别高。 如诱导链霉素形成的如诱导链霉素形成的A因子，因子，给链霉素生物合成受给链霉素生物合成受阻的突变株阻的突变株1 g 纯的纯的A因子因子(在接种时在接种时)，可诱导，可诱导1g链霉链霉素的形成，素的形成，其诱导系数

32、为其诱导系数为106。（三）前体的限制性（三）前体的限制性前体常常是次级代谢物生物合成的限制因素。前体常常是次级代谢物生物合成的限制因素。例例1：在发酵过程中加适量苯乙酸可强烈促进苄青霉在发酵过程中加适量苯乙酸可强烈促进苄青霉素的生产；素的生产；例例2：丙酸或丙醇促进大环内酯抗生素的生物合成。丙酸或丙醇促进大环内酯抗生素的生物合成。例例3：肽类抗生素的形成中非蛋白的肽类抗生素的形成中非蛋白的AA成分通常是限成分通常是限制因素。如粘菌素的生物合成受制因素。如粘菌素的生物合成受 -氨基丁酸和氨基丁酸和 , -二二氨基丁酸的限制；杆菌肽的生产受鸟氨酸的限制。氨基丁酸的限制；杆菌肽的生产受鸟氨酸的限制

33、。例例4：乙酰乙酰CoA (Ac-CoA)缺少会限制四环素的生产。缺少会限制四环素的生产。金色链霉菌低产菌株的特征是金色链霉菌低产菌株的特征是Ac-CoA倾向于走倾向于走TCA循环循环而被氧化；高产菌株没有这一倾向。而被氧化；高产菌株没有这一倾向。(表现为表现为ATP水平高水平高)例例5：诺尔斯链霉菌诺尔斯链霉菌( (Streptomyces noursei var polifungini) )合成制霉菌素的能力的提高与其前体，丙二酸和甲基丙二合成制霉菌素的能力的提高与其前体，丙二酸和甲基丙二酸合成的增加有关。酸合成的增加有关。 （3）添加前体的策略添加前体的策略 外源前体在发酵液中的残留浓度

34、过高，外源前体在发酵液中的残留浓度过高，会使生产菌中毒，不利于抗生素的合成。会使生产菌中毒，不利于抗生素的合成。但前体不足也不行。研究前体添加策略对但前体不足也不行。研究前体添加策略对有些抗生素高产稳产有重要意义。有些抗生素高产稳产有重要意义。 举例：举例：青霉素青霉素G生产需要加入苯乙酸或苯乙胺，发酵培养基生产需要加入苯乙酸或苯乙胺，发酵培养基中常用玉米浆的原因之一是这种原料含有苯乙胺。苯中常用玉米浆的原因之一是这种原料含有苯乙胺。苯乙酸具有促进青霉素生物合成的作用，可在基础料中乙酸具有促进青霉素生物合成的作用，可在基础料中和过程中添加，其理论用量为和过程中添加，其理论用量为0.47g苯乙酸

35、苯乙酸/g青霉素青霉素G；0.50g苯乙酸苯乙酸/g青霉素青霉素V。实际用量应考虑利用。实际用量应考虑利用率。高产菌株对前体的利用率率。高产菌株对前体的利用率(可可90)比低产菌株比低产菌株高许多。高许多。 添加前体时宜少量多次或流加，控制发酵液中前体的添加前体时宜少量多次或流加，控制发酵液中前体的残留浓度在适当范围。残留浓度在适当范围。例如：例如：苯乙胺浓度在苯乙胺浓度在0.050.08。 4.3 次级代谢物的生物合成原理次级代谢物的生物合成原理(1) 把前体引入次级代谢物生物合成的专用途径把前体引入次级代谢物生物合成的专用途径n前体一旦合成，便流向次级代谢物生物合成的专用途径。前体一旦合成

