细胞生物学 03 细胞生物学研究方法

1、 第三章第三章 细胞生物学研究方细胞生物学研究方法法主讲主讲 李桂兰李桂兰 首先我们学习首先我们学习第一节第一节 细胞的形态观察技术细胞的形态观察技术第三节第三节 细胞工程技术细胞工程技术目目 录录第二节第二节 细胞组分的分析与检测技术细胞组分的分析与检测技术F显微镜技术显微镜技术第一节第一节 细胞的形态观察技术细胞的形态观察技术m (10-6 m ) nm (10-9 m ) (10-10 m )肉眼分辨率肉眼分辨率: 0.2mm光学显微镜光学显微镜: 0.2m电子显微镜电子显微镜: 0.2nm显微镜技术显微镜技术一一 光学显微镜技术光学显微镜技术二二 电子显微镜技术电子显微镜技术SEM（s

2、canning electron microscope）TEM（transmition electron microscope）三三 扫描隧道显微镜扫描隧道显微镜第一节第一节 细胞的形态观察技术细胞的形态观察技术一、光学显微镜技术一、光学显微镜技术F以可见光（或紫外光）为光源以可见光（或紫外光）为光源F类型类型 普通复式光学显微镜普通复式光学显微镜 特殊光学显微镜特殊光学显微镜：相差和微分干涉显微镜、录像增差显微：相差和微分干涉显微镜、录像增差显微镜、暗视野显微镜、荧光显微镜、倒置显微镜等镜、暗视野显微镜、荧光显微镜、倒置显微镜等 多功能显微镜多功能显微镜 激光扫描共焦显微镜激光扫描共焦显微镜

3、第一节第一节 细胞的形态观察技术细胞的形态观察技术1、普通复式光学显微镜、普通复式光学显微镜F构成：构成：F性能参数：性能参数：分辨率分辨率放大率放大率F特点和局限性特点和局限性第一节第一节 细胞的形态观察技术细胞的形态观察技术（1）普通复式光学显微镜性能参数）普通复式光学显微镜性能参数F分辨率：区分开两点间的最小距离分辨率：区分开两点间的最小距离 R=0.61/nsin(/2) NA=nsin(/2) NA(numerical aperture) NA(numerical aperture)为物镜的数值孔径值为物镜的数值孔径值F影响分辨率的因素影响分辨率的因素入射光的波长入射光的波长镜口角镜

4、口角介质的折射率介质的折射率第一节第一节 细胞的形态观察技术细胞的形态观察技术（2）普通复式光学显微镜特点和局限性）普通复式光学显微镜特点和局限性F特点：特点：明视场显微镜是以标本的颜色及其透射率为基明视场显微镜是以标本的颜色及其透射率为基础的显微镜。础的显微镜。一般需要对处理过的样品（固定染色）进行观察一般需要对处理过的样品（固定染色）进行观察以可见光为光源（波长范围以可见光为光源（波长范围400nm-700nm400nm-700nm）F局限性局限性难以观察活的样品难以观察活的样品分辨能力有限分辨能力有限 第一节第一节 细胞的形态观察技术细胞的形态观察技术2、活细胞观察技术、活细胞观察技术F

5、相差显微镜相差显微镜F微分干涉显微镜微分干涉显微镜F录像增差显微镜录像增差显微镜F倒置显微镜倒置显微镜第一节第一节 细胞的形态观察技术细胞的形态观察技术（1）活细胞观察技术）活细胞观察技术相差显微镜相差显微镜F原理：把透过标本的可见光的光程差（相位差）变原理：把透过标本的可见光的光程差（相位差）变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。种结构变得清晰可见。F特殊构造：相差物镜、环形光阑、合轴调中望远镜、特殊构造：相差物镜、环形光阑、合轴调中望远镜、绿色滤光片绿色滤光片第一节第一节 细胞的形态观察技术细胞的形态观察技术相差显微镜

6、的应用相差显微镜的应用F特点：可以对无色透明的标本进行观察。适合于观察特点：可以对无色透明的标本进行观察。适合于观察未经染色的活细胞。未经染色的活细胞。第一节第一节 细胞的形态观察技术细胞的形态观察技术F特点：以平面偏振光为光源，能区分样品厚度的微小特点：以平面偏振光为光源，能区分样品厚度的微小差别，增加样品反差，有立体感。差别，增加样品反差，有立体感。F应用：观察未染色标本，更适于研究活细胞中较大的应用：观察未染色标本，更适于研究活细胞中较大的细胞器细胞器（3）录像增差显微镜）录像增差显微镜计算机辅助的微分干涉计算机辅助的微分干涉显微镜显微镜F降低背景噪声，提高分辨率，填补光镜与电镜之间的降

