生理学方法及其

1、第六章 第五节生理学方法及其 在中医研究中的应用 人体生理学是研究人体机能活动及规律的科学，又是一门实验性科学。第一段的其余部分简述了生理学的发展历史。第二段主要讲了与中医的关系。如何采用生理的方法去研究中医？能不能作一个假设，比如脾虚证的辨证标准、辨证分型、辨证论治及其机理，有没有办法？采用什么生理学的方法？采用生理方法研究中医的必要性。一、生理学的主要方法引言部分介绍了“现代生理学” 两大研究方法的分类，即急性实验和慢性实验两类：1. 急性实验法（包括离体组织、器官实验法）其优点是可以人工控制条件，有利于排除其它因素，专对某器官组织的基本功能和生理特性进行较细致的观察与分析，缺点是动物脱离

2、整体或受解剖或麻醉的影响下进行的，所得结果常有一定的局限性。事例：拿不同的肿瘤组织来说，细胞膜上一些生物泵功能的离体检测，中药的调整作用，发生的时间。2. 慢性实验法是在完整的正常动物机体上对某种生命现象进行观察和实验研究。这种方法所得资料更符合正常的生理活动规律，但实验的难度大、要求高。事例：危重病房的长期监测、先于人类上天的实验动物生理观测。上述两种实验方法可以取长补短，互相补充。这样的例子会很多，大家能不能举一些例子？第二段，介绍了另外的分类方法，即“根据生理学研究的层次不同，又可以分成三个水平：细胞水平、器官水平和整体水平”。这样分还在于讲清了由表入里、由浅入深的研究过程。而医学实验中

3、为了说明问题，往往需要反反复复的这样的研究，从粗到细，再从细到粗，直到把问题搞清楚。看看消化道，比如腹泻，可以举出不同层次的观察吗？意义如何？又比如呼吸系统，如哮喘，可以举出不同层次的观察吗？意义如何？有哪些方法，太多！这里没有办法一一介绍，百分之一也难，所以，教材推荐参考文献1-7所列举的专著，以及专题检索有关学术刊物。我们一道来看看。陈次青. 生理学. 人民卫生出版社. 1991方福德等主编. 现代医学实验技巧全书（下册）. 北京医科大学中国协和医科大学联合出版社. 1995韩济生主编. 神经科学纲要. 北京医科大学中国协和医科大学联合出版社. 1993徐叔云等主编. 药理实验方法学. 人

4、民卫生出版社. 1994周衍椒等主编. 生理学方法与技术（第一-三集）. 科学出版社. 1984, 1987梅懋华等主编. 生理学方法与技术（第四集）. 科学出版社. 1986季钟朴主编. 现代中医生理学基础. 学苑出版社. 1991大家有兴趣，可以借阅。（一）生理学实验常用仪器请注意，这里介绍的主要是以生物电激发和检测的常用仪器。应该还有许多。1阴极射线示波器。该仪器用来观察与测量电压、电流波形与数值大小的一种电子仪器。由于它的惰性小，灵敏度高，测量的频率范围又很宽，故在电生理实验中用来显示微弱而变化迅速的生物电是不可缺少的工具。根据生物电特点，示波器应为高灵敏度，扫描速度慢（2s/cm1s

5、/cm），频率为1MHz。这类设备很经典，目前不少已经电脑化，或者直接与电脑相连，利用电脑把信号以数字形式存贮起来、进行信号处理、图像再现。2生物信号放大器。生物电信号电压很小，有的只有几个微伏，而且信号源内阻大。必须加接一个高保真放大的生物电放大器将这些微弱信号先行放大，方能在示波器或记录仪上观察或描绘出生物电信号的变化波形。一个好的生物电放大器应具备下列性能：（1）频率响应范围大（通频带从0-100kHz），（2）有足够的放大能力，（3）高的辨差比，（4）低噪声，（5）高输入阻抗。 3电子刺激器。生物组织只有在刺激条件下才产生反应。在电生理实验中一般首选电子刺激器作为刺激源。因为电刺激不易

6、损伤组织，又能定量而准确地重复使用。矩形波（方波）脉冲的幅度、波宽和频率都可以分别进行调节，而且根据刺激参数计算刺激的能量，所以电子刺激器是电生理实验必不可少的。一般将矩形波作为刺激脉冲，所要求的参数包括：（1）幅度（刺激强度），（2）波宽（刺激作用时间），（3）频率，（4）延迟（从触发脉冲到矩形波刺激之间的一段时间），（5）同步输出，用于触发示波器的外触发扫描，也可用于触发其它需要与刺激同步的仪器启动工作，（6）刺激方式：有单刺激、连续刺激及双脉冲刺激。另外，在刺激器的输出端需要连接一个电刺激隔离器。因为在记录生物电时，由于刺激器输出的一端为地，会把刺激信号带入记录系统而掩盖生物电波形，使用