36、，便流向次级代谢物生物合成的专用途径。前体聚合作用是次级代谢特有的、普遍的合成机制。前体聚合作用是次级代谢特有的、普遍的合成机制。n通过前体聚合作用的次级代谢物有四环类、大环内酯类、通过前体聚合作用的次级代谢物有四环类、大环内酯类、 安莎霉素类、真菌芳香化合物的聚酮类和肽类、聚醚和安莎霉素类、真菌芳香化合物的聚酮类和肽类、聚醚和聚异戊二烯类抗生素。聚异戊二烯类抗生素。n这些特有的生物合成中间产物需作后几步的结构修饰，这些特有的生物合成中间产物需作后几步的结构修饰，修饰的深度取决于产生菌的生理条件。修饰的深度取决于产生菌的生理条件。n有些复杂抗生素是由来自不同生物合成途径的几个部分有些复杂抗生素

37、是由来自不同生物合成途径的几个部分组成的。组成的。 了解这方面所涉及的生物合成酶很重要，尤其是专了解这方面所涉及的生物合成酶很重要，尤其是专用途径的第一个酶用途径的第一个酶，因它决定了前体进入次级代谢物合，因它决定了前体进入次级代谢物合成途径的通量、中间体的流向和途径的生产能力。成途径的通量、中间体的流向和途径的生产能力。 途径的其他关键酶也可能是控制步骤，这类酶常受途径的其他关键酶也可能是控制步骤，这类酶常受碳、氮分解代谢物的阻遏以及磷和反馈调节。其中有些碳、氮分解代谢物的阻遏以及磷和反馈调节。其中有些酶可能受胞内积累的高浓度前体的诱导。酶可能受胞内积累的高浓度前体的诱导。次级代谢专用的关键

38、酶通常受次级代谢物的控制：次级代谢专用的关键酶通常受次级代谢物的控制：例例1：麦角生物碱生物合成的第一个酶受麦角生物碱生物合成的第一个酶受Trp或其类似物或其类似物的诱导作用。从生长期到生产期的过渡期间较高的的诱导作用。从生长期到生产期的过渡期间较高的Trp库存量导致库存量导致DMAT合成酶的浓度增加。合成酶的浓度增加。例例2：苯恶嗪酮合成酶是放线菌素生物合成的关键酶，苯恶嗪酮合成酶是放线菌素生物合成的关键酶，受葡萄糖分解代谢物阻遏。受葡萄糖分解代谢物阻遏。例例3：磷酸阻遏灰色链霉菌的对氨基苯甲酸合成酶的形磷酸阻遏灰色链霉菌的对氨基苯甲酸合成酶的形成。成。 通过前体单体聚合的次级代谢物有：通过

39、前体单体聚合的次级代谢物有： 四环类、大环内酯类、安莎霉素四环类、大环内酯类、安莎霉素(ansamycin)类、真类、真菌芳香化合物的聚多酮类和肽类菌芳香化合物的聚多酮类和肽类(包括同型、杂型和缩酚包括同型、杂型和缩酚肽肽)抗生素，以及聚醚和聚异戊二烯类抗生素。抗生素，以及聚醚和聚异戊二烯类抗生素。 这些聚合过程所涉及的生物合成机制对上述次级代这些聚合过程所涉及的生物合成机制对上述次级代谢物均适用。这说明这类合成酶具有共同的进化渊源。谢物均适用。这说明这类合成酶具有共同的进化渊源。 (2) 前体聚合作用过程前体聚合作用过程聚合反应是由高相对分子质量的合成酶催化的：聚合反应是由高相对分子质量的合

40、成酶催化的：例如：肽类抗生素合成酶例如：肽类抗生素合成酶 (NRPS, non-ribosomal peptide synthases) 聚多酮合成酶聚多酮合成酶 (PKS, polyketide synthases) 聚合后许多次级代谢物的化学结构通过多步酶反应聚合后许多次级代谢物的化学结构通过多步酶反应修饰完成。修饰完成。(3) 次级代谢物结构的后几步修饰次级代谢物结构的后几步修饰例例1 1： 在四环类抗生素生物合成中聚合的九酮化物中间体通过在四环类抗生素生物合成中聚合的九酮化物中间体通过闭环转化为闭环转化为6- -甲基四环化物，后者经几步转换，包括甲基四环化物，后者经几步转换，包括C-4