7、低背景噪声，提高分辨率，填补光镜与电镜之间的空白空白第一节第一节 细胞的形态观察技术细胞的形态观察技术（4）活细胞观察技术）活细胞观察技术倒置倒置显微镜显微镜F应用：通常具有相差物镜，应用：通常具有相差物镜，用来观察正在培养的活细胞用来观察正在培养的活细胞第一节第一节 细胞的形态观察技术细胞的形态观察技术3、特殊光学显微镜、特殊光学显微镜荧光显微镜荧光显微镜F光源：汞灯光源：汞灯短波长紫外光短波长紫外光F装置：激发滤光片、阻断滤光片、分色镜装置：激发滤光片、阻断滤光片、分色镜F荧光染料染色荧光染料染色F应用：在光镜水平对细胞中特异的蛋白质分子或核苷应用：在光镜水平对细胞中特异的蛋白质分子或核苷

8、酸片段等进行定位、定性分析。酸片段等进行定位、定性分析。 绿色荧光蛋白（绿色荧光蛋白（green fluorescent proteingreen fluorescent protein，GFP GFP ）第一节第一节 细胞的形态观察技术细胞的形态观察技术3、特殊光学显微镜、特殊光学显微镜荧光显微镜荧光显微镜第一节第一节 细胞的形态观察技术细胞的形态观察技术4、光学显微镜、光学显微镜激光扫描共焦显微镜激光扫描共焦显微镜F用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描，排除焦用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描，排除焦平面以外光的干扰，增强图像反差和提高分辨率平面以外光的干扰，增强图像反差和提高分辨率

9、F分辨力是普通光学显微镜的分辨力是普通光学显微镜的3 3倍。倍。F用途类似荧光显微镜，可自动改变观察的焦平面用途类似荧光显微镜，可自动改变观察的焦平面, ,通通过过“光学切片光学切片” ” 观察较厚样品的内部结构，并可通观察较厚样品的内部结构，并可通过三维重构过三维重构, ,形成立体图像。形成立体图像。F在研究亚细胞结构与组分方面应用广泛在研究亚细胞结构与组分方面应用广泛. .第一节第一节 细胞的形态观察技术细胞的形态观察技术4、光学显微镜、光学显微镜激光扫描共焦显微镜激光扫描共焦显微镜第一节第一节 细胞的形态观察技术细胞的形态观察技术光学显微镜光学显微镜激光扫描共焦显微镜激光扫描共焦显微镜第

10、一节第一节 细胞的形态观察技术细胞的形态观察技术Figure Comparison of conventional and confocal fluorescence microscopy. These two micrographs are of the same intact gastrula-stage Drosophila embryo that has been stained with a fluorescent probe for actin filaments. The conventional, unprocessed image (A) is blurred by the

11、presence of fluorescent structures above and below the plane of focus. In the confocal image (B), this out-of-focus information is removed, which results in a crisp optical section of the cell in the embryo. 1荧光共振能量转移技术荧光共振能量转移技术5、与荧光观察有关的技术、与荧光观察有关的技术第一节第一节 细胞的形态观察技术细胞的形态观察技术2荧光漂白恢复技术荧光漂白恢复技术检测活体中生

12、物大分检测活体中生物大分子纳米级距离和距离变子纳米级距离和距离变化的工具。化的工具。GFPGFP突变体：突变体： CFPCFP青绿色、青绿色、 YFPYFP黄色黄色检测活体细胞表面或内检测活体细胞表面或内部的分子运动以及在各部的分子运动以及在各种结构上分子动态变化种结构上分子动态变化率大小的技术。率大小的技术。6、特殊显微镜、特殊显微镜暗视野显微镜暗视野显微镜F原理：通过在明场显微镜上安装暗场聚光镜，使来自聚光原理：通过在明场显微镜上安装暗场聚光镜，使来自聚光镜的光线不直接入射到物镜内，而被标本散射的光则可以镜的光线不直接入射到物镜内，而被标本散射的光则可以进入物镜，从而达到在黑暗的背景下可看

