蛋白质的化学2008

1、 of Protein内容简介 蛋白质的分类及生理学功能 氨基酸的结构和性质 肽的结构和生理功能 蛋白质的多级结构和性质 蛋白质的研究技术第一节 蛋白质的分类及生理学功能 蛋白质(protein) 是由许多氨基酸(amino acids)通过肽键(peptide bond)相连形成的高分子含氮化合物一 蛋白质的化学组成蛋白质的元素组成蛋白质的元素组成元素元素CHONS其它其它PFeI2含量含量53723161酪蛋酪蛋白白血红血红蛋白蛋白甲状腺甲状腺球蛋白球蛋白蛋白质含量（克）蛋白质含量（克）= =每克生物样品中含氮的克数每克生物样品中含氮的克数 6.256.25二 蛋白质的分类1 1、根据分子

2、形状、根据分子形状l 球状蛋白质：球状蛋白质：血红蛋白、血清球蛋白、血红蛋白、血清球蛋白、豆类的球蛋白等；豆类的球蛋白等；纤维状蛋白质：纤维状蛋白质：角蛋白、丝蛋白等角蛋白、丝蛋白等2 2、根据蛋白质组成：、根据蛋白质组成：简单蛋白质：简单蛋白质：水解为水解为 -氨基酸氨基酸结合蛋白质：结合蛋白质：单纯蛋白质单纯蛋白质+ +辅基，如色蛋白、辅基，如色蛋白、糖蛋白、磷蛋白、核蛋白、脂蛋白等。糖蛋白、磷蛋白、核蛋白、脂蛋白等。3 3、根据蛋白质溶解度：、根据蛋白质溶解度：清蛋白、球蛋白、谷蛋白、醇溶蛋白、清蛋白、球蛋白、谷蛋白、醇溶蛋白、精蛋白、组蛋白、硬蛋白。精蛋白、组蛋白、硬蛋白。4 4、根据

3、蛋白质功能、根据蛋白质功能 活性蛋白质活性蛋白质 非活性蛋白质非活性蛋白质三 蛋白的生理功能1 酶 2结构成分（结缔组织的胶原蛋白、血管和皮肤的弹性蛋白、膜蛋白）3贮藏（卵清蛋白、种子蛋白）4物质运输（血红蛋白、Na+-K+-ATPase、葡萄糖运输载体、脂蛋白、电子传递体）5细胞运动（肌肉收缩的肌球蛋白、肌动蛋白）6激素功能（胰岛素）7抗体(免疫信号）8接受、传递信息（受体蛋白，味觉蛋白）9调节、控制细胞生长、分化、和遗传信息的表达（组蛋白、阻遏蛋白）第二节氨基酸的结构和性质氨基酸的结构氨基酸的分类氨基酸的物理性质氨基酸的化学性质不变部分不变部分可变部分可变部分手性手性 - -碳原子碳原子一

4、一 氨基酸的结构氨基酸的结构 - -氨基酸的结构通式氨基酸的结构通式COOHCHH2NR氨基酸的立体异构体（1 1）常见的天然氨基酸）常见的天然氨基酸（2 2）不常见的稀有氨基酸）不常见的稀有氨基酸是正常氨基酸的衍生物，在遗传上没有直接的三联密码。（3 3）非蛋白质氨基酸）非蛋白质氨基酸不在蛋白质分子中出现的氨基酸。二 氨基酸的分类苏氨酸苏氨酸半胱氨酸半胱氨酸甘氨酸甘氨酸丙氨酸丙氨酸缬氨酸缬氨酸丝氨酸丝氨酸脯氨酸脯氨酸亮氨酸亮氨酸异亮氨酸异亮氨酸甲硫氨酸甲硫氨酸（1 1）常见的天然氨基酸）常见的天然氨基酸苯丙氨酸苯丙氨酸酪氨酸酪氨酸色氨酸色氨酸组氨酸组氨酸 赖氨酸赖氨酸 精氨酸精氨酸天冬氨酸天

5、冬氨酸 谷氨酸谷氨酸 天冬酰胺天冬酰胺 谷氨酰胺谷氨酰胺Gly,Ala,Val,Leu,Ile,Phe, Trp , Pro,Met 带电荷带电荷Ser,Thr, Tyr, Cys ,Asn,Gln带正电带正电: His,Lys,Arg带负电荷带负电荷:Asp,GLu不带荷不带荷: :极性氨基酸极性氨基酸非极性氨基酸非极性氨基酸常见的天然氨基酸分类常见的天然氨基酸分类 也称修饰氨基酸，是在蛋白质合成后，由基本氨基酸 修饰而来。 (1) 4-羟脯氨酸 (2) 5-羟赖氨酸 这两种氨基酸主要存在于结缔组织的纤维状蛋白中。 (3) 6-N-甲基赖氨酸（存在于肌球蛋白中） (4) -羧基谷氨酸：存在于