7、隔离器可减少刺激伪迹。 4多道生理记录仪。多道生理记录仪是可以同时观察、记录、处理脑电、心电、肌电、血压呼吸及肌肉收缩曲线等多种生理变化参数的综合性医用电子仪器。多道生理记录仪一般由传感器、前置放大器、控制器、示波监视器、记录仪及机架与电源供应等不同部分组成，国内常用的有二道、四道、八道记录仪。 5生理数据处理机。生理数据处理机是一种基于微机的专用生物电数据采集和处理仪器，已经日益广泛地作为生理实验强有力工具。它主要用于各种生物电如神经动作电位、心电、脑电、肌电、各种诱发电位以及血压、脉搏、呼吸等通过换能器转换来的生理参数电信号的测量，能对上述各种信号进行实时处理，具有波形采集、叠加平均、资料

8、分析、记忆示波等多种功能，是教学和科研的有用工具。 6膜片钳实验装置。做膜片钳实验除了一般电生理所需的仪器外，特殊的仪器有膜片钳放大器、倒置显微镜、三维液压微操纵器、微电极拉制仪和计算机及相关软件等。因为膜片钳实验所用的标本多数是放在培养皿中的细胞，需要在相差倒置显微镜下，借助微操纵器进行操作。膜片钳放大器内通常含有一个标准的差分放大器线路，将记录到的电流以电位差的形式输出，所以膜片钳放大器的核心部分是一个高增益的电流-电压转换器，具有高输入阻抗，低躁声，宽频带等特性。此外，还有频率提升部分，加法器，瞬时补偿和钳位放大器等部件组成。膜片钳装置和检测到的信号（二）生理学实验常用的方法1神经系统。

9、电生理学方法是研究神经或神经-肌肉机能状态的常用的方法。尤其是细胞外记录方法，利用可兴奋组织（如神经、肌肉）的生物电现象，观察组织细胞的正常功能、病理变化及药物的作用。细胞外记录法是把引导电极安放在神经、肌肉组织的表面或附近，引导神经、肌肉组织的电活动。由于可兴奋细胞兴奋时其兴奋的部位产生去极化，未兴奋的部位处于正常极化状态，在容积导体中的两部位间由于电位不同，电流从一点流向另外一点，放置于细胞表面的电极就会记录出两者之间所产生的电位差。小鼠单位时间内移动跟踪摄像头和数据处理系统在针刺镇痛原理的研究中有人用剥制细束法记录猫外周神经中单位电活动、脊髓白质中单位电活动、脊髓电位等方法和脑电图、脑诱

10、发电位、脑干电位的记录等，在“肾主耳”的研究则是采用内耳生物电（听神经动作电位、内耳毛细胞微音器电位）记录“肾”与内耳听觉功能的关系。这些方法均为常用的细胞外记录方法。随着生理学研究发展到细胞水平，开始采用细胞内记录的方法，这是研究神经、肌肉等细胞基本生物物理特性的有力手段。如欲记录膜电位，必须结合玻璃微电极技术，将电极插入细胞膜内，这种方法称细胞内记录法，用于测量膜电位、神经元的兴奋性突触后电位（EPSP）和抑制性突触后电位（IPSP）等。近二十年来发展出的膜片钳技术，是一种可以控制跨膜电位用来研究细胞膜离子单通道的理想技术。膜片钳技术的应用使生理学研究进一步发展到了微观的分子水平。 2循环

11、系统。无创伤心功能测定（包括心电图ECG、心音图PCG、颈动脉搏动描记曲线CPT和心尖搏动图ACG）、心室肌收缩功能的测定、血管张力测定、脉搏图的测定等方法是研究“心主血脉”、脉象的常用的方法。用微循环显微镜系统进行甲襞微循环观察的方法是研究“血瘀证”的常用指标。下图是大鼠尾部血压检测系统。体外组织灌流和生理检测系统3呼吸系统。通过呼吸运动描记方法，可以测定肺功能状况，这些方法包括胸腔内压记录、胸廓运动记录、呼吸肌活动及肌电图描记、呼吸气流速度测定等方法。例如观察“肺气虚”时肺功能受损情况，这些方法都是经常使用的。4消化系统。胃肠电图和胃肠运动波的记录方法能反应胃肠功能状况，是研究“脾主运化”

