第六章_DNA的重组与转座

1、目目 录录第 6 章 DNA的重组与转座目目 录录6.1 DNA的重组nDNA分子内或分子间发生遗传信息的重新组合叫遗传重组或基因重排。nDNA重组是生物进化的关键基础。目目 录录发生在同源序列间的重组称为发生在同源序列间的重组称为同源重组同源重组(homologous recombination)，又称，又称基本重基本重组组。是最基本的。是最基本的DNA重组方式，通过链的断重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。行单链或双链片段的交换。 同源重组需要一些重组蛋白和酶，如同源重组需要一些重组蛋白和酶，如Rec A、B

2、、C、D及及DNA连接酶等。连接酶等。一、同源重组一、同源重组目目 录录Holliday模型中，同源重组主要模型中，同源重组主要4个关键步骤个关键步骤 两个同源染色体两个同源染色体DNA排列整齐排列整齐一个一个DNA的一条链断裂、并与另一个的一条链断裂、并与另一个DNA对应的链连接，形成对应的链连接，形成Holliday中间体中间体通过分支移动产生异源双链通过分支移动产生异源双链DNAHolliday中间体切开并修复，形成两个双链中间体切开并修复，形成两个双链重组体重组体DNA，分别为：，分别为：片段重组体片段重组体(patch recombinant)拼接重组体拼接重组体(splice re

3、combinant) 目目 录录片段重组体片段重组体 ： 切开的链与原来断裂的是同一条链，重组切开的链与原来断裂的是同一条链，重组体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本DNA。拼接重组体拼接重组体： 切开的链并非原来断裂的链，重组体异源切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双链区的两侧来自不同亲本双链区的两侧来自不同亲本DNA。 内切酶内切酶 (recBCD)DNA侵扰侵扰(recA)分支迁移分支迁移 (recA) 内切酶内切酶(recBCD) DNA 连接酶连接酶5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5

4、 3 5 3 5 3 3 3 5 3 5 3 3 5 5 3 5 3 5 3 Holiday中间体中间体5 3 5 3 5 3 5 3 目目 录录Holiday中间体中间体5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 5 5 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 3 内切酶内切酶(ruvC)内切酶内切酶(ruvC) DNA连接酶连接酶 DNA连接酶连接酶片段重组体片段重组体拼接重组体拼接重组体目目 录录目目 录录DNA同源重组是一个十分精确的过程，哪怕只有一个核苷酸的差错都会造成基因失活。同源重组的

5、分子基础是链间的配对，通过碱基配对才能找到正确位置，进行链的交换。当两同源DNA分子之一发生双链断裂，经核酸酶和解螺旋酶作用，产生具有3末端的单链，它在另一DNA分子的同源区寻找互补链并与之配对。相对应的链则被置换出来，与原来断裂目目 录录的链配对经修复合成和链的再连接，形成两个交叉，而不是单链交换时形成的一个交叉。值得注意的是，在两交叉之间，由交换和分支移动产生的是异源双链，而由修复合成产生的是同源双链(图4-2)。实验表明，两DNA分子必需具有75 bp以上的同源区才能发生同源重组，同源区小于此数值将显著降低重组率。目目 录录在不同生物体内同源重组的具体过程可以有许多变化，但基本步骤大致相

6、同。同源性并不意味序列完全相同。两DNA分子只要含有一段碱基序列大体类似的同源区，即使相互间略有差异，仍然可以发生重组。同源重组是最基本的重组方式，它参与各种重要的生物学过程。复制、重组和重组修复三个过程是密切相关.目目 录录二、细菌的基因转移与重组二、细菌的基因转移与重组（一）接合作用（一）接合作用当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接触时，质粒触时，质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至从一个细胞（细菌）转移至另一细胞（细菌）的另一细胞（细菌）的DNA转移称为转移称为接合作用接合作用(conjugation)。目目 录录可接合质粒如可接合质粒如 F 因子因子(F

