生物光子学5-04教材

1、主讲人：刘立新西安电子科技大学1第第 5 章章生物光子学成像技术生物光子学成像技术25.1 光学成像光学成像5.2 光学显微技术光学显微技术5.3 荧光显微技术荧光显微技术5.4 激光扫描共聚焦显微技术激光扫描共聚焦显微技术 5.5 多光子激发荧光显微技术多光子激发荧光显微技术 5.6 全内反射荧光显微技术全内反射荧光显微技术 5.7 荧光共振能量转移成像技术荧光共振能量转移成像技术5.8 荧光寿命成像显微技术荧光寿命成像显微技术5.9 光学相干层析成像技术光学相干层析成像技术5.10 非线性光学成像技术非线性光学成像技术5.11 生物光子学成像技术的发展趋势生物光子学成像技术的发展趋势本本

2、章章 内内 容容3 荧光共振能量转移（荧光共振能量转移（Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET） 工作原理：工作原理： 一对合适的荧光物质（可以是不同分子或同一分子的不同生色团一对合适的荧光物质（可以是不同分子或同一分子的不同生色团）可以构成一个）可以构成一个能量供体能量供体(donor) 和和能量受体能量受体(acceptor) 对，它对，它们之间由于们之间由于偶极偶极-偶极偶极的相互作用，激发供体分子的光子能量的相互作用，激发供体分子的光子能量h能够被传递至受体分子，而后受体分子通过发射出光子能够被传递至受体分子，而后受体分子通过发射出光子h

3、(h h) 而松弛，这个过程就是荧光共振能量转移。而松弛，这个过程就是荧光共振能量转移。 以供体的激发光激发，供体产生的荧光以供体的激发光激发，供体产生的荧光强度强度比它单独存在时要低比它单独存在时要低得多，而受体发射的荧光却大大增强，同时伴随供体的荧光得多，而受体发射的荧光却大大增强，同时伴随供体的荧光寿命寿命的相应缩短和受体的荧光寿命的相应拉长。的相应缩短和受体的荧光寿命的相应拉长。5.7 荧光共振能量转移成像技术荧光共振能量转移成像技术4 FRET发生条件：发生条件： 1）供体和受体之间达到合适的）供体和受体之间达到合适的距离内距离内(110 nm)，能能量转移效率和分子之间距离的六次方

4、成反比关系量转移效率和分子之间距离的六次方成反比关系； 2）供体与受体的）供体与受体的跃迁偶极跃迁偶极有一定的相对取向；有一定的相对取向； 3）供体的发射光谱供体的发射光谱与与受体的吸收光谱受体的吸收光谱有相当程度的重有相当程度的重叠。叠。 FRET成像是生物医学研究的重要手段之一。它应用于成像是生物医学研究的重要手段之一。它应用于蛋白质蛋白质-蛋白质间相互作用，钙新陈代谢、蛋白酶活性、蛋白质间相互作用，钙新陈代谢、蛋白酶活性、和高吞吐量放映化验等研究。和高吞吐量放映化验等研究。5.7 荧光共振能量转移成像技术荧光共振能量转移成像技术5CFP/YFP FRET能级图能级图5.7 荧光共振能量转

5、移成像技术荧光共振能量转移成像技术CFP受光激发后便发射光；受光激发后便发射光；CFP离离YFP的距离大于的距离大于10nm；YFP没有受到激发，因此也不发射光。没有受到激发，因此也不发射光。CFP受光激发后但没有发射光；受光激发后但没有发射光；CFP与与YFP的距离非常接近（的距离非常接近（1-10nm）；）；YFP没有受到激发，但发射光。没有受到激发，但发射光。6(供体）(受体）(效率）5.7 荧光共振能量转移成像技术荧光共振能量转移成像技术7已知的已知的FRET对：对：染料类：染料类：FITC/Rhodamine、Alexa488/Cy3、Cy3/Cy5、FITC/Cy3荧光蛋白类：荧光

6、蛋白类：CFP/YFP、BFP/GFP、BFP/YFP、CFP/DsRED、GFP/DsRED混用：混用：GFP/Rhodamine75.7 荧光共振能量转移成像技术荧光共振能量转移成像技术8 85.7 荧光共振能量转移成像技术荧光共振能量转移成像技术9 910FLIM-FRETFrom: Phizicky E, Bastiaens PIH, Zhu H, Snyder M, Fields S. “Protein analysis on a proteomic scale”, Nature, 422, 208-215,2003Figure 3: Principle of optical det