41、的的氧化，氧化，C-7的氯化的氯化(金霉素合成的情况下金霉素合成的情况下)，C-4的氨化，随的氨化，随后在氨基上的甲基化。后在氨基上的甲基化。 例例2： 红霉素生物合成的最后几步红霉素生物合成的最后几步(即红霉内酯形成后即红霉内酯形成后)为连接两个脱氧糖，和这些糖的为连接两个脱氧糖，和这些糖的O-甲基，甲基，N-甲基或甲基或C-甲基化。甲基化。 例例3： 头孢菌素生物合成的最后几步为去乙酰氧头孢头孢菌素生物合成的最后几步为去乙酰氧头孢菌素菌素C(经闭环和扩环步骤产物经闭环和扩环步骤产物)被羟基化为去乙酰被羟基化为去乙酰头孢菌素头孢菌素C，后通过乙酰，后通过乙酰CoA(去乙酰头孢菌素去乙酰头孢菌

42、素C酰酰基转移酶以乙酰基转移酶以乙酰CoA作用乙酰基给体作用乙酰基给体)转化为头孢转化为头孢菌素菌素C 。 某些次级代谢物是由单一类前体衍生的，某些次级代谢物是由单一类前体衍生的，例如，同例如，同型肽型肽。 许多次级代谢物由几类不同的前体合成的。许多次级代谢物由几类不同的前体合成的。例如，例如，杂肽类抗生素是由氨基酸和脂肪酸组装成的杂肽类抗生素是由氨基酸和脂肪酸组装成的。 (4) 复合抗生素中不同部分的装配复合抗生素中不同部分的装配例例1：在缩酚：在缩酚(depsi)肽抗生素中肽抗生素中AA与羟酸连接。与羟酸连接。 例如，缬氨霉素含有乳酸和D-羟异戊酸(图4-7)。 图4-7 缬氨霉素分子的排

43、列例例2：链霉素、诺卡菌素：链霉素、诺卡菌素A、杀假丝菌素和新生霉素是由几、杀假丝菌素和新生霉素是由几种不同前体组装的典型抗生素。种不同前体组装的典型抗生素。 诺卡菌素：诺卡菌素：由由L-高丝氨酸、修饰过的高丝氨酸、修饰过的L-对羟苯甘氨酸对羟苯甘氨酸、L-Ser和未经修饰的和未经修饰的L-对羟苯甘氨酸组成对羟苯甘氨酸组成 。 次级代谢物合成酶往往只具有次级代谢物合成酶往往只具有簇的专一性簇的专一性，即对基质，即对基质分子的某一部分有要求，对分子的其他部分无绝对要求。分子的某一部分有要求，对分子的其他部分无绝对要求。(5) 次级代谢物合成酶的专一性次级代谢物合成酶的专一性例如：例如：产黄青霉的

44、青霉素酰基转移酶能催化青霉素产黄青霉的青霉素酰基转移酶能催化青霉素N N的的a-a-氨基己二酰侧链，使转化为疏水性的酰基侧氨基己二酰侧链，使转化为疏水性的酰基侧链。此反应的专一性较高，因它不能酰化链。此反应的专一性较高，因它不能酰化7-7-氨基头氨基头孢霉烷酸孢霉烷酸(7-ACA)(7-ACA)，但接受广泛的内源与外源酰基，但接受广泛的内源与外源酰基CoACoA衍生物。衍生物。 参与初级代谢物和次级代谢物生物合成的基参与初级代谢物和次级代谢物生物合成的基本差别之一在于引物和延长单位的异质性。本差别之一在于引物和延长单位的异质性。 例如：例如：如由于缺少高度专一性，乙酰如由于缺少高度专一性，乙酰

45、CoA、丙二酰、丙二酰CoA和丙二酰胺和丙二酰胺CoA可在四环类抗生素合成中作引物。可在四环类抗生素合成中作引物。 大环内酯生物合成中的延长单位有丙二酸、甲基丙二酸和大环内酯生物合成中的延长单位有丙二酸、甲基丙二酸和丁酸。丁酸。 然而，不是所有参与次级代谢物合成的酶然而，不是所有参与次级代谢物合成的酶都缺乏基质专一性。有些具有高度专一性。都缺乏基质专一性。有些具有高度专一性。 例例1：红霉素合成酶形成红霉内酯糖苷配基时只接红霉素合成酶形成红霉内酯糖苷配基时只接受甲基丙二酰受甲基丙二酰CoA作为延长单位，而不用丙二酰作为延长单位，而不用丙二酰CoA单位。杀假丝菌素合成酶总是按既定的顺序聚合适当单