12、的常用指标；木糖吸收试验和唾液淀粉酶活性测定已被公认为“脾气虚证”的客观指标。部分电生理检测系统二、用生理学方法研究中医的现状与范例第一段介绍了中医生理研究的特殊性。第二段，提出中医学必须吸取现代科学技术的精华，包括把生理学的实验手段引用到中医研究中来。第三段简述了近半个世纪来，中医药生理研究进展。主要集中在针灸、针麻原理，听觉生理，胃肠电生理等方面的工作。以后主要介绍我校曾兆麟教授课题组肾与耳关系开展的工作，以及广州中医药大学王建华教授课题组脾主运化的研究工作。（一）肾与耳关系的研究肾开窍于耳的中医理论基础及研究背景：中医肾的概念涉及到机体功能的范围很广，包括生长、发育、生殖、泌尿、内分泌及

13、水盐代谢等许多方面。其中，肾与耳之间的关系十分密切，即“肾开窍于耳”。听觉与肾的关系十分密切。肾气足则听觉聪敏，肾气衰则耳鸣耳聋。临床上对肾虚引起的耳鸣、耳聋及链霉素中毒性耳聋用补肾方法防治取得一定效果。肾阴不足、耳窍失聪者，宜滋补肾阴，填精聪耳；肾阳虚损、耳窍失聪，则宜补元阳，益肾聪耳。同时，现代研究表明下丘脑-垂体-肾上腺皮质、甲状腺及性腺三个轴的生理功能，集中体现了中医肾的本质。选题的背景信息（一）。那么，中医肾与耳关系中的肾在结构和功能上究竟指的是什么？又是通过什么生理机制来达到这种联系？有鉴于此，近二十年来，上海中医药大学的曾兆麟等采用内耳生物电、内耳形态学、组织化学、超微结构及药理

14、学等实验方法，以肾上腺皮质激素、甲状腺激素、中医补肾药等进行干预，观察肾与耳的关系。1肾与耳关系物质基础的现代理论假说及其实验（1）醛固酮与肾和耳的关系临床研究表明肾阳虚和肾阴虚患者尿液中糖皮质激素的排出量发生改变，因此推测肾上腺皮质是中医肾功能中的一个重要组成部分。在肾主水液的概念中，除了肾的泌尿作用外，还包括水盐代谢调节机制，而盐皮质激素在其间发挥了重要作用。现代医学的研究发现肾脏和内耳中的某些细胞在生理功能、形态结构、酶的含量以及药物反应等方面均有相似的特性。特别是对内耳有毒性的抗生素（如新霉素、卡那霉素等）对肾脏亦有毒性作用。抑制肾功能的利尿剂（如利尿酸、速尿）同样可以使人和动物耳聋，

15、并对内耳生物电产生明显的抑制作用。先天性肾功能障碍（Alport综合征）常伴随先天性耳聋。晚期肾功能不全患者也常出现听力下降。选题的背景信息（二）。既然肾脏与耳在疾病和药物反应等方面有如此之多的共同特性，那么调节肾脏功能的物质对耳的功能也可能起调节作用，即调节肾功能的盐皮质激素醛固酮可能在肾主耳的机理中起重要作用。假说。为了证明这一假设，通过豚鼠动物实验，利用声音引起的耳蜗微音器电位CM（听毛细胞感受器电位）和听神经动作电位N1为指标，在利尿酸（耳毒性利尿剂）造成内耳病理模型的急性实验中，证明醛固酮可显著减弱利尿酸对内耳生物电的抑制作用。而醛固酮受体竞争性拮抗剂安体舒通则明显增强利尿酸对内耳生

16、物电的抑制作用。其作用原理可能是由于醛固酮增加内耳细胞ATP酶的活性和促进细胞的氧化过程所致。进而利用同位素示踪技术，测定了3H-醛固酮在豚鼠耳蜗及身体其他组织中的含量、分布及衰减过程，结果表明3H-醛固酮在耳蜗基底膜（包括柯蒂氏器）及血管纹中的含量较高、衰减过程慢，其时相变化与小肠、肾等醛固酮靶组织相似，说明耳蜗组织中可能有醛固酮受体存在，密切了肾与耳的关系。 问题，1）进一步该如何深入？2）醛固酮在其他组织的分布与作用？（2）甲状腺激素与肾和耳的关系随着肾本质的临床和动物实验研究工作的不断深入，有人提出下丘脑-垂体-甲状腺轴的功能与中医的肾有密切联系。例如，甲状腺功能降低的患者，其临床表现