7、ection of protein post-translational modifications on a cell microarray10 FRET目前应用的几个热点：目前应用的几个热点： FRET技术及其应用向亚细胞及单分子观测水平发展技术及其应用向亚细胞及单分子观测水平发展 信号转导通道（网络）的亚细胞水平定位信号转导通道（网络）的亚细胞水平定位 生理事件过程中信号转导过程的细节、以及调控过程生理事件过程中信号转导过程的细节、以及调控过程的时空关系的时空关系 利用利用FRET技术追踪在体水平生命过程技术追踪在体水平生命过程5.7 荧光共振能量转移成像技术荧光共振能量转移成像技术11

8、115.1 光学成像光学成像5.2 光学显微技术光学显微技术5.3 荧光显微技术荧光显微技术5.4 激光扫描共聚焦显微技术激光扫描共聚焦显微技术 5.5 多光子激发荧光显微技术多光子激发荧光显微技术 5.6 全内反射荧光显微技术全内反射荧光显微技术 5.7 荧光共振能量转移成像技术荧光共振能量转移成像技术5.8 荧光寿命成像显微技术荧光寿命成像显微技术5.9 光学相干层析成像技术光学相干层析成像技术5.10 非线性光学成像技术非线性光学成像技术5.11 生物光子学成像技术的发展趋势生物光子学成像技术的发展趋势本本 章章 内内 容容12荧光寿命荧光寿命是指分子受到光脉冲激发后返回基态之前在激发态

9、平均停是指分子受到光脉冲激发后返回基态之前在激发态平均停留的时间，定义为荧光强度衰减到初始值的留的时间，定义为荧光强度衰减到初始值的1 / e (37% ) 时所需要的时所需要的时间，时间，通常小于通常小于100ns 。通过扫描测量样品不同位置处的荧光寿命成像，能够反映组织微环通过扫描测量样品不同位置处的荧光寿命成像，能够反映组织微环境，如分子所处微环境中的许多生物物理、生物化学参数如境，如分子所处微环境中的许多生物物理、生物化学参数如pH 值、值、离子浓度离子浓度(如如Ca+ 、K+等等) 、氧压、溶液疏水性及猝灭剂、氧压、溶液疏水性及猝灭剂(如碘化物、如碘化物、丙烯酰胺丙烯酰胺) 等的分布

10、。等的分布。5.8 荧光寿命成像显微技术荧光寿命成像显微技术Exponential decay of fluorescence13荧光寿命成像显微技术（荧光寿命成像显微技术（Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy, FLIM）的特点：）的特点：荧光寿命对荧光分子局部环境高度敏感；荧光寿命对荧光分子局部环境高度敏感；荧光寿命不受荧光强度、染料浓度的影响，并且最大程荧光寿命不受荧光强度、染料浓度的影响，并且最大程度上与荧光剂的光致漂白无关；度上与荧光剂的光致漂白无关；尽管某些荧光团的荧光谱相似，但在不同的环境下其寿尽管某些荧光团的荧光谱相似，但在不同的环境

11、下其寿命不同，因此寿命是更加敏感的环境参量；命不同，因此寿命是更加敏感的环境参量；由于供体能量转移到受体上，因此只需要测量供体的荧由于供体能量转移到受体上，因此只需要测量供体的荧光寿命，就可以测量其能量转移（光寿命，就可以测量其能量转移（FRET）。）。5.8 荧光寿命成像显微技术荧光寿命成像显微技术1414Photochem Photobiol Sci 4, 13-22, 2005 折射率，pH，Ca2+浓度等长寿命-无 FRET短寿命-有FRET分子的旋转动力学5.8 荧光寿命成像显微技术荧光寿命成像显微技术15155.8 荧光寿命成像显微技术荧光寿命成像显微技术1616外部因素则包含多方

12、面，主要有：外部因素则包含多方面，主要有：光照射是致荧光淬灭的最常见原因，；光照射是致荧光淬灭的最常见原因，；荧光物质的分子与外部分子荧光物质的分子与外部分子( (或离子或离子) )形成非形成非荧光的化合物；荧光的化合物；共振能量的转移；共振能量的转移；溶剂种类、溶剂种类、pHpH值及温度等环境条件。值及温度等环境条件。荧光淬灭是指荧光分子由内部因素和外部因素同时荧光淬灭是指荧光分子由内部因素和外部因素同时作用造成的不可逆破坏。作用造成的不可逆破坏。内部因素主要是分子从激内部因素主要是分子从激发态回到基态以非辐射跃迁形式释放能量。发态回到基态以非辐射跃迁形式释放能量。Quenching & B