46、位。杀假丝菌素合成酶总是按既定的顺序聚合适当的前体单位。的前体单位。 通过基因操纵可以改变次级代谢物合成酶的专通过基因操纵可以改变次级代谢物合成酶的专一性。一性。其突变株常能形成特殊的次级代谢物，形成新其突变株常能形成特殊的次级代谢物，形成新的终产物。的终产物。 4.4 抗生素的生物合成抗生素的生物合成天然产物类别天然产物萜类生物碱辅酶因子非核糖体多肽脂肪酸衍生物与聚酮n聚酮和非核糖体肽化合物是复杂天然产物中的两大家族，分别由简单的羧酸和氨基酸单体构成，具有重要的医药和农用化学品的特性，其生物分子的结构极其复杂多样。n虽然两者利用的底物不同，但他们的生物合成均是在一个大的多功能蛋白的控制下完成

47、的，前者命名为PKS，后者命名为NRPS。两种复合酶均包含线性、连续重复的活性区域称之为模块，每个模块可催化多聚酮或多肽连的一轮延伸并进行适当的修饰，最后解链得到相应的产物。 非核糖体多肽合成酶非核糖体多肽合成酶(NRPS, non-ribosomal peptide synthases)聚酮合成酶聚酮合成酶 (PKS, polyketide synthases)一、聚酮体生物合成途径一、聚酮体生物合成途径 基于商业性的原因，迄今为止，一些具有基于商业性的原因，迄今为止，一些具有聚酮聚酮体生物合成（体生物合成（polyketide synthases，PKSs）途途径的径的“天然产物天然产物”

48、，如红霉素、阿维菌素、泰，如红霉素、阿维菌素、泰乐菌素、柔红霉素、阿克拉霉素、西罗莫司和乐菌素、柔红霉素、阿克拉霉素、西罗莫司和利福霉素等；利福霉素等；具具PKS途径的抗生素途径的抗生素药物类别药物类别 化化 合合 物物 大环内酯类抗生素大环内酯类抗生素 红霉素、螺旋霉素、麦迪霉素红霉素、螺旋霉素、麦迪霉素四环类抗生素四环类抗生素 四环素、金霉素、土霉素四环素、金霉素、土霉素抗肿瘤抗生素抗肿瘤抗生素 柔红霉素，阿克拉霉素、柔红霉素，阿克拉霉素、enediynesenediynes 抗寄生虫药抗寄生虫药 avermectinavermectin，nemadectinnemadectin 免疫抑制

49、剂免疫抑制剂 FK506, rapamycin FK506, rapamycin 抗真菌药抗真菌药 两性霉素，制霉菌素两性霉素，制霉菌素心血管药物心血管药物 lovastatin,lovastatin,，compactincompactin兽药兽药莫 能 星 （莫 能 星 （ m o n e n s i nm o n e n s i n ） ， 泰 乐 菌 素） ， 泰 乐 菌 素 (tylosin(tylosin) )，盐霉素，盐霉素u由由7个丙酸单位按照与脂肪酸合成过程相似的机制形成个丙酸单位按照与脂肪酸合成过程相似的机制形成: 以丙酰以丙酰CoA为引物，依次以甲基丙二酰为引物，依次以甲基

50、丙二酰 CoA 作为延伸单作为延伸单 位接上位接上6个丙酸单位。个丙酸单位。前体：活化丙酸单位；前体：活化丙酸单位；大环内酯类：红霉素大环内酯类：红霉素结构：一大环内酯和两种糖，脱氧氨基己糖和红霉糖；结构：一大环内酯和两种糖，脱氧氨基己糖和红霉糖；红红霉霉素素的的生生物物合合成成途途径径 红霉素产生菌的生物合成红霉素产生菌的生物合成n参与红霉素生物合成的PKSs，或6脱氧红霉内酯合成酶（6-deoxyerythronolide B synthase，DEBS）有6个模块组成，每个模块负责合成聚酮体中的一部分。n由于各模块之间的协调性，以及每个模块编码决定延伸单位的选择、功能和立体化学性质的催化

