理化生讲基因工程操作程序

1、目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定基因工程的基本操作程序的步骤：基因工程的基本操作程序的步骤：目的基因的获取目的基因的获取基因表达载体的构建基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞1 1、什么是目的基因？、什么是目的基因？2 2、获取目的基因的方法有哪些？其操、获取目的基因的方法有哪些？其操作过程分别是怎样的？作过程分别是怎样的？一、目的基因的获取一、目的基因的获取从从基因文库基因文库中获取目的基因中获取目的基因基因文库：基因文库： 将含有某种生物不同基因的许多将含有某种生物不同基因的许多DNADNA片断，导入到片断，导入到中，中，各个受体菌分别含有这种生物的不各个

2、受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。同基因，称为基因文库。基因文库基因文库 基因组文库基因组文库部分基因文库部分基因文库（如（如cDNAcDNA文库）文库）基因文库的构建过程基因文库的构建过程基基因因组组文文库库限制酶限制酶供体细胞的供体细胞的全部全部DNA大量大量DNA片段片段拼接到载体上拼接到载体上导入受体细胞扩增导入受体细胞扩增基因文库的构建过程基因文库的构建过程mRNAmRNA单链单链DNADNA 双链双链DNADNA逆转录逆转录cDNA文库文库依据目的基因的有关信息。依据目的基因的有关信息。如：根据基因的核苷酸序列如：根据基因的核苷酸序列 基因在染色体上的位置基因在染色体

3、上的位置 基因的转录产物基因的转录产物mRNAmRNA 基因翻译产物蛋白质等特性。基因翻译产物蛋白质等特性。从从基因文库基因文库中获取目的基因中获取目的基因PCRPCR的全称：的全称： 聚合酶链式反应聚合酶链式反应PCRPCR的原理：的原理： DNADNA复制复制 PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因的前提条件：的前提条件：要有一段已知的目的基因的核苷酸序列。要有一段已知的目的基因的核苷酸序列。模板模板原料原料引物引物酶酶控制温度控制温度目的基因目的基因DNADNA四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸如单链如单链DNADNA分子片段分子片段耐热的耐热的DNADNA聚合酶聚合酶PCRPCR仪自动

4、调控仪自动调控PCRPCR的条件：的条件：PCRPCR的过程：的过程：变性变性(90-95)(90-95)复性复性(55-60)(55-60)( (退火）退火）延伸延伸(70-75)(70-75)条件：条件：基因较小，核苷酸序列已知。基因较小，核苷酸序列已知。用切目的基因相用切目的基因相同的限制性内切同的限制性内切酶切割质粒酶切割质粒目的基因目的基因1 1、基因表达载体的组成、基因表达载体的组成目的基因目的基因启动子启动子:终止子终止子:标记基因、复制原点等标记基因、复制原点等一段有特殊结构的一段有特殊结构的DNADNA片段片段。位于基因的首端。位于基因的首端。一段有特殊结构的一段有特殊结构的

5、DNADNA片段片段。位于基因的尾端。位于基因的尾端。启动子的作用：启动子的作用：终止子作用：终止子作用：使转录在所需要的地方停止使转录在所需要的地方停止。标记基因作用：标记基因作用： 是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基 因，从而将有目的基因的细胞筛选出来，因，从而将有目的基因的细胞筛选出来，如青霉素基因。如青霉素基因。 是是RNARNA聚合酶识别和结合的部位聚合酶识别和结合的部位，有了它才，有了它才能驱动基因转录出能驱动基因转录出mRNAmRNA，最终获得蛋白质。，最终获得蛋白质。2 2、基因表达载体的构建目的：、基因表达载体的构建目的：a.a.使目的基因在

6、受体细胞中稳定存在，使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。并且可以遗传给下一代。b.b.使目的基因能够表达和发挥作用。使目的基因能够表达和发挥作用。三、目的基因导入受体细胞三、目的基因导入受体细胞 1 1、什么是转化？、什么是转化？ 2 2、目的基因导入植物细胞常用的方、目的基因导入植物细胞常用的方法是什么？具体过程是怎样的？法是什么？具体过程是怎样的？ 3 3、目的基因导入动物细胞常用的方、目的基因导入动物细胞常用的方法是什么？基本操作程序是怎样的？法是什么？基本操作程序是怎样的？ 4 4、目的基因导入大肠杆菌的方法是、目的基因导入大肠杆菌的方法是怎样的？钙离子有什么作用？怎

7、样的？钙离子有什么作用？转化转化目的基因进入受体细胞内，并且在受目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内体细胞内维持稳定和表达维持稳定和表达的过程。的过程。三、目的基因导入受体细胞三、目的基因导入受体细胞1.1.目的基因导入植物细胞目的基因导入植物细胞常用的方法常用的方法: : 农杆菌转化法、农杆菌转化法、基因枪法、花粉基因枪法、花粉 管通道法管通道法农杆菌的特点农杆菌的特点: :a.a.易感染双子叶植物和祼子植物。易感染双子叶植物和祼子植物。b.b.具有趋化性。具有趋化性。c.Tic.Ti质粒上的质粒上的T-DNAT-DNA可转移到受体细胞，可转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的并整合到

8、受体细胞染色体的DNADNA上上三、目的基因导入受体细胞三、目的基因导入受体细胞三、目的基因导入受体细胞三、目的基因导入受体细胞1.1.目的基因导入植物细胞目的基因导入植物细胞农杆菌转化法的导入过程农杆菌转化法的导入过程: :构建基因表达载体构建基因表达载体转入转入农杆菌农杆菌植物细胞植物细胞导入导入稳定维持和表达稳定维持和表达. .目的基因导入动物细胞目的基因导入动物细胞常用的方法常用的方法: : 显微注射技术显微注射技术操作程序：操作程序：三、目的基因导入受体细胞三、目的基因导入受体细胞a.a.先提纯含目的基因的表达载体先提纯含目的基因的表达载体 b.b.从动物体内取出卵从动物体内取出卵(