13、leachingPhilippe I. H. Bastiaens and Anthony Squire. trends in CELL BIOLOGY (Vol. 9) February 1999t= (tm+ tp )/ 2tp= phase of fluorescence tm=modulation depth of fluorescence荧光寿命测量：时域和频域荧光寿命测量：时域和频域5.8 荧光寿命成像显微技术荧光寿命成像显微技术1717FLIM实现方法t= (t tm+ t t )/ 2t t = phase of fluorescence t tm=modulation dept

14、h of fluorescence)t(0et II(t)( )exp(/)iiI tatt5.8 荧光寿命成像显微技术荧光寿命成像显微技术AaBbM/Time (ns)IExcitationEmission =2abAB调制激发和发射光的直流成分分别为调制激发和发射光的直流成分分别为A和和B；调制振幅分别为；调制振幅分别为a和和b；发射光相；发射光相对于激发光的相位延迟为对于激发光的相位延迟为，解调系数为解调系数为M。ttan*)/1 (2(1/)* (1/) 1MMt相位寿命相位寿命：调制寿命调制寿命：调制频率调制频率f， =2f5.8 荧光寿命成像显微技术荧光寿命成像显微技术频域法测量荧

15、光寿命原理图频域法测量荧光寿命原理图t= (t tM+ t t )/ 219 荧光寿命的时域测量方法：荧光寿命的时域测量方法： 门控像增强器（门控像增强器（Gated image intensifier ） 时间相关单光子计数器（时间相关单光子计数器（ Time Correlated Single Photon Counting，TCSPC） 扫描相机（扫描相机（Streak camera）5.8 荧光寿命成像显微技术荧光寿命成像显微技术2020Gated image intensifier 基于门控像增强器的基于门控像增强器的FLIM5.8 荧光寿命成像显微技术荧光寿命成像显微技术2121f

16、rom W.Beckerfrom W.Becker著，屈军乐译，高级时间相关单光子计数技术，科学出版社，著，屈军乐译，高级时间相关单光子计数技术，科学出版社，20092009TCSPC测量寿命测量寿命5.8 荧光寿命成像显微技术荧光寿命成像显微技术2222TCSPC Principlefrom W.Beckerfrom W.Becker著，屈军乐译，高级时间相关单光子计数技术，科学出版社，著，屈军乐译，高级时间相关单光子计数技术，科学出版社，200920095.8 荧光寿命成像显微技术荧光寿命成像显微技术23235.8 荧光寿命成像显微技术荧光寿命成像显微技术24 时间相关单光子计数法装置示意

17、图时间相关单光子计数法装置示意图24SampleTCSPCCardFluorescence Decay AnalysisTi:SapphireLaserDichroic Fluorescence Lifetime ImageEmission FilterDetection MCP-PMTScannerLeica TCS SP2Becker & Hickl SPC 150利用利用TCSPC技术的共焦技术的共焦FLIM技术技术5.8 荧光寿命成像显微技术荧光寿命成像显微技术2525深大光电工程学院深大光电工程学院TCSPC-FLIM系统系统5.8 荧光寿命成像显微技术荧光寿命成像显微技术2626扫

18、描相机工作原理扫描相机工作原理5.8 荧光寿命成像显微技术荧光寿命成像显微技术2727 X (position)Y (time )0ns5ns基于扫描相机的基于扫描相机的FLIM:Streak-FLIM of HamamatsuFLIM opticsStreak Camera5.8 荧光寿命成像显微技术荧光寿命成像显微技术2828基于扫描相机的基于扫描相机的FLIM:STSR-MMM5.8 荧光寿命成像显微技术荧光寿命成像显微技术2929基于扫描相机的基于扫描相机的FLIM:STSR-MMM of SZUScan opticsScan opticsStreak cameraStreak cam