51、结构域，因此，就有可能通过对PKSs结构域或模块的操作获得具有新颖结构的化合物。nPKSs基因簇的大小在10100 kb左右不等。 PKS中的每一个模块的组成中的每一个模块的组成n酮基合成酶（酮基合成酶（ketosynthase，KS）n酰基转移酶（酰基转移酶（acyl transferase，AT）n酰基载体蛋白（酰基载体蛋白（acyl carrier protein，ACP）n这些域对于聚酮链的二碳单元的得加长是必需的。n-酮基修饰酶：包括酮基还原酶（酮基修饰酶：包括酮基还原酶（ketoreductase，KR）、）、脱氢酶（脱氢酶（dehydrogenase，DH）和烯酰还原酶）和烯酰还

52、原酶（enoylreductase，ER）n大多数典型的聚酮体合成途径的产物包括对大多数典型的聚酮体合成途径的产物包括对PKS产物的修产物的修饰，如将脱氧糖或氨基糖进行糖苷化以及通过细胞色素饰，如将脱氧糖或氨基糖进行糖苷化以及通过细胞色素P450进行氧化。图中所示的进行氧化。图中所示的LD为装载域（为装载域（loading domains），），TE为释放域，即硫酯酶（为释放域，即硫酯酶（esterases）。）。 CMonocistronic：单顺反子，一个启动子后仅具有一个编码序列。Polycistronic：多顺反子，若干个基因由一个启动子控制，转录在一条mRNA上。Organizati

53、on of natamycin gene clustera tetraene macrolide antibiotic produced by S.natalensis转录因子转录因子原核生物转录转录因子对靶基因启动子区域转录因子对靶基因启动子区域DNA序列的识别与结合是序列的识别与结合是整个调控的核心。整个调控的核心。发现次级代谢途径特异性转录调控因子，深入研究其转发现次级代谢途径特异性转录调控因子，深入研究其转录调控机理，是微生物生理与代谢、生化与遗传的核心录调控机理，是微生物生理与代谢、生化与遗传的核心关键问题之一关键问题之一。纳他霉素纳他霉素纳他霉素（natamycin），也称游链霉素

54、或匹马霉素（pimaricin）是由纳塔尔链霉菌（Streptomyces natalensis）产生的一组多烯大环内酯类抗生素，其化学结构如图。恰塔努加链霉菌（Streptomyces chattanovgensis）和褐黄孢链霉菌（Streptomyces gilvosporeus）也能够产生该类混合物。OOHCOOHHOHOHOOOH3COOHONH2OHH3CHH纳他霉素纳他霉素n纳他霉素能够专一性地抑制酵母和霉菌，阻止丝状真纳他霉素能够专一性地抑制酵母和霉菌，阻止丝状真菌中黄曲霉毒素的形成。与其他抗真菌物质相比，纳菌中黄曲霉毒素的形成。与其他抗真菌物质相比，纳他霉素对哺乳动物细胞的毒

55、性极低，可以广泛用于由他霉素对哺乳动物细胞的毒性极低，可以广泛用于由真菌引起的疾病。除此之外，由于纳他霉素的溶解度真菌引起的疾病。除此之外，由于纳他霉素的溶解度低，可用其对食品表面的处理以增加食品的保质期，低，可用其对食品表面的处理以增加食品的保质期，却不影响食品的风味和口感。因此，却不影响食品的风味和口感。因此，40多年来食品行多年来食品行业对它的兴趣不减。纳他霉素作为一种天然的食品防业对它的兴趣不减。纳他霉素作为一种天然的食品防腐剂已被批准用于某些乳制品、肉类、水果和饮料等腐剂已被批准用于某些乳制品、肉类、水果和饮料等许多食品工业中。目前，已成为世界许多食品工业中。目前，已成为世界30多个