13、到标本的外部形进入物镜，从而达到在黑暗的背景下可看到标本的外部形态。态。F特点特点视野是暗的，物象是亮的。视野是暗的，物象是亮的。可以观察在明视场中看不见的细菌等微小标本的存在。可以观察在明视场中看不见的细菌等微小标本的存在。只能看清标本轮廓，分不清内部结构只能看清标本轮廓，分不清内部结构第一节第一节 细胞的形态观察技术细胞的形态观察技术7、多功能显微镜、多功能显微镜第一节第一节 细胞的形态观察技术细胞的形态观察技术二、电子显微镜二、电子显微镜F以电子束作为光源以电子束作为光源F扫描电子显微镜利用二次反射电子成像，主要用来观扫描电子显微镜利用二次反射电子成像，主要用来观察样品表面的形态特征。察

14、样品表面的形态特征。F透射电子显微镜利用透过的电子成像，用来观察细胞透射电子显微镜利用透过的电子成像，用来观察细胞内部的详细结构。内部的详细结构。第一节第一节 细胞的形态观察技术细胞的形态观察技术Figure Limit of resolution of the electron microscope. Electron micrograph of a thin layer of gold showing the individual files of atoms in the crystal as bright spots. The distance between adjacent fil

15、es of gold atoms is about 0.2 nm (2 ).二、电子显微镜二、电子显微镜1、基本构造、基本构造F电子束照明系统：电子束照明系统：F成像系统：电磁透镜成像系统：电磁透镜F真空系统：真空系统：F记录系统：荧光屏或感光胶片记录系统：荧光屏或感光胶片第一节第一节 细胞的形态观察技术细胞的形态观察技术电子显微镜能不能电子显微镜能不能 取代光学显微镜呢？取代光学显微镜呢？二、电子显微镜二、电子显微镜2、电子显微镜的优缺点、电子显微镜的优缺点F优点：比光学显微镜分辨率高优点：比光学显微镜分辨率高F缺点：不能观察活的生物样品，而且不能缺点：不能观察活的生物样品，而且不能观察细胞

16、全貌。观察细胞全貌。第一节第一节 细胞的形态观察技术细胞的形态观察技术二、电子显微镜二、电子显微镜3、电子显微镜制样技术、电子显微镜制样技术F超薄切片技术超薄切片技术（厚度（厚度404050nm50nm）F电镜负染色技术电镜负染色技术F冷冻断裂和冷冻蚀刻技术冷冻断裂和冷冻蚀刻技术F电镜三维重构技术电镜三维重构技术第一节第一节 细胞的形态观察技术细胞的形态观察技术超薄切片技术：固定、包埋、切片、染色超薄切片技术：固定、包埋、切片、染色染色剂：重金属，成黑白图像染色剂：重金属，成黑白图像冷冻蚀刻电镜技术主要用于膜断裂面的蛋白冷冻蚀刻电镜技术主要用于膜断裂面的蛋白质颗粒和膜面结构，深度蚀刻主要用于观

17、察质颗粒和膜面结构，深度蚀刻主要用于观察胞质中的细胞骨架纤维及其结合蛋白胞质中的细胞骨架纤维及其结合蛋白电镜三维重构技术适于电镜三维重构技术适于分析难以形成三维晶体分析难以形成三维晶体的膜蛋白及病毒和蛋白的膜蛋白及病毒和蛋白质质- -核酸复合物等大的核酸复合物等大的复合体的三维结构复合体的三维结构F分辨率：横向为分辨率：横向为0.10.10.2nm0.2nm，纵向可达，纵向可达0.001nm0.001nm。F用途：是探测微观世界物质表面形态的仪器，三用途：是探测微观世界物质表面形态的仪器，三态（固态、液态和气态）物质均可进行观察。可态（固态、液态和气态）物质均可进行观察。可直接观察生物大分子生

18、物结构的原子排列，并且直接观察生物大分子生物结构的原子排列，并且可避免损伤样品。可避免损伤样品。F工作原理工作原理第一节第一节 细胞的形态观察技术细胞的形态观察技术第一节第一节 细胞的形态观察技术细胞的形态观察技术STM image, Benzene molecules accumulate at step edges on Cu25002500万倍硅万倍硅晶体表面晶体表面 DNA第一节第一节 细胞的形态观察技术细胞的形态观察技术F细胞组分的分离细胞组分的分离F细胞组分的分析细胞组分的分析F定量细胞化学技术定量细胞化学技术第二节第二节 细胞组分分析技术细胞组分分析技术F细胞组分的获得：用低渗匀