6、凝血酶原及某些具有结合 Ca2+离子功能的蛋白质中。 (5) Tyr的衍生物： 3.5 -二碘酪氨酸、甲状腺素 （甲状腺蛋白中） (6) 锁链素由4个Lys组成（弹性蛋白中）。 (2)(2)非编码的蛋白质氨基酸非编码的蛋白质氨基酸不组成蛋白质，但有生理功能（1）L-型 氨基酸的衍生物 L-瓜氨酸、L-鸟氨酸是尿素循环的中间物（2）D-型氨基酸 D-Glu、D-Ala（肽聚糖中）、D-Phe（短杆菌肽S）（3）-、-、-氨基酸 -Ala（泛素的前体）、-氨基丁酸（神经递质）。 (3)(3)非蛋白质氨基酸非蛋白质氨基酸三 氨基酸的一般物理性质（1 1）无色晶体，熔点极高，一般在）无色晶体，熔点极高

7、，一般在200200以上以上（2 2）不同氨基酸有不同的味感）不同氨基酸有不同的味感（3 3）能溶于稀酸或稀碱，不溶于有机溶剂）能溶于稀酸或稀碱，不溶于有机溶剂( (酸性的酸性的COOHCOOH基和碱性的基和碱性的NH2NH2基，为两性电解质基，为两性电解质) )（4 4）极性）极性 （5 5）具有旋光性）具有旋光性如果如果RH，则具有，则具有不对称碳原子不对称碳原子，因而氨基酸大多是光活性物质因而氨基酸大多是光活性物质(Gly除外除外R为为H原子无手性碳原子原子无手性碳原子) 蛋白质碱水解时得到氨基酸是蛋白质碱水解时得到氨基酸是DLDL型氨基酸的等摩尔混合物，称为（外）消旋型氨基酸的等摩尔混

8、合物，称为（外）消旋物。苏氨酸、异亮氨酸、羟脯氨酸和羟赖氨酸除了物。苏氨酸、异亮氨酸、羟脯氨酸和羟赖氨酸除了-碳原子外，还有第二个碳原子外，还有第二个不对称碳原子，分别存在不对称碳原子，分别存在4 4种光学异构体。种光学异构体。苏氨酸苏氨酸(Thr)(Thr)有四种异构体有四种异构体别别首先，首先，a a氨基决氨基决定定DLDL型，型，2.2.在在FisherFisher式中，式中，氨基与氨基与碳的碳的羟基在异侧，羟基在异侧，按第一条确定按第一条确定DLDL，在同侧，在同侧，则在则在DLDL后加后加“别别”字字（alloallo斜体）斜体）半胱氨酸半胱氨酸和胱氨酸和胱氨酸 二硫键二硫键Disu

9、lfide bondDisulfide bond胱氨酸的光学胱氨酸的光学异构体有几种异构体有几种 胱氨酸情况特殊，其分子中存在两个不对称中心。两个不对称中心的构象可胱氨酸情况特殊，其分子中存在两个不对称中心。两个不对称中心的构象可以相同，产生以相同，产生DLDL两个异构体两个异构体；也可以不相同，此时一个不对称中心是另一个；也可以不相同，此时一个不对称中心是另一个不对称中心的镜像，这样，分子内部相互抵消而无旋光性，此时的胱氨酸异不对称中心的镜像，这样，分子内部相互抵消而无旋光性，此时的胱氨酸异构体称为内消旋胱氨酸（构体称为内消旋胱氨酸（meso-cystinemeso-cystine） 因此，

10、胱氨酸有因此，胱氨酸有3 3种光学异构体。种光学异构体。色氨酸、酪氨酸和苯丙色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸对紫外光有光吸氨酸对紫外光有光吸收 。 其 吸 收 峰 在收 。 其 吸 收 峰 在280nm280nm左右，以色氨左右，以色氨酸吸收最强。酸吸收最强。氨基酸的紫外吸收光谱氨基酸的紫外吸收光谱（6）紫外吸收性质）紫外吸收性质（1 1）与亚硝酸的反应）与亚硝酸的反应( (氧化还原性）氧化还原性）（2 2）成盐作用（）成盐作用（HCl，碱性），碱性）（3 3）与甲醛的反应（亲核性）与甲醛的反应（亲核性）（4 4）酰基化与烃基化反应（亲核性）酰基化与烃基化反应（亲核性）（5 5）脱氨反应（氨基酸的代谢