9、 (受精卵）受精卵）c.c.显微注射仪进行显微注射显微注射仪进行显微注射 d.d.将含目的基因的受精卵移植到输卵将含目的基因的受精卵移植到输卵管或子宫中发育成新个体管或子宫中发育成新个体3.3.目的基因导入微生物细胞目的基因导入微生物细胞原核生物的特点原核生物的特点: :繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少。少。大肠杆菌的转化过程大肠杆菌的转化过程: :用用CaCa2+2+处理细胞处理细胞 增加细胞壁的透性，增加细胞壁的透性，与细胞膜无关与细胞膜无关三、目的基因导入受体细胞三、目的基因导入受体细胞 感受态细胞感受态细胞重组表达载体重组表达载体DNADNA分子与

10、感受态细胞混合分子与感受态细胞混合感受态细胞吸收感受态细胞吸收DNADNA分子分子四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定1 1、导入目的基因后需要检测哪些方面？、导入目的基因后需要检测哪些方面？各采取什么方法？各采取什么方法？2 2、什么是、什么是DNADNA分子探针？检测时的分子探针？检测时的DNADNA探针通过什么原理来检测目的基因和探针通过什么原理来检测目的基因和相应的相应的mRNAmRNA？3 3、利用抗体抗原杂交检测的原理是、利用抗体抗原杂交检测的原理是什么？什么？1.1.目的基因是否插入受体细胞染色体的目的基因是否插入受体细胞染色体的DNADNA上上目的基因的检测内容和方

11、法目的基因的检测内容和方法检测方法检测方法: :DNADNA分子杂交技术分子杂交技术DNADNA探针：探针：用放射性同位素等作标记的含有用放射性同位素等作标记的含有目的基因的目的基因的DNADNA片段。片段。四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定DNA分子杂交技术 基因探针：核酸分子探针是指特定的已知核酸片段，能与互补核酸序列退火杂交，用于对待测核酸样品中特定基因顺序的探测。 满足：（1）必须是单链，（2）带有容易被检测出来的标记物。2.2.目的基因是否转录出目的基因是否转录出mRNAmRNA目的基因的检测内容和方法目的基因的检测内容和方法检测方法检测方法: :分子杂交技术分子杂交技

12、术用用DNADNA探针与探针与mRNAmRNA杂交。杂交。四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定目的基因的检测内容和方法目的基因的检测内容和方法检测方法检测方法: :抗原抗原抗体杂交抗体杂交3.3.目的基因是否翻译出蛋白质目的基因是否翻译出蛋白质 四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定4 4、个体生物学水平的鉴定、个体生物学水平的鉴定如抗虫、抗病的接种实验如抗虫、抗病的接种实验四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定4 4、珠蛋白是动物血红蛋白的重要组珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分，当它的成分异常时，动物可能成成分，当它的成分异常时，动物可能患某种疾病，如镰刀型

13、细胞贫血症，假患某种疾病，如镰刀型细胞贫血症，假如让你用基因工程的方法使大肠杆菌生如让你用基因工程的方法使大肠杆菌生产出鼠的产出鼠的珠蛋白，想一想，应该如珠蛋白，想一想，应该如何设计？何设计？ 思考与探究思考与探究思考与探究思考与探究1.1.从小鼠中克隆出从小鼠中克隆出珠蛋白基因的编码序列珠蛋白基因的编码序列（CDNACDNA）。）。2.2.将将cDNAcDNA前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子，前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子，另外加上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。另外加上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。3.3.将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然将表达载体导入无四环素抗性

14、的大肠杆菌中，然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未进入大肠杆菌中，大肠杆菌会因不含有抗达载体未进入大肠杆菌中，大肠杆菌会因不含有抗四环素基因而死掉；如果培养基上长出了大肠杆菌四环素基因而死掉；如果培养基上长出了大肠杆菌菌落，则表明菌落，则表明珠蛋白基因已进入。珠蛋白基因已进入。4.4.培养进入了培养进入了珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破碎后从中提取体，破碎后从中提取珠蛋白。珠蛋白。从从基因文库基因文库中获取目的基因中获取目的基因基因文库：基因文库： 将含有某种生物不同基因的许多将含有某种生物不同基因的许

15、多DNADNA片断，导入到片断，导入到中，中，各个受体菌分别含有这种生物的不各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。同基因，称为基因文库。基因文库基因文库 基因组文库基因组文库部分基因文库部分基因文库（如（如cDNAcDNA文库）文库）模板模板原料原料引物引物酶酶控制温度控制温度目的基因目的基因DNADNA四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸如单链如单链DNADNA分子片段分子片段耐热的耐热的DNADNA聚合酶聚合酶PCRPCR仪自动调控仪自动调控PCRPCR的条件：的条件：目的基因目的基因1.1.目的基因导入植物细胞目的基因导入植物细胞常用的方法常用的方法: : 农杆菌转化法、农杆菌转化法、基因枪法、花粉基因枪法、花粉 管通道法管通道法农杆菌的特点农杆菌的特点: :a.a.易感染双子叶植物和祼子植物。易感染双子叶植物和祼子植物。b.b.具有趋化性。具有趋化性。c.Tic.Ti质粒上的质粒上的T-DNAT-DNA可转移