19、era5.8 荧光寿命成像显微技术荧光寿命成像显微技术3030用双光子用双光子FLIMFLIM测量氯离子浓度测量氯离子浓度5.8 荧光寿命成像显微技术荧光寿命成像显微技术3131FLIMFLIM的应用的应用- -区分有相互作用和没有相互作用的蛋白分子区分有相互作用和没有相互作用的蛋白分子5.8 荧光寿命成像显微技术荧光寿命成像显微技术3232FLIMFLIM的应用的应用- -研究蛋白分子之间的相互作用研究蛋白分子之间的相互作用5.8 荧光寿命成像显微技术荧光寿命成像显微技术3333FLIM的应用的应用-测量测量组织中的组织中的pH5.8 荧光寿命成像显微技术荧光寿命成像显微技术3434FLIM

20、的应用的应用-AMD的检测及诊断的检测及诊断5.8 荧光寿命成像显微技术荧光寿命成像显微技术35355.1 光学成像光学成像5.2 光学显微技术光学显微技术5.3 荧光显微技术荧光显微技术5.4 激光扫描共聚焦显微技术激光扫描共聚焦显微技术 5.5 多光子激发荧光显微技术多光子激发荧光显微技术 5.6 全内反射荧光显微技术全内反射荧光显微技术 5.7 荧光共振能量转移成像技术荧光共振能量转移成像技术5.8 荧光寿命成像显微技术荧光寿命成像显微技术5.9 光学相干层析成像技术光学相干层析成像技术5.10 非线性光学成像技术非线性光学成像技术5.11 生物光子学成像技术的发展趋势生物光子学成像技术

21、的发展趋势本本 章章 内内 容容36 X-ray 成像 磁共振成像 计算层析CT 超声成像 光学成像技术有损伤有损伤分辨力分辨力 100 100 m m系统庞大系统庞大 价格昂贵价格昂贵 无损伤无损伤分辨力分辨力 10 1增益：增益：5.9 光学相干层析成像技术光学相干层析成像技术4747数据采集与处理数据采集与处理在光电探测器输出电信号的处理上，要经过以下几个步骤：在光电探测器输出电信号的处理上，要经过以下几个步骤：首先首先要经过带通滤波器将直流和高频光强滤除，只允许外差调制信号通过；要经过带通滤波器将直流和高频光强滤除，只允许外差调制信号通过；然后然后再进行信号包络检测（解调：低通或锁相放

22、大）；再进行信号包络检测（解调：低通或锁相放大）；最后最后利用高速数字采集系统将模拟电信号转换成数字信号，并传输到计算机利用高速数字采集系统将模拟电信号转换成数字信号，并传输到计算机系统进行图像重建和显示。系统进行图像重建和显示。5.9 光学相干层析成像技术光学相干层析成像技术4848光纤式光纤式OCT5.9 光学相干层析成像技术光学相干层析成像技术4950:50光纤耦合器光纤耦合器光纤光纤OCT的特点的特点: 灵活性灵活性 可携带可携带 易于集成到其他医易于集成到其他医学成像仪器，例如：学成像仪器，例如：内窥镜内窥镜49 OCT的优势的优势 分辨率高：分辨率高： OCT图像轴向分辨率和横向分

23、辨率互不相关，能提供独立于横向分辨率的近似于微米量级的轴向分辨率。 高灵敏度：高灵敏度：由于引入了外差探测，其探测灵敏度远远高于直接探测。典型的OCT系统可达到90dB100dB的探测灵敏度，能够探测来自高散射生物组织23mm深度的光学信号。 实时成像实时成像 结构简单、成本低廉：结构简单、成本低廉： OCT成像装置的核心是迈克尔逊干涉仪，成像原理简单，制造成本相对较低，各种光学器件和检测设备易于在市场中购买。 与导管和内窥镜兼容：与导管和内窥镜兼容：基于光纤的设计可以使OCT系统直接和导管或者内窥镜结合起来。 OCT的缺点：的缺点： 分辨率低于双光子荧光或共聚焦显微镜。分辨率低于双光子荧光或共聚焦显微镜。5.9 光学相干层析成像技术光学相干层析成像技术5050OCT在医学诊断领域的主要应用在医学诊断领域的主要应用OCT技术在眼科疾病、牙科疾病、心血管疾病、内腔肠胃道技术在眼科疾病、牙科疾病、心血管疾病、内腔肠胃道疾病、皮肤癌的早期诊断以及胚胎发育生物学等研究中，都疾病、皮肤癌的早期诊断以及胚胎发育生物学等研究中，都具有重要的应用价值：具有重要的应用价值：眼科检查眼科检查皮肤烧伤检查皮肤烧伤检查内腔活检内腔活