11、）脱氨反应（氨基酸的代谢, ,酶催化）酶催化）四 氨基酸的化学通性（一）由氨基参加的反应（1 1）与亚硝酸反应：氨基酸氨基同其它伯氨一样，室温下与亚硝酸作用）与亚硝酸反应：氨基酸氨基同其它伯氨一样，室温下与亚硝酸作用生成氮气生成氮气AA + AA + 亚硝酸亚硝酸 - -羟基酸羟基酸 + + 氮气氮气+ + 水水用途：范斯莱克氨基氮测定法，用于氨基酸用途：范斯莱克氨基氮测定法，用于氨基酸 定量和测蛋白质水解进行程定量和测蛋白质水解进行程度度( (氮气一半来自氨基酸，一半来自亚硝酸）氮气一半来自氨基酸，一半来自亚硝酸）生产上用来测定氨基酸含量和蛋白质水解程度。因为蛋白质总氮量（凯氏生产上用来测定

12、氨基酸含量和蛋白质水解程度。因为蛋白质总氮量（凯氏定氮）不变，亚硝酸法测定的氨基氮却在不断上升，用氮气量的一半除以定氮）不变，亚硝酸法测定的氨基氮却在不断上升，用氮气量的一半除以总氮量，可以表示蛋白质的水解程度。总氮量，可以表示蛋白质的水解程度。pK2 H+COO-CH2NH2COO-CH2NH3+COO-CH2NHCH2OHHCHOHCHOCOO-CH2NH(CH2OH)2用途用途：由于氨基被保护,不干扰羧酸滴定过程羧酸滴定过程, ,可以用来直接可以用来直接滴定羧酸可知道氨基酸浓度。滴定羧酸可知道氨基酸浓度。羟甲基氨基酸二羟甲基氨基酸（2 2）甲醛反应：）甲醛反应：AA + AA + 甲醛甲

13、醛 二羟甲基氨基酸二羟甲基氨基酸用途用途：NN(CH3)2SO2ClH2NCHCROHNCHCROSO2N(CH3)2+水解N(CH3)2SO2HNCHCROOH+氨基酸丹磺酰氯多肽N-端丹磺酰N-端氨基酸丹磺酰氨基酸AAAA与丹磺酰氯的反应与丹磺酰氯的反应（3）酰基化与烃基化反应（荧光）（荧光）w荧光性质，使检测灵敏度可以达到荧光性质，使检测灵敏度可以达到1 1 1010-9-9molmol。用途用途： O2NFNO2+ H2NCH CROHNCH CROO2NNO2H+H2OO2NNO2HNCH CROOH+氨基酸DNFBN-端氨基酸DNP衍生物DNP-氨基酸AAAA与二硝基氟苯（与二硝基

14、氟苯（DNFBDNFB）的反应）的反应（黄色）（黄色）NCSNHCHCOR2NCHCOR1HHNHS:CCHCOR1HNNHCHCOR2SNHCNHOCR1CHNH2CHCOR2NCOCHNHSCR1实际上也是一种实际上也是一种N-N-端分析法。此法能够不断重复端分析法。此法能够不断重复循环，将肽链循环，将肽链N-N-端氨基酸残基逐一进行标记和解离端氨基酸残基逐一进行标记和解离PTH-AA （苯异硫氰酸酯法苯异硫氰酸酯法）- -氨基酸顺序分析法氨基酸顺序分析法（1 1）成酯和成盐反应（）成酯和成盐反应（+ + 醇）醇）（2 2）成酰胺反应（）成酰胺反应（AsnAsn，GlnGln）（3 3）酰

15、氯化反应（酰氯化氨基酸）酰氯化反应（酰氯化氨基酸）（4 4）叠氮反应）叠氮反应）（5 5）脱羧反应（）脱羧反应（+ + 酶酶) )（二）由羧基参加的反应a.AA + NaOH 氨基酸钠盐(氨基酸的碱金属盐能溶于水,重金属盐不溶于水)b. HClAA + EtOH 氨基酸乙酯的盐酸盐 成盐成盐成酯成酯反应反应R2OH+RCHCOO-NH3+ H2ORCHCOOR2NH2.HCl用途用途：这是使氨基酸羧基活化的一个重要反应这是使氨基酸羧基活化的一个重要反应。PCl3, PCl5 or SOCl2RCHCOO-NHPGRCHCOClNHPG保护基简写（胺基酰化）保护基简写（胺基酰化）酰化胺基酰化胺基