19、浆、超声破碎、研细胞组分的获得：用低渗匀浆、超声破碎、研磨等方法获得磨等方法获得细胞组分匀浆细胞组分匀浆。F细胞组分分离细胞组分分离离心技术离心技术：离心是研究如细胞：离心是研究如细胞核、线粒体、高尔基体、溶酶体和微体，以及核、线粒体、高尔基体、溶酶体和微体，以及各种大分子基本手段。各种大分子基本手段。F常用差速离心技术、密度梯度离心技术，或者常用差速离心技术、密度梯度离心技术，或者是二者结合是二者结合。第二节第二节 细胞组分分析技术细胞组分分析技术第二节第二节 细胞组分分析技术细胞组分分析技术F 低速离心机转速低速离心机转速8ooor/min，离心力离心力10kgF 高速离心机转速为高速离心

20、机转速为 1000025000r/min，离心力为，离心力为10-100（kg）F 转速超过转速超过25000r/min，离心力，离心力大于大于100K者称为超速离心机。者称为超速离心机。F 目前超速离心机的最高转速可目前超速离心机的最高转速可达达100000r/min，离心力超过，离心力超过500Kg。第二节第二节 细胞组分分析技术细胞组分分析技术F特点：介质密度均一；速度由低向高，逐级离心。特点：介质密度均一；速度由低向高，逐级离心。F用途：分离大小相差悬殊的细胞和细胞器用途：分离大小相差悬殊的细胞和细胞器。F沉降顺序：核沉降顺序：核线粒体线粒体溶酶体与过氧化物酶溶酶体与过氧化物酶体体内质

21、网与高基体内质网与高基体核蛋白体。核蛋白体。F通过差速离心可将细胞初步分离，常需进一步通过通过差速离心可将细胞初步分离，常需进一步通过密度梯离心再行分离纯化。密度梯离心再行分离纯化。第二节第二节 细胞组分分析技术细胞组分分析技术F密度梯度离心密度梯度离心：用一定的介质在离心管内形：用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过离心力场的液或匀浆置于介质的顶部，通过离心力场的作用使细胞分层、分离。作用使细胞分层、分离。F速度区带离心速度区带离心用于分离密度相近大小不一的用于分离密度相近大小不一的细胞组分细胞组分F等

22、密度梯度离心等密度梯度离心用于分离不同密度的细胞组用于分离不同密度的细胞组分分用途：分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。用途：分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。速度区带速度区带梯度介质最大密度小梯度介质最大密度小于样品颗粒最小密度于样品颗粒最小密度要控制好离心时间要控制好离心时间分离密度不等的颗粒分离密度不等的颗粒等密度梯度离心等密度梯度离心梯度介质最大密度大梯度介质最大密度大于样品颗粒最大密度，于样品颗粒最大密度，样品密度介于梯度密样品密度介于梯度密度最大与最小之间，度最大与最小之间，样品不能到达离心管样品不能到达离心管底部底部。 二、细胞组分分析二、细胞组分分析F细胞化学技术：细胞学

23、和化学的结合产生了细细胞化学技术：细胞学和化学的结合产生了细胞化学胞化学,主要是研究细胞结构的化学组成及化主要是研究细胞结构的化学组成及化学分子的定位、分布及其生理功能学分子的定位、分布及其生理功能, 包括定性包括定性和定量分析。和定量分析。F包括酶细胞化学技术、免疫细胞化学技术、放包括酶细胞化学技术、免疫细胞化学技术、放射自显影示踪细胞化学技术等。射自显影示踪细胞化学技术等。第二节第二节 细胞组分分析技术细胞组分分析技术F酶细胞化学技术：酶细胞化学技术：通过酶的特异细胞化学反应来显示酶通过酶的特异细胞化学反应来显示酶在细胞内的定位。在细胞内的定位。F免疫标记技术：免疫标记技术：特异性蛋白抗原

24、的定性、定位分析特异性蛋白抗原的定性、定位分析将免疫学方法与荧光标记技术、酶标记技术、金标技术将免疫学方法与荧光标记技术、酶标记技术、金标技术等相结合用来研究特异蛋白在细胞内分布的方法。（等相结合用来研究特异蛋白在细胞内分布的方法。（选选择择1111）F原位杂交技术（原位杂交技术（In situ hybridization）：特异核酸序列特异核酸序列的定位、定性分析。（的定位、定性分析。（选择题选择题12-1612-16）F放射标记技术：放射标记技术：研究生物大分子在细胞内的合成动态研究生物大分子在细胞内的合成动态（选择题选择题1717）第二节第二节 细胞组分分析技术细胞组分分析技术F原位杂交