7、factor) 质粒质粒 细菌染色体外的小型环状双链细菌染色体外的小型环状双链DNA分子分子目目 录录目目 录录目目 录录目目 录录F质粒是双链闭环的大质粒，总长约100 kb，复制起点为oriV。F质粒可以在细胞内游离存在，也可以整合到宿主染色体内，因此属于附加体(episome)。其与转移有关的基因(tra)占据质粒的三分之一(33 kb)，称为转移区，包括编码F性菌毛(F pilus)、稳定接合配对、转移的起始和调节等，总共约40个基因。目目 录录（二）转化作用（二）转化作用通过自动获取或人为地供给外源通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新，使细胞或培养的受体细

8、胞获得新的 遗 传 表 型 ， 称 为的 遗 传 表 型 ， 称 为 转 化 作 用转 化 作 用 (transformation)。 目目 录录具有摄取周围环境中游离DNA分子能力的细菌细胞称为感受态细胞(competent cell)。很多细菌在自然条件下就有吸收外源DNA的能力(如固氮菌、链球菌、芽孢杆菌、奈氏球菌及嗜血杆菌等)，虽然感受态。目目 录录转化经常是瞬时的，与特定的生理状态有关。转化过程涉及细菌染色体上10多个基因编码的功能。有些细菌在自然条件下不发生转化或转化效率很低，但在实验室中可以人工促使转化。例如大肠杆菌，用高浓度Ca2+处理，可诱导细胞成为感受态，重组质粒得以高效转

9、化。人工转化的机制目前还不十分清楚，可能与增加细胞通透性有关。目目 录录分离DNA SH 型肺炎双球菌 RH 型肺炎双球菌目目 录录3.细菌的转导转导(transduction)是通过噬菌体将细菌基因从供体转移到受体细胞的过程。 普遍性转导:是指宿主基因组任意位置的DNA成为成熟噬菌体颗粒DNA的一部分而被带入受体菌； 局限性转导:某些温和噬菌体在装配病毒颗粒时将宿主染色体整合部位的DNA切割下来取代病毒DNA。目目 录录在上述两种类型中，转导噬菌体均为缺陷型，因为都有噬菌体基因被宿主基因所取代。缺陷型噬菌体仍然将颗粒内DNA导入受体菌，前宿主的基因进入受体菌后即可与染色体DNA发生重组。 噬

10、菌体的生活史噬菌体的生活史溶菌生长途径溶菌生长途径(lysis pathway)溶源菌生长途径溶源菌生长途径(lysogenic pathway)例例目目 录录目目 录录4细菌的细胞融合在有些细菌的种属中可发生由细胞质膜融合导致的基因转移和重组。在实验室中，用溶菌酶除去细菌细胞壁的肽聚糖，使之成为原生质体，可人工促进原生质体的融合，由此使两菌株的DNA发生广泛的重组。 目目 录录(三) 重组有关的酶已经分离并鉴定了原核生物和真核生物促进同源重组各步骤有关的酶，研究最多的还是大肠杆菌的酶。在大肠杆菌中，RecA蛋白参与重组是最关键的步骤。RecA有两个主要的功能：诱发SOS反应和促进DNA单链的

11、同化(assimilation)。目目 录录所谓单链同化即是指单链与同源双链分子发生链的交换，从而使重组过程中DNA 配对、Holliday中间体的形成，分支移动等步骤得以产生。当RecA与DNA单链结合时，数千RecA单体协同聚集在单链上，形成螺旋状纤丝。RecF、RecO和RecR蛋白调节RecA纤丝的装配和拆卸。RecA蛋白相对分子质量为38000，它与单链DNA结合形成的螺旋纤丝每圈含六个单体，螺旋直径10nm，碱基间距0.5nm。目目 录录此复合物可以与双链DNA作用，部分解旋以便阅读碱基序列，迅速扫掠寻找与单链互补的序列。互补序列一旦被找到，双链进一步被解旋以允许转换碱基配对，使单