16、用途用途：常作为多肽合成活性中间体，常作为多肽合成活性中间体，活化羧基。活化羧基。RCHCOOCH3NHPGRCHCOONHNH2NHPGCH3OHNH2NH2RCHCON3NHPGHNO3H2O,N2经过酰化、酯化经过酰化、酯化变成酰化氨基酸变成酰化氨基酸甲酯，再与联氨甲酯，再与联氨和亚硝酸作用，和亚硝酸作用，生成叠氮化合物。生成叠氮化合物。用途用途：酶催化的反应酶催化的反应。(三)由氨基和羧基共同参加的反应（1）与茚三酮的反应）与茚三酮的反应（2）氨基酸的两性解离）氨基酸的两性解离（3）形成肽键）形成肽键用途用途：常用于氨基酸的定性或定量分析。常用于氨基酸的定性或定量分析。( (pro p

17、ro 黄色黄色）CCCOOOCCCOOOHOHH2OH2O水合茚三酮水合茚三酮CO2NH2RCHO+CCCOOHOHH2NCHCOOHRCCCOOOHOH+2NH3CCCOOCCCOO-NH4+NH2O2+CCCOOOCCCOOHHO茚三酮茚三酮蓝紫色蓝紫色（2 2）两性解离及等电点）两性解离及等电点 OH- OH- RCHCOOH RCHCOO- RCHCOO- H+ H+ NH3+ NH3+ NH2 pH pI 甘氨酸的解离曲线甘氨酸的解离曲线起点：100% Gly+ 净电荷：+1第一拐点：50%Gly + ，50%Gly 平均净电荷：+0.5 pH=pK1+lgGly/Gly+(羧基解离

18、) (pK1 = 2.34)第二拐点：100%Gly 净电荷： 0 等电点pI第三拐点：50%Gly， 50%Gly- 平均净电荷：-0.5 pH=pK2+lgGly/Gly(氨基解离) (pK2=9.6)终点： 100% Gly- 净电荷：-1等电点偏酸在于羧基解离度大于氨基解离度pH=pK+lg(质子受体 / 质子供体)在适当的酸碱度时，氨基酸溶液中在适当的酸碱度时，氨基酸溶液中-NH3+和和-COO-解离度完全相同，此时正离子和负离子浓解离度完全相同，此时正离子和负离子浓度相同，度相同，净电荷为零净电荷为零；在电场中既不向阳极移动；在电场中既不向阳极移动也不向阴极移动，成为也不向阴极移动

19、，成为两性离子两性离子（或兼性离子），（或兼性离子），这时氨基酸所处这时氨基酸所处溶液中的溶液中的pH值值就是该氨基酸的就是该氨基酸的等电点（等电点（pI）。）。等电点（等电点（pI）时溶解度最小。）时溶解度最小。等离子点等离子点VS 等电点等电点（等电点受离子浓度干扰）（等电点受离子浓度干扰）等电点的概念等电点的概念等电点的推导等电点的推导Ala+=AlaH+K1移项：移项：Ala-=Ala K2H+根据等电点的定义根据等电点的定义:Ala+= Ala-AlaH+K1Ala K2H+=整理：K1 K2 Ala= Ala H+ H+K1 K2= H+2两端取对数：-lg H+2 =-lg K1

20、-lg K2-lg K1 = pk1 -lg K2= pk2 2 （-lg H+）= pk1+pk2 根据pH 的定义得：pH=lg 1/ H+ =-lg H+ 2 pH=pk1+pk2pI=1/2( pk1+pk2 )中性氨基酸：中性氨基酸：pI = (pKpI = (pK1 1 + pK + pK2 2 )/2 )/2 酸性氨基酸：酸性氨基酸：pI = (pKpI = (pK1 1 + pK + pKR-COOR-COO- - )/2 )/2 碱性氨基酸：碱性氨基酸：pI = (pKpI = (pK2 2 + pK + pKR-NHR-NH2 2 )/2 )/2 pK pK1 1指指-羧基

21、离解常数的负对数值；羧基离解常数的负对数值； pKpK2 2指指-氨基离解常数的负对数值；氨基离解常数的负对数值； pKpKR R指侧链指侧链R R基离解常数的负对数值。基离解常数的负对数值。氨基酸等电点计算 对谷氨酸：A+ Ao A- A2-2.194.259.67pI（2.19+4.25）/23.22对赖氨酸：A2+ A+ Ao A-2.188.9510.53pI（8.95+10.53）/29.74（3 3）形成肽键（）形成肽键（peptide bondpeptide bond）氨基酸残基与肽单位 （1 1）SHSH基和基和S SS S键键 （2 2）OHOH基基 （3 3）咪唑基）咪唑基