25、技术将待测核酸在组织、细胞或染色体上原位杂交技术将待测核酸在组织、细胞或染色体上的位置显示出来。的位置显示出来。FSouthernSouthern印迹杂交印迹杂交是进行基因组是进行基因组DNADNA特定序列定位特定序列定位的通用方法。的通用方法。FNorthernNorthern杂交杂交用来检测样品中是否含有基因的转录用来检测样品中是否含有基因的转录产物（产物（mRNAmRNA）及其含量。）及其含量。FWestern BlotWestern Blot中文一般称为蛋白质印迹。检测中文一般称为蛋白质印迹。检测蛋白蛋白质质在所分析的细胞或组织中的表达情况。在所分析的细胞或组织中的表达情况。In si

26、tu hybridization for RNA localization in tissues. Electron-microscopic autoradiography第二节第二节 细胞组分分析技术细胞组分分析技术三、定量细胞化学技术三、定量细胞化学技术F显微分光光度技术显微分光光度技术F流式细胞仪流式细胞仪用途：对单个细胞进行快速定量分析与用途：对单个细胞进行快速定量分析与分选的一门技术。分选的一门技术。计数、分类、测定等计数、分类、测定等第二节第二节 细胞组分分析技术细胞组分分析技术细胞工程细胞工程应用细胞生物学和分子生物学等学科的理论和技术，应用细胞生物学和分子生物学等学科的理论和技

27、术，按照人们的需要，有计划地大规模地培养生物组织和细按照人们的需要，有计划地大规模地培养生物组织和细胞，以获得生物及其产品，或改变细胞的遗传组成以获胞，以获得生物及其产品，或改变细胞的遗传组成以获得新的种或品种，为社会和人类提供需要。得新的种或品种，为社会和人类提供需要。第三节第三节 细胞工程与细胞培养细胞工程与细胞培养细胞培养细胞培养F概念：在体外模拟体内的生理环境，使从机体取出概念：在体外模拟体内的生理环境，使从机体取出的细胞在体外继续生长繁殖的技术的细胞在体外继续生长繁殖的技术F包括：细菌培养、动物细胞培养和植物细胞培养包括：细菌培养、动物细胞培养和植物细胞培养F在细胞培养中防止污染是决

28、定细胞培养成败的关键。在细胞培养中防止污染是决定细胞培养成败的关键。第三节第三节 细胞工程与细胞培养细胞工程与细胞培养动物细胞培养术语动物细胞培养术语F原代培养（原代培养（primary cultureprimary culture）：从动物机体取出）：从动物机体取出直接进行培养的细胞群叫原代细胞，对原代细胞的直接进行培养的细胞群叫原代细胞，对原代细胞的培养称为原代培养。培养称为原代培养。F传代培养：适应在体外培养条件下持续传代培养的传代培养：适应在体外培养条件下持续传代培养的细胞称为传代细胞。细胞称为传代细胞。 将细胞从一个培养瓶以一定将细胞从一个培养瓶以一定的比例转移到另外的培养瓶继续培养

29、的过程，即称的比例转移到另外的培养瓶继续培养的过程，即称为传代或传代培养。为传代或传代培养。第三节第三节 细胞工程与细胞培养细胞工程与细胞培养第三节第三节 细胞工程与细胞培养细胞工程与细胞培养第三节第三节 细胞工程与细胞培养细胞工程与细胞培养动物细胞的培养形式动物细胞的培养形式F单层细胞培养：也称群体培养，将含有一定数量细胞单层细胞培养：也称群体培养，将含有一定数量细胞的悬液置于培养瓶中，让细胞贴壁生长，汇合后形成的悬液置于培养瓶中，让细胞贴壁生长，汇合后形成均匀的单细胞层均匀的单细胞层F克隆培养：将高度稀释的游离细胞悬液加入培养瓶中；克隆培养：将高度稀释的游离细胞悬液加入培养瓶中；各个细胞贴