12、链与双链中的互补链配对，同源链被置换出来(图6-3)。链的交换速度大约为6 bp/s，交换沿单链53方向进行，直至交换终止，在此过程中由RecA水解ATP提供反应所需能量。目目 录录图6-3RecA蛋白介导的DNA链交换模型 A:DNA链交换的侧面观: 1.RecA蛋白与单链DNA结合；2.复合物与同源双链DNA结合；3.入侵单链与双链中的互补链配对，同源链被置换出来;B:DNA链交换过程RecA蛋白的横切面 目目 录录任何部位的单链DNA都能借助RecA蛋白与同源双链DNA进行链的交换。单链DNA可以由许多途径产生，RecBCD酶是产生参与重组的DNA单链主要途径。该酶的亚基分别由基因rec

13、B、recC和recD编码。Rec BCD酶具有三种酶活性： 依赖于ATP的核酸外切酶活性， 可被ATP增强的核酸内切酶活性， ATP依赖的解螺旋酶活性。当DNA分子断裂时，它即结合目目 录录在其游离端，使DNA双链解旋并降解，解旋所需能量由ATP水解供给。及至酶移动到chi位点(5GCTGGTGG3)，在其3侧46个核苷酸处将链切开，产生具有3末端的游离单链。随后单链可参与重组各步骤。大肠杆菌基因组共有1009个chi位点，分布在DNA各部位，平均5kb有一个，成为重组热点。目目 录录由于DNA分子具有螺旋结构，在持续进行链的交换时需要两DNA分子发生旋转。RecA能够介导单链绕入另一DNA

14、分子，并水解ATP。一旦Holliday中间体形成，即由RuvA和RuvB蛋白促进异源双链的形成。RuvA蛋白能够识别Holliday联结体(junction)的交叉点，RuvA四聚体结合其上形成四方平面的构象，使得分支点易于移动，RuvA还帮助RuvB六聚体环结合在双链DNA上，位于交叉点上游。目目 录录RuvB是一种解螺旋酶，通过水解ATP而推动分支移动(图4-4)。RuvAB复合物的移动速度约为1020 bp/s。同源重组最后由RuvC将Holliday联结体切开，并由DNA聚合酶和DNA连接酶进行修复合成。RuvC是一种核酸内切酶，特异识别Holliday联结体并将其切开。它识别不对称

15、的四核苷酸ATTG，此序列因而成为切开Holliday联结体的热点，并决定目目 录录图6-4 Ruv AB复合物结合于Holliday联结体的模型 目目 录录结果是片段重组还是拼接重组，即异源双链区两侧来自同一分子还是不同分子。 相当于原核生物中与重组有关酶的对应物也已在真核生物中发现。在酿酒酵母中的rad51基因与大肠杆菌recA基因同源，二者的功能有关。该基因突变造成双链断裂积累，并且无法形成正常的联会复合物，但此蛋白质不能在体外与单链DNA形成纤丝，表明原核生物与真核生物的同源重组机制可能有所不同。目目 录录二、 特异位点重组 特异位点重组广泛存在于各类细胞中，起着十分特殊的作用，彼此有

16、很大的不同。它们的作用包括某些基因表达的调节，发育过程中程序性DNA重排，以及有些病毒和质粒DNA复制循环过程中发生的整合与切除等。此过程往往发生在一个特定的短的(20200 bp)DNA序列内(重组位点)，并且有特异的酶(重组酶)和辅助目目 录录因子对其识别和作用。特异位点重组的结果决定于重组位点的位置和方向。如果重组位点以相反方向存在于同一DNA分子上，重组结果发生倒位。重组位点以相同方向存在于同一DNA分子上，重组发生切除；在不同分子上，重组发生整合。目目 录录特异位点重组的结果依赖于重组位点的位置和方向重组位点以白箭头表示。A重组位点反方向位于同一DNA分子，重组结果发生倒位。B重组位