22、(四四)由支链由支链R基产生的反应基产生的反应第三节第三节 肽的结构和生理功能肽的结构和生理功能谷胱甘肽的生理功用谷胱甘肽的生理功用 解毒作用：与毒物或药物结合，消除其毒性作用； 参与氧化还原反应：作为重要的还原剂，参与体内多种氧化还原反应； 保护巯基酶的活性：使巯基酶的活性基团-SH维持还原状态； 维持红细胞膜结构的稳定：消除氧化剂对红细胞膜结构的破坏作用。 肽概述(1)形成：脱水缩合(2)命名：NCA 肽也是以两性离子形式存在，一般为链式结构。羧基端为肽也是以两性离子形式存在，一般为链式结构。羧基端为C-端，氨基端为端，氨基端为N-端。书写时，端。书写时，N-端在左，端在左，C-端在右。端

23、在右。N-端端C-端端肽键肽键B 肽的结构不仅取决于氨基酸的种类和数目，而且还取决于肽的结构不仅取决于氨基酸的种类和数目，而且还取决于它们之间的连接次序。如它们之间的连接次序。如H3N+CH2C NHCHCO2-CH3OH3N+CHC NHCH2CO2-OCH3甘氨酰丙氨酸甘氨酰丙氨酸丙氨酰甘氨酸丙氨酰甘氨酸 这是少数几种氨基酸可以形成各式丰富多彩的蛋白质的基础。这是少数几种氨基酸可以形成各式丰富多彩的蛋白质的基础。 C 肽的命名以肽的命名以C-端的氨基酸为母体，称为某氨酸。其它氨基酸残端的氨基酸为母体，称为某氨酸。其它氨基酸残基则从基则从N-端开始，依次用某氨酰表示，放在母体前。如端开始，依

24、次用某氨酰表示，放在母体前。如-O2CCHCH2CH2CN+H3NOCHC NHOHCH2CO2-CH2SH谷氨酸残基谷氨酸残基半胱氨酸残基半胱氨酸残基甘氨酸甘氨酸残基残基g g-谷氨酰半胱氨酰谷氨酰半胱氨酰甘氨酸甘氨酸谷胱甘肽谷胱甘肽简称：简称：g g-Glu-Cys-Gly； g g-谷谷-胱胱-甘甘(3)分类：寡肽VS 多肽 （构成单元大于10称为多肽）(4)酸碱性：两端氨基酸残基酸的酸碱性,酸的偏向不酸；碱的偏向不碱（两端氨基酸残基官能团为正负离子，有吸引力作用，导致酸碱性增加，而肽链变长后这种引力降低）生物活性肽生物活性肽活性肽活性肽 在生物体中，多肽最重要的存在形式是作为蛋白质的亚

25、单位。 但是，也有许多分子量比较小的多肽以游离状态存在。这类多肽通常都具有特殊的生理功能，常称为活性肽。 如：脑啡肽；激素类多肽；抗生素类多肽；谷胱甘肽；蛇毒多肽等。肽的生理功能肽的生理功能- -活性肽与氨基酸生理差别活性肽与氨基酸生理差别 肽以完整的形式被机体吸收(肽通过十二指肠吸收后，直接进入血液循环，将自身能量营养输送到人体各个部位),吸收过程属于主动吸收（氨基酸属被动吸收）,较氨基酸吸收快速,同时吸收过程低耗或不需消耗能量, 吸收具有不饱和的特点 氨基酸只有20种，功能可数，而肽以氨基酸为底物，可合成上百上千种,可执行复杂生理功能 肽是信息的信使，以引起各种各样不同的实效的正性或异性生

26、理活动和生化反应调节（蛋白相比执行其它功能更多,但很多情况下活性肽活性较高） 分子量小，易于改造，易于化学合成，而高蛋白（大分子蛋白质）不具备这一特点肽的生理功能肽的生理功能- -活性肽与蛋白质生理差别活性肽与蛋白质生理差别 若氨基酸为二度深度开发，肽就是高蛋白的三度深度开发产品第四节 蛋白质的结构和性质蛋白质的多级结构蛋白质的结构与功能关系蛋白质的一些性质一一 蛋白质的多级结构蛋白质的多级结构一级结构一级结构-基本结构基本结构空间结构空间结构二级结构二级结构三级结构三级结构四级结构四级结构( (一）蛋白质一级结构一）蛋白质一级结构(Primary structure)(Primary str

27、ucture) 其中最重要的是多肽链的氨基酸顺序，其中最重要的是多肽链的氨基酸顺序，它是蛋白质生物功能的它是蛋白质生物功能的基础基础。胰岛素（胰岛素（InsulinInsulin）的一级结构）的一级结构（二）（二） 蛋白质二级结构蛋白质二级结构 蛋白质的二级结构：蛋白质的二级结构：指一级结构进一步盘绕折叠，其主链形成的局部构指一级结构进一步盘绕折叠，其主链形成的局部构象象。 二级结构的类型：二级结构的类型：主要有主要有 - -螺旋、螺旋、 - -折叠、折叠、 - -转角、转角、 无规卷曲无规卷曲。 维持二级结构的力：主要是维持二级结构的力：主要是氢键氢键。二级结构形成的基础二级结构形成的基础-