30、壁后，彼此距离较远，经过生长增殖每一各个细胞贴壁后，彼此距离较远，经过生长增殖每一个细胞形成一个细胞集落，称为克隆。一个细胞克隆个细胞形成一个细胞集落，称为克隆。一个细胞克隆中的所有细胞均来源于同一个祖先细胞。中的所有细胞均来源于同一个祖先细胞。F悬浮培养：使用特定的装置，使细胞处于悬浮状态进悬浮培养：使用特定的装置，使细胞处于悬浮状态进行增殖的培养方法。行增殖的培养方法。第三节第三节 细胞工程与细胞培养细胞工程与细胞培养单层细胞培养和克隆培养单层细胞培养和克隆培养第三节第三节 细胞工程与细胞培养细胞工程与细胞培养细胞培养有关的概念细胞培养有关的概念F细胞系（细胞系（cell line）：）：

31、原代培养细胞经过传代形成的原代培养细胞经过传代形成的生物学特性不均一的细胞群体。生物学特性不均一的细胞群体。F有限细胞系（有限细胞系（finite cell line）：）：指传代次数有限的体指传代次数有限的体外培养细胞。有限细胞系仍然保持细胞原来染色体外培养细胞。有限细胞系仍然保持细胞原来染色体的二倍体数量和接触抑制行为。的二倍体数量和接触抑制行为。F连续细胞系或永生细胞系（连续细胞系或永生细胞系（infinite cell line）：）：培养培养过程中发生突变或转化的细胞或从肿瘤组织培养建过程中发生突变或转化的细胞或从肿瘤组织培养建立的细胞群，在培养条件下可无限繁殖。染色体明立的细胞群，

32、在培养条件下可无限繁殖。染色体明显改变，失去接触抑制，容易传代培养。显改变，失去接触抑制，容易传代培养。第三节第三节 细胞工程与细胞培养细胞工程与细胞培养F细胞克隆：细胞克隆：从一个经过鉴定的细胞系由单细胞分从一个经过鉴定的细胞系由单细胞分离培养或通过筛选的方法由单细胞增殖形成的细离培养或通过筛选的方法由单细胞增殖形成的细胞群胞群. .具有基本相同的遗传性状。具有基本相同的遗传性状。F细胞株细胞株: :是通过选择法或克隆形成法从原代培养物是通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质或标志的培养细或细胞系中获得的具有特殊性质或标志的培养细胞胞. .第三节第三节 细胞工程与细胞

33、培养细胞工程与细胞培养F体外培养的细胞具有体外培养的细胞具有特性和特性和现象。现象。F接触抑制接触抑制: :细胞培养过程中细胞培养过程中, ,形成良好单层后形成良好单层后, ,细胞彼此接触细胞彼此接触, ,移移动运动停止的现象动运动停止的现象. .F贴壁生长细胞的基本形态：成纤维样细胞、上皮样细胞。贴壁生长细胞的基本形态：成纤维样细胞、上皮样细胞。第三节第三节 细胞工程与细胞培养细胞工程与细胞培养植物细胞培养植物细胞培养F植物组织培养植物组织培养F原生质体培养原生质体培养F单倍体培养单倍体培养第三节第三节 细胞工程与细胞培养细胞工程与细胞培养非细胞体系（非细胞体系（P72）F定义：来源于细胞，

34、不具备完整的细胞结构，但包含定义：来源于细胞，不具备完整的细胞结构，但包含了进行正常生物学反应所需的物质（如供能系统和酶了进行正常生物学反应所需的物质（如供能系统和酶反应体系等）组成的体系即为非细胞体系。反应体系等）组成的体系即为非细胞体系。F应用：近年来，非细胞体系在研究应用：近年来，非细胞体系在研究DNA复制、复制、RNA转录、蛋白质合成、高尔基体的膜泡运输机制及细胞转录、蛋白质合成、高尔基体的膜泡运输机制及细胞核装配（染色质、核膜、核骨架装配）等方面显示了核装配（染色质、核膜、核骨架装配）等方面显示了重要作用。重要作用。第三节第三节 细胞工程与细胞培养细胞工程与细胞培养细胞融合与细胞杂交

35、技术细胞融合与细胞杂交技术F细胞融合细胞融合：自发或人工诱导下，：自发或人工诱导下，两个不同基因型的细胞或原生两个不同基因型的细胞或原生质体融合形成一个杂交细胞。质体融合形成一个杂交细胞。F诱导细胞融合的方法诱导细胞融合的方法生物方法：灭活的仙台病毒、副生物方法：灭活的仙台病毒、副流感病毒和新城鸡瘟病毒流感病毒和新城鸡瘟病毒化学方法：聚乙二醇化学方法：聚乙二醇PEGPEG物理方法：电击和激光物理方法：电击和激光第三节第三节 细胞工程与细胞培养细胞工程与细胞培养第三节第三节 细胞工程与细胞培养细胞工程与细胞培养F免疫技术免疫技术F细胞融合细胞融合F细胞培养：选择性细细胞培养：选择性细胞培养、克隆