17、点同方向位于同一DNA分子，重组发生切除；位于不同分子，重组发生整合目目 录录 位点专一性重组最早是在噬菌体的遗传学研究中发现的。DNA通过重组整合到大肠杆菌染色体的专一性位点上，转变成为原噬菌体DNA的非活性状态。一般位点专一性重组都具有整合作用的两个基本特征：交换是相互的和保存原先的D N A ， 是 典 型 的 保 守 性 重 组（conservative recombination）；它发生在噬菌体和细菌DNA短同源序列目目 录录中的专一性核苷酸上，在高等生物细胞中，最重要的例子是通过一组前体序列的位点专一性重排构建多种多样的专一抗体基因。本节简要介绍噬菌体DNA的整合与切除。 目目

18、录录噬菌体的整合与切除噬菌体的整合与切除 噬菌体侵入大肠杆菌细胞后，面临着裂解生长还是溶源生长两种生活型的选择，其DNA在不同生活型之间的转换包括两种状态：进入溶源状态需要DNA整合（integrate）进宿主DNA，噬菌体DNA是细菌染色体的整合部分；由溶源状态进入裂解状态需要DNA从宿主DNA上切除（excise）下来，DNA在宿主细菌中目目 录录 以环状分子独立存在。这里，整合和切除均通过细菌DNA和DNA上特定位点之间的重组而实现。这些特定位点叫附着位点（attachment site或att）。细菌的附着位点称attB，由序列B、O和B组成，噬菌体的附着位点称attP，由序列P、O和

19、P组成。其中B、B、P、P的序列各不相同，而O序列是attB和attP所共有的，说明在这些位点处发生的重组反应。目目 录录 整合整合BOBBOB图图6-15 噬菌体的位点专一性重组噬菌体的位点专一性重组 Int 切除切除 Xis IHFPOBattRBOPattL原噬菌体原噬菌体DNAIntIHF细菌细菌DNA噬菌体噬菌体DNAattBattPPOPPOP+ +目目 录录 由于噬菌体DNA是环状的，在重组过程中，它以线性形式插入细菌染色体中，此时原噬菌体被重组产生的两个新att位点所固定。所以，形成这两个新的附着位点attL（BOP）和attR（POB）是很重要的，这样可以使整合和切除反应不在

20、一对相同的反应序列之间发生。整合过程要求在attB和attP之间进行识别，而目目 录录 切除过程则在attL和attR之间识别。因此，位点专一性重组反应的定向特征取决于重组位点的识别。尽管重组反应是可逆的，但反应导向则由不同条件决定，这是噬菌体生活过程的重要特征，因为它保证了整合反应不会立即被切除反应所逆转。反之亦然。 目目 录录三、 转 座 重 组 转座因子(transposable element)是一种可以由染色体的一个位置转移到另外位置的遗传因子，也就是一段可以发生转座(transposition)的DNA，又称为转座子(transposon)。转座的位置通常或多或少是随机的。当转座子

21、插入一个基因内时，该基因即失活，如果是重要的基因就可能导致细胞死亡。因此转座目目 录录 必须受到控制，并且频率都很低。转座子对基因组而言是一个不稳定因素，它可导致宿主序列删除、倒位或易位，并且其在基因组中成为“可移动的同源区”。位于不同位点的两个拷贝转座子之间可以发生交互重组，从而造成基因组不同形式的重排。有些转座子与基因组的关系犹如寄生，它们的功能只是为了自身的扩增与繁衍，因此被称为是自私的DNA(selfish DNA)。目目 录录 早在20世纪40年代，美国遗传学家McClintock B在研究玉米的遗传因子时发现，某些基因活性受到一些能在不同染色体间转移的控制因子(controllin

22、g element)所决定。这一发现与当时传统的遗传学观点相抵触，因而不被学术界所普遍接受。直到60年代后期，美国青年细菌学家Shapiro J在大肠杆菌中发现一种由插入序列目目 录录 (insertion sequence,IS)所引起的多效突变，之后又在不同实验室发现一系列可转移的抗药性转座子，才重新引起人们重视。1983年McClintock被授予诺贝尔生理学与医学奖，距离她公布玉米控制因子的时间已有32年之久。 目目 录录(一) 细菌的转座因子细菌的转座因子有两类：一类为插入序列(IS)，是简单的转座子，除转座所需基因外不携带任何标记基因，它的存在只能借助插入位点有关基因的失活来判断，