28、 -肽平面肽平面 肽平面形成是由于N元素以sp2杂化方式,使其结构中的孤对电子和氧共轭的结果 C元素电子云也以sp2方式杂化导致六个原子在同一平面上原子间作用是限制，形成高级构象的动力原子间作用是限制，形成高级构象的动力肽平面和二面角示意图肽平面和二面角示意图R R基分布在螺旋的基分布在螺旋的外侧外侧，并且影响着螺旋的形成。，并且影响着螺旋的形成。主链围绕中心轴呈有规律主链围绕中心轴呈有规律螺旋式上升螺旋式上升，形成右，形成右手螺旋；手螺旋；旋转一周为旋转一周为3.63.6个氨基酸残基；螺距为个氨基酸残基；螺距为0.54nm0.54nm；其结构靠第一个肽平面上的其结构靠第一个肽平面上的-NH-

29、NH基与第四个肽平基与第四个肽平面上的面上的-CO-CO基形成的基形成的氢键维持氢键维持，氢键的取向几乎与，氢键的取向几乎与轴平行轴平行；（1 1） -螺旋的特征螺旋的特征二级结构的类型二级结构的类型影响影响-螺旋稳定的因素螺旋稳定的因素 极大的侧链基团（存在空间位阻）；极大的侧链基团（存在空间位阻）； 连续存在的侧链带有相同电荷的氨基酸连续存在的侧链带有相同电荷的氨基酸残基（同种电荷的互斥效应残基（同种电荷的互斥效应) )； 有脯氨酸、羟脯氨酸的存在有脯氨酸、羟脯氨酸的存在（不能形成氢键）。（不能形成氢键）。（各种聚合氨基酸成螺旋小结）（各种聚合氨基酸成螺旋小结） Gly能形成（无R基团妨碍

30、氢键形成） Asp lys 不能形成（侧链带电荷排斥）在一定pH范围内 Pro 不能形成（不能形成氢键） Leu不容易形成(R基团较大，妨碍氢键形成）由由若干条肽段若干条肽段或肽链平或肽链平行或反平行排列组成行或反平行排列组成片状片状结构结构；主链骨架上下折叠主链骨架上下折叠呈锯呈锯齿状齿状（AAAA长长0.36nm)0.36nm)；借相邻借相邻主链之间的氢键主链之间的氢键维系。维系。R R基基交替分布交替分布在片层的在片层的上下方。上下方。二级结构的类型二级结构的类型-折迭包括平行式和反平行式两种类型折迭包括平行式和反平行式两种类型主链骨架本身以大约主链骨架本身以大约180180回折回折;

31、; 回折部分通常由四个氨基回折部分通常由四个氨基酸残基构成酸残基构成; ; 构象依靠第一残基的构象依靠第一残基的-CO-CO基基与第四残基的与第四残基的-NH-NH基之间形基之间形成氢键来维系。成氢键来维系。二级结构的类型二级结构的类型（4 4）无规卷曲）无规卷曲是指多肽链主链部分形成的无规律的是指多肽链主链部分形成的无规律的卷曲构象卷曲构象对于构造蛋白执行功能所需的柔性结对于构造蛋白执行功能所需的柔性结构来说具有重要意义构来说具有重要意义二级结构的类型二级结构的类型RNase的分子结构的分子结构-螺旋螺旋-折迭折迭-转角转角无规卷曲无规卷曲是指蛋白质分子在二级结构基础上进是指蛋白质分子在二级

32、结构基础上进一步一步盘曲折叠盘曲折叠而形成的整体构象，也而形成的整体构象，也就是一条多肽链全部原子在就是一条多肽链全部原子在三维空间三维空间的排布位置。的排布位置。溶菌酶分子的三级结构溶菌酶分子的三级结构(1) (1) 主要是非共价键（主要是非共价键（次级键次级键），如疏水键、），如疏水键、氢键、盐键、范氏引力等；氢键、盐键、范氏引力等；(2) (2) 但也有共价键，如二硫键等。但也有共价键，如二硫键等。疏水作用是维持蛋白质结构疏水作用是维持蛋白质结构最主要的稳定力最主要的稳定力。疏水基。疏水基团因疏水作用而聚向分子内部，亲水基团多分布在分团因疏水作用而聚向分子内部，亲水基团多分布在分子表面。