36、培养胞培养、克隆培养F细胞拆合：细胞拆合：物理方法：机械方法或超声处理去核物理方法：机械方法或超声处理去核化学方法：松胞素处理使细胞排核，再离心得化学方法：松胞素处理使细胞排核，再离心得到胞质体和核质体。到胞质体和核质体。第三节第三节 细胞工程与细胞培养细胞工程与细胞培养一、名词解释一、名词解释1、原代培养、原代培养 2、传代培养、传代培养 3、克隆培养、克隆培养 4、群体培养、群体培养5、接触抑制、接触抑制 6、细胞株、细胞株 7、细胞系、细胞系 8、非细胞体系、非细胞体系二、填空二、填空1、光学显微镜的分辨率由、光学显微镜的分辨率由 、 和和 三种因素决定，用紫外光为三种因素决定，用紫外光

37、为光源观察物体比用可见光的分辨率要高，这是因为光源观察物体比用可见光的分辨率要高，这是因为 。2、适于观察活细胞的光镜有、适于观察活细胞的光镜有 、 、 、 等。等。 3、电子显微镜使用的是、电子显微镜使用的是 透镜，而光学显微镜使用的是透镜，而光学显微镜使用的是 透镜。透镜。 4、荧光显微镜是以、荧光显微镜是以 为光源，而电子显微镜则以为光源，而电子显微镜则以 作为光源。作为光源。 5、可用、可用 技术来研究质膜结构的不对称性。技术来研究质膜结构的不对称性。6、细胞生物学研究中常用的光镜有、细胞生物学研究中常用的光镜有 、 、 、 。7、贴壁生长细胞的形态为、贴壁生长细胞的形态为 、 。8、

38、超速离心的方法包括超速离心的方法包括 和和 两种，其中前者适合对组分进行两种，其中前者适合对组分进行粗分离，而后者则为较为精细的分离手段。粗分离，而后者则为较为精细的分离手段。三、选择题三、选择题1、在光学显微镜下所观察到的组织或细胞结构一般称为、在光学显微镜下所观察到的组织或细胞结构一般称为A显微结构显微结构 B超微结构超微结构 C亚显微结构亚显微结构 D分子结构分子结构 2研究细胞的超微结构一般要利用下列哪种技术研究细胞的超微结构一般要利用下列哪种技术A光学显微镜技术光学显微镜技术 B电子显微镜技术电子显微镜技术 CX射线衍射技术射线衍射技术 D离心技术离心技术 E荧光显微镜荧光显微镜3、

39、适于观察细胞表面及断面超微结构三维图像的仪器是、适于观察细胞表面及断面超微结构三维图像的仪器是 A普通光学显微镜普通光学显微镜 B荧光显微镜荧光显微镜 C相差显微镜相差显微镜 D扫描电镜扫描电镜 E透射电镜透射电镜4、适于观察细胞内超微结构的显微镜是、适于观察细胞内超微结构的显微镜是A透射电镜透射电镜 B扫描电镜扫描电镜 C荧光显微镜荧光显微镜 D倒置显微镜倒置显微镜 E相差显微镜相差显微镜5、适于观察培养瓶中活细胞的显微镜是、适于观察培养瓶中活细胞的显微镜是A透射电镜透射电镜 B扫描电镜扫描电镜 C荧光显微镜荧光显微镜 D倒置显微镜倒置显微镜 E相差显微镜相差显微镜6、不能用于研究膜蛋白流动

40、性的方法是、不能用于研究膜蛋白流动性的方法是( )技术。技术。 A荧光抗体免疫标记荧光抗体免疫标记 B荧光能量共振转移荧光能量共振转移 C光脱色恢复光脱色恢复 D荧光标记细胞融合荧光标记细胞融合7 7、用于观察活细胞的显微镜是、用于观察活细胞的显微镜是( )( )。 A A倒置显微镜倒置显微镜 B B相差显微镜相差显微镜 C C微分干涉显微镜微分干涉显微镜 D D三者都是三者都是8 8、激光共焦点扫描显微镜可用于、激光共焦点扫描显微镜可用于( )( )。 A A获得细胞不同切面的图像获得细胞不同切面的图像 B B观察无色透明的标本观察无色透明的标本 C C定量分析细胞中的化学成分定量分析细胞中