23、或者通过分子杂交和测序来检测。 另一类是复杂转座子(Tn)，除转座酶(transposase)基因外还携带各种标记基因，因而易于检测其存在。 目目 录录1插入序列插入序列是最小的转座因子。所有插入序列 的 两 端 都 有 反 向 重 复 ( i n v e r t e d repeats)，反向重复为转座酶识别所需，目目 录录 通常重复序列长度为1525 bp。重复序列有时只是类似，并非完全相同。 IS的大小范围是768bp-7.5Kb，但大部分小于2.5Kb。每种IS元件具有不同的序列，但有共同的组织形式，即由一个中央区域和两侧不完全反向的末端重复序列构成。这些末端重复序列的大小、序列、相关

24、性是不同的；中央区域可能含有13个开放阅读框，其中一个目目 录录 编码转座酶，没有和转座功能无关的基因。图 6-19是插入序列IS1的结构，IS1含有转座酶基因，负责IS1的移动，该基因的两端为24 pb的反向重复序列。 图图6-19 插入序列插入序列IS 1的结构的结构IRIR2424bpbp2424bpbp720720bpbpIS1转座酶基因目目 录录 2转座子 转座子除编码转座功能有关的基因外还携带抗性或其他标记基因。转座子按其结构又分为两类：一类为组合因子(composite element)，由个别模件组合而成，通常包括两个插入序列作为两臂，中间为标记基因 。 另 一 类 为 复 合

25、 因 子 ( c o m p l e x element)， 目目 录录 含有转座酶基因、解离酶(resolvase)基因以及标记基因，两端为反向重复，无插入序列。组合型的转座子很可能是通过一个插入序列的拷贝插在附近区域而形成的。两个插入序列中间夹着一段序列即可构成一个转座单位。每个插入序列两端为反向重复，因此，无论两插入序列处于正向还是反向位置，作为转座单位其两端均有可被转座酶识别的反向重复序列。目目 录录如果两个插入序列正好位于抗性基因两侧，该转座单位携带的性状对宿主细胞是有利的，因而具有选择优势。组合转座子的两个插入序列以正向或反向(更常见)位于两端，它们的序列可以不完全相同，有时只有一

26、个插入序列具有转座活性，另一个已在多次传代中失去活性。组合转座子的结构如下：目目 录录 图图6-20 复合转座子的结构复合转座子的结构Tn1681Tn1681IS1IS1552552bpbpIRIRIRIR大肠杆菌热稳定毒素I基因目目 录录 3转座过程与效应 转座酶能够识别转座子的末端反向重复序列并且在其3端切开，同时在靶部位交错切开单链，它的5突出末端与转座子的3末端连接，形成Shapiro中间体。不同种类转座子形成与靶序列连接中间体的过程大致相同；随后步骤各不一样。按其转座过程是否发生复制，可分为非复制转座和复制转座两类。目目 录录 非复制转座又称为保留性转座,转座子从原来位置上切除下来转

27、入新的位置，其两条链均被保留。 复制转座则在形成靶部位与转座子连接中间体后即进行复制。通过复制使原来位置与新的靶部位各有一个转座子，其一条链是原有的，另一条链是新合成的。复制转座使给体与受体分子连在一起，成为共整合体(cointegrate)，因此下一步必须通过重组将二者拆开。目目 录录 图6-10非复制转座与复制转座的基本过程 目目 录录 所有转座因子都有在基因组中增加其拷贝数的能力。此过程可以借助两种方式来完成：一是通过转座过程的复制(复制转座)；另一是从染色体已完成复制的部位转到尚未复制的部位，然后随着染色体而复制。非复制转座的转座因子只能借后一种方式来扩增。共整合体含有两个拷贝的转座子，故可通过同源重