33、因此，具有三级结构的蛋白质都是亲水的。子表面。因此，具有三级结构的蛋白质都是亲水的。维系三级结构的力维系三级结构的力 键 能 肽键肽键 二硫键二硫键 离子键 氢键 疏水键 范德华力 90kcal/mol3kcal/mol1kcal/mol1kcal/mol0.1kcal/mol这四种键能远小于共价键，称这四种键能远小于共价键，称次级键次级键提问：次级键微弱但却是维持蛋白质三级结构中主提问：次级键微弱但却是维持蛋白质三级结构中主要的作用力要的作用力, ,原因何在原因何在? ?（四）蛋白质的四级结构（四）蛋白质的四级结构由两条或两条以上具有三级结构的多肽链由两条或两条以上具有三级结构的多肽链相互缔

34、结相互缔结在一起的聚合体。其中每条具有三级在一起的聚合体。其中每条具有三级结构的多肽链为一个结构的多肽链为一个亚基亚基。维系蛋白质四级结构的力是维系蛋白质四级结构的力是次级键次级键。偶数亚基，排列对称。偶数亚基，排列对称。 血红蛋白血红蛋白(hemoglobin)(hemoglobin)的四级结构的四级结构1 1、共价键：二硫键、肽键、酯键；、共价键：二硫键、肽键、酯键；2 2、非共价键：氢键、离子键、疏水键、和范德华力、非共价键：氢键、离子键、疏水键、和范德华力一级结构：一级结构：共价键共价键二级结构：二级结构：氢键氢键三、四级结构：三、四级结构：次级键次级键（五）维系蛋白质分子结构的键及作

35、用力（五）维系蛋白质分子结构的键及作用力随着结构层次上升随着结构层次上升, ,键的作用键的作用能力越弱能力越弱, ,符合物质构成一般符合物质构成一般规律规律稳定蛋白质构象的力稳定蛋白质构象的力盐键盐键氢键氢键疏疏水水键键范德华力范德华力二二硫硫键键酯键酯键二 蛋白结构和功能关系 蛋白质的一级结构决定其高级结构而影响功能蛋白质的一级结构决定其高级结构而影响功能 蛋白质的高级结构决定了其功能蛋白质的高级结构决定了其功能(1)(1)蛋白质的一级结构决定其高级结构而影响功蛋白质的一级结构决定其高级结构而影响功能能(1)(1)蛋白质的一级结构决定其高级结构而影响功能蛋白质的一级结构决定其高级结构而影响功

36、能镰状细胞贫血镰状细胞贫血（sick-cell anemia）从患者红细胞中鉴定出特异）从患者红细胞中鉴定出特异的镰刀型或月牙型细胞。的镰刀型或月牙型细胞。-链链 1 2 3 4 5 6 7Hb-A Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-LysHb-S Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Lys Val 取代取代Glu含氧含氧-HbAO2O2粘性疏水斑点粘性疏水斑点含氧含氧HbS脱氧脱氧HbS疏水位点疏水位点血红蛋白分子凝集血红蛋白分子凝集(2) 蛋白质的高级结构直接决定其功能蛋白质的高级结构直接决定其功能 高级结构变化，其许多结构性质就会改变（如变性失活） 高级结构及构

37、象微调，其活性也会发生很大变化血红蛋白血红蛋白血红蛋白构象的微调血红蛋白构象的微调- -构象改变构象改变- -生理功能改变生理功能改变血红素在蛋白中的位置血红素在蛋白中的位置血红素血红素氧结合引起蛋白局部构象变化氧结合引起蛋白局部构象变化局部构象变化引发关联蛋白构象变化局部构象变化引发关联蛋白构象变化氧气结合最终引起整体构象变化氧气结合最终引起整体构象变化 氧结合形成的构象改变，改变了四级结构相成的盐键，使其它亚基构象变化，使其它亚基转变为更亲氧构象，形成协同作用方便了氧的运输可以通过其它分子限制蛋白构象的微调变化可以通过其它分子限制蛋白构象的微调变化三三 蛋白质的重要性质蛋白质的重要性质(

38、(一一) ) 胶体性质胶体性质 蛋白质的分子量很大，但它在水中蛋白质的分子量很大，但它在水中能够能够形成胶体溶液形成胶体溶液(蛋白表面有带电蛋白表面有带电基团基团,但不同于化学溶胶吸附金属离但不同于化学溶胶吸附金属离子而带电子而带电)。蛋白质溶液具有胶体溶。蛋白质溶液具有胶体溶液的典型性质，如丁达尔现象、布郎液的典型性质，如丁达尔现象、布郎运动等运动等水膜水膜和同种和同种电荷排斥作用电荷排斥作用是胶体稳是胶体稳定的原因定的原因利用胶体性质可用于蛋白的分离：蛋白沉淀利用胶体性质可用于蛋白的分离：蛋白沉淀 由前述可知由前述可知, , 维持蛋白质溶液稳定的主要因素是蛋白质分子表面的水化膜和双电维持蛋