41、的化学成分 D D观察细胞表面的立体形貌观察细胞表面的立体形貌9 9、用电子显微镜在细胞中观察不到微粒体，其原因是、用电子显微镜在细胞中观察不到微粒体，其原因是( )( )。 A A微粒体太小，无法用电子显微镜观察微粒体太小，无法用电子显微镜观察 B B它们是匀浆和离心后的它们是匀浆和离心后的人造产物人造产物 C C电子能够完全穿透它们电子能够完全穿透它们 D D只有通过显微摄影才能看到只有通过显微摄影才能看到1010、分离细胞内不同细胞器的主要技术是、分离细胞内不同细胞器的主要技术是( )( )。 A A超速离心技术超速离心技术 B B电泳技术电泳技术 C C层析技术层析技术 D D光镜技术

42、光镜技术1111、研究表皮生长因子受体在细胞分布的部位可用研究表皮生长因子受体在细胞分布的部位可用( )( )。 A A原位杂交技术原位杂交技术 B B显微操作技术显微操作技术 C C免疫电镜技术免疫电镜技术 D D细胞融合技术细胞融合技术1212、要探知细胞内某一蛋白质的表达水平，可以通过、要探知细胞内某一蛋白质的表达水平，可以通过( )( )实现。实现。 A ASouthern blot BSouthern blot BNorthern blotNorthern blot C CWestern blot DWestern blot Din situ hybridizationin situ

43、 hybridization1313、细胞内特异、细胞内特异DNADNA或或RNARNA序列的定性与定位通常采用的技术是序列的定性与定位通常采用的技术是( )( )。 A A杂交瘤技术杂交瘤技术 B B显微放射自显影显微放射自显影 C C原位杂交原位杂交 D D胶体金技胶体金技术术14、已克隆了人的已克隆了人的rDNArDNA，用，用( )( )确定确定rDNArDNA分布在人的哪几条染色体上。分布在人的哪几条染色体上。 A A单克隆抗体技术单克隆抗体技术 B B免疫荧光技术免疫荧光技术 C C免疫电镜技术免疫电镜技术 D D原位杂交技术原位杂交技术1515、已克隆了鸡卵清蛋白的基因，用、已克

44、隆了鸡卵清蛋白的基因，用( )( )技术证明在雏鸡的输卵管中技术证明在雏鸡的输卵管中该基因不转录而在母鸡输卵管中则活跃地转录。该基因不转录而在母鸡输卵管中则活跃地转录。 A ASouthern blot BSouthern blot BWesternblot Westernblot C CNorthern blot DNorthern blot D免疫荧光技术免疫荧光技术1616、下面、下面( )( )实验方法不能告诉你基因的表达与否。实验方法不能告诉你基因的表达与否。 A ASouthern blot BSouthern blot BNorthern Blot Northern Blot C

45、 CWestern blot DWestern blot D免疫荧光法免疫荧光法 1717、某种抗癌药物的作用机制是阻止肿瘤细胞的某种抗癌药物的作用机制是阻止肿瘤细胞的DNADNA复制还是阻止蛋白质复制还是阻止蛋白质合成，用合成，用( )( )证明。证明。 A A电镜负染色技术电镜负染色技术 B B放射自显影技术放射自显影技术 C C免疫荧光技术免疫荧光技术 D D免疫电镜技术免疫电镜技术1818、流式细胞术可用于测定流式细胞术可用于测定( )( )。 A A细胞的大小和特定细胞类群的数量细胞的大小和特定细胞类群的数量 B B分选出特定的细胞类群分选出特定的细胞类群 C C细胞中细胞中DNADNA，RNARNA或某种蛋白的含量或某种蛋白的含量 D D以上三种功能都有以上三种功能都有四、判断题四、判断题1、贴壁生长的细胞呈单层生长，且有接触抑制现象、贴壁生长的细胞呈单层生长，且有接触抑制现象.2、光学显微镜和电子显微镜的差别在于后者的放大倍数远远大于前者，所以能看到更小的细胞结、光学显微镜和电子显微镜的差别在于后者的放大倍数远远大于前者，所以能看到更小的细胞结构。构。 3、