56、国家广泛多个国家广泛使用的一种天然食品防腐剂和抗菌添加剂，美国使用的一种天然食品防腐剂和抗菌添加剂，美国FDA于于1982年批准纳他霉素可作为食品防腐剂，我国于年批准纳他霉素可作为食品防腐剂，我国于1997批准作为食品防腐剂。批准作为食品防腐剂。纳他霉素纳他霉素纳他霉素之所以被广泛用于食品工业，主要是具有四个纳他霉素之所以被广泛用于食品工业，主要是具有四个特点：特点：1）剂量低，效率高，抑菌作用比山梨酸强）剂量低，效率高，抑菌作用比山梨酸强50倍左右；倍左右；2）适用）适用pH范围广，而一般适用的山梨酸的防腐效果随范围广，而一般适用的山梨酸的防腐效果随pH的升高而降低；的升高而降低；3）无特殊

57、感官形状；）无特殊感官形状；4）抑制有害真菌而不影响有益菌群。）抑制有害真菌而不影响有益菌群。二、非核糖体多肽生物合成途径二、非核糖体多肽生物合成途径 非核糖体生物合成（非核糖体生物合成（non-ribosomal peptide non-ribosomal peptide synthasessynthases，NRPSNRPS）途径的途径的“天然产物天然产物”，如，如青霉素、头孢菌素、多粘菌素、放线菌素、纳青霉素、头孢菌素、多粘菌素、放线菌素、纳塔霉素和短杆菌肽塔霉素和短杆菌肽S S等；等； 不用蛋白质合成所用的转录不用蛋白质合成所用的转录翻译机构，故无需核糖体、翻译机构，故无需核糖体、tR

58、NA和和mRNA.序号序号侧侧 链链 R R学学 名名俗俗 名名1 1对羟基苄青霉素对羟基苄青霉素青霉素青霉素X X2 2苄青霉素苄青霉素青霉素青霉素G G3 3戊烯戊烯22青霉素青霉素青霉素青霉素F F4 4戊青霉素戊青霉素青霉素二氢青霉素二氢F F5 5庚青霉素庚青霉素青霉素青霉素K K6 6丙烯巯甲基青霉素丙烯巯甲基青霉素青霉素青霉素O O7 7苯氧甲基青霉素苯氧甲基青霉素青霉素青霉素V V8 84 4氨基氨基4 4羧基羧基丁基青霉素丁基青霉素青霉素青霉素N NNCHSCCHCH3CH3HCCNHOCRCOOHONCHSCCHCH3CH3HCCH2NOCOOH青霉素和青霉素和6APA分子

59、结构及各种天然青霉素的结构与名称分子结构及各种天然青霉素的结构与名称青霉素分子的化学结构青霉素分子的化学结构6APA的化学结构的化学结构各种天然青霉素具有的侧链和名称各种天然青霉素具有的侧链和名称HOCH2CH2H3CCH2CHCHCH2H3C(CH2)3CH2H3C(CH2)5CH2H2CCHCH2SCH2CH3OCH(CH2)2CH2NH2HOOC青霉素的合成机制青霉素的合成机制n青霉素、头孢霉素青霉素、头孢霉素C合成的前体物质有合成的前体物质有半胱氨酸（半胱氨酸（cys)、缬氨酸、缬氨酸(val)、-氨基己二酸氨基己二酸及苯乙酸等。及苯乙酸等。 3个前体氨基酸由葡萄糖转化个前体氨基酸由葡

60、萄糖转化而成，而成，n首先，在三肽合成酶（首先，在三肽合成酶（ACVS ）的作用下，将它们）的作用下，将它们缩合成缩合成三肽三肽（LLD-ACV），），n然后，由异青霉素然后，由异青霉素N合成酶（合成酶（IPNS）催化）催化LLD-ACV氧化氧化闭环（环闭环（环化）化），生成异青霉素，生成异青霉素N（IPN），），n再与活化的侧链前体苯乙酰再与活化的侧链前体苯乙酰CoA或苯氧乙酰或苯氧乙酰CoA将将IPN转化成青转化成青霉素霉素G或青霉素或青霉素V（转酰基转酰基）。）。C H3C H3H N2cooHco oHco oHH N2H N2co oHS H L-氨基己二酸氨基己二酸 L- 半胱氨酸