17、与典型的肾阳虚表现一致，在肾虚患者的尸检中曾发现有甲状腺功能低下的表现；肾阳虚的动物造型也发现胸腺、肾上腺皮质、甲状腺等内分泌腺重量下降，组织退化；另外，肾阳虚患者血清中三碘甲状腺原氨酸（T3）含量降低。以上现象都说明肾阳虚患者甲状腺功能是降低的。动物实验还表明补肾助阳的中药能改善甲状腺机能减退动物的能量代谢。显然，甲状腺是组成中医肾本质的内容之一。至于甲状腺与耳的关系，一个世纪以前就发现先天性与后天性甲状腺功能不足的患者，伴有不同程度的听力下降。病理解剖亦证明先天性甲状腺功能降低（克汀病）者，内耳与中耳发育障碍。由此表明，甲状腺激素是维持听觉功能的重要因素。选题的背景信息，或科学依据。为了进

18、一步说明甲状腺激素在中医肾与耳关系中所起的作用，设想适当地增加一些外源性甲状腺激素是否能增强内耳对一些致聋耳毒性药物的抵抗力。即类似于采用温肾壮阳法，使肾气充盈耳闻五音。假说。在豚鼠的实验中，利用内耳生物电、内耳形态学以及细胞琥珀酸脱氢酶（SDH）的活性等指标观察了正常对照组、口服甲状腺组及切除甲状腺组动物的听神经电位、微音器电位幅值的变化及其对利尿酸（耳毒性利尿剂）反应及调节作用。实验结果说明给予适当剂量甲状腺素的动物内耳抵抗能力比正常动物大，而切除甲状腺的动物抵抗能力最差。利尿酸能抑制听毛细胞中的琥珀酸脱氢酶。给利尿酸后，服甲状腺素组动物该酶的活性最强，对照组次之，切除甲状腺组最弱，差别显

19、著。有研究表明，甲状腺素具有减轻卡那霉素和庆大霉素对听觉功能的损害作用。这二种抗生素均属氨基糖甙类抗生素，在临床上常引起耳聋。（3）缺铁与肾与耳的关系临床上观察到有肾虚症状的耳聋患者，血清中铁的含量比无肾虚症状的患者低，而且降低的程度与耳聋的程度成比例关系；因而提出铁可能是肾开窍于耳的生物化学物质基础，由肾通过含铁酶参予内耳细胞呼吸和生物氧化过程而实现。肾虚导致铁代谢障碍造成耳功能抑制。2补肾药防治耳聋对“肾主耳”理论的反证已有实验证明补肾方药对防治肾虚耳聋有一定作用。例如滋阴补肾代表方六味地黄汤能减轻卡那霉素对动物听觉功能的损害作用。实验结果表明，服六昧地黄汤豚鼠接受一定剂量卡那霉素后，听力

20、及内耳生物电（微音电位及听神经电位）下降程度均比对照组轻。酸性磷酸酶（ACP）是溶酶体中重要酶系之一，参与消化外源性异物和分解细胞自身的废弃物。当摄入过多有害物质可导致溶酶体酶逸出到细胞质内，从而使细胞损伤或死亡。从内耳铺片酸性磷酸酶组化反应可见对照组耳蜗毛细胞破坏严重，而服中药组毛细胞的损害较轻，可能补肾中药具有增强溶酶体膜的稳定性，从而保护内耳听毛细胞的作用。 在细胞超微结构方面，服中药组动物线粒体变化程度、光面内质网及质膜下内质网扩张范围及程度都比对照组轻，其结果表明补肾药能部分减轻卡那霉素对动物听觉功能的损害作用。其作用机制可能为通过补肾药对机体全身性的作用而增强内耳对耳毒性药物的抵抗

21、能力或直接促进内耳细胞功能活动所致。实验还证明六味地黄汤同样也能减轻庆大霉素的致聋作用。 又如大剂量氢化可的松具有促进蛋白质和脂肪大量分解，降低糖的利用及抑制免疫功能等作用，使动物出现类似阳虚的症状和体征如体重减轻、活动减少、机体反应降低、便稀、脱毛、畏寒和生长停滞等现象。在中医理论实验研究中，常把这种动物称为肾阳虚动物模型。醋酸氢化可的松造成肾阳虚模型的豚鼠，给予速尿（耳毒性利尿剂）后，其内耳生物电下降幅度和毛细胞与血管纹细胞中琥珀酸脱氢酶（SDH）的活性被抑制的程度大大超过正常豚鼠。当动物接受氢化可的松的同时，给予温补肾阳药右归丸，则速尿引起的内耳生物电下降幅度和SDH被抑制程度均大为减弱。表明右归丸能增强肾阳虚动物的听觉功能，减轻耳毒性药物对耳的损害作用。肾与耳的研究是在生理科学领域通过生理、生化、病理、药理等综合手段研究祖国医学的尝试。近二十年的研究工作不仅为肾主耳