39、白质溶液稳定的主要因素是蛋白质分子表面的水化膜和双电层。若用化学或物理的方法破坏蛋白质的这两种因素，则蛋白质分子将凝聚层。若用化学或物理的方法破坏蛋白质的这两种因素，则蛋白质分子将凝聚而沉淀。方法有：而沉淀。方法有：等电点沉淀法：蛋白颗粒间无电荷的排斥作用，易于形成聚集成大颗粒，不稳定，等电点沉淀法：蛋白颗粒间无电荷的排斥作用，易于形成聚集成大颗粒，不稳定，易于沉淀析出。易于沉淀析出。盐析盐析：中性盐（硫酸铵）既中和蛋白所带电荷又破坏水化膜。分段盐析：中性盐（硫酸铵）既中和蛋白所带电荷又破坏水化膜。分段盐析有机溶剂沉淀以及重金属盐或者生物碱或酸试剂沉淀蛋白质：其有机溶剂沉淀以及重金属盐或者生物

40、碱或酸试剂沉淀蛋白质：其作用，蛋白质分作用，蛋白质分子相互聚集而从溶液中析出的现象也可产生子相互聚集而从溶液中析出的现象也可产生沉淀沉淀。变性的蛋白质不一定沉淀，变性的蛋白质不一定沉淀， 沉淀的蛋白质不一定变性。沉淀的蛋白质不一定变性。其它沉淀方式其它沉淀方式因酸、重金属盐类或者生物碱试剂的因酸、重金属盐类或者生物碱试剂的作用，蛋白质分子相互聚集而从溶液作用，蛋白质分子相互聚集而从溶液中析出的现象也可产生中析出的现象也可产生沉淀沉淀。 变性的蛋白质不一定沉淀，变性的蛋白质不一定沉淀， 沉淀的蛋白质不一定变性。沉淀的蛋白质不一定变性。蛋白质在等电点偏酸溶液中带正电荷，蛋白质在等电点偏酸溶液中带正

41、电荷，在等电点偏碱溶液中带负电荷，在等在等电点偏碱溶液中带负电荷，在等电点时为兼性离子。电点时为兼性离子。蛋白质是人体重要的缓冲剂。蛋白质是人体重要的缓冲剂。（二）两性解离性质（二）两性解离性质(电性电性) 蛋白质不管肽链有多长仍有自由的蛋白质不管肽链有多长仍有自由的-NH2或或-CO2H存在，在肽存在，在肽链的侧链也有尚未结合的极性基团，如赖氨酸的氨基、谷氨酸链的侧链也有尚未结合的极性基团，如赖氨酸的氨基、谷氨酸的羧基、半胱氨酸的巯基等。的羧基、半胱氨酸的巯基等。 这些碱性、酸性基团在溶液中会解离（两性离子），解离的这些碱性、酸性基团在溶液中会解离（两性离子），解离的程度与离子的性质、溶液的

42、程度与离子的性质、溶液的pH值、蛋白质中游离基团的性质和值、蛋白质中游离基团的性质和数目等有关。其两性解离可表示为数目等有关。其两性解离可表示为PNH2CO2HP+NH3CO2-OH-H+OH-H+PNH2CO2-P+NH3CO2H两性两性pH = pI 负离子负离子pH pI 正离子正离子pH pI 可见，在酸性溶可见，在酸性溶液中蛋白质解离成液中蛋白质解离成阳离子，在碱性溶阳离子，在碱性溶液中解离成阴离子液中解离成阴离子. .在某个在某个pHpH值时蛋白质成两性离子，所带正负电荷相等值时蛋白质成两性离子，所带正负电荷相等, , 此此pHpH值即为该蛋白质的等电点值即为该蛋白质的等电点(pI

43、), (pI), 不同的蛋白质有不同的蛋白质有不同的不同的pIpI值。值。) ) 测定蛋白质等电点必须在有测定蛋白质等电点必须在有一定离子浓一定离子浓度度的适当缓冲液中进行的适当缓冲液中进行( (离子强度影响离子强度影响H+H+解离解离) ) ) 在水溶液中，蛋白质的等电点一般偏酸，在水溶液中，蛋白质的等电点一般偏酸， 因为因为羧基的解离度比氨基的大羧基的解离度比氨基的大。) ) 等电点时等电点时蛋白质的导电性、溶解度、蛋白质的导电性、溶解度、 粘度、渗透压等粘度、渗透压等都是最小都是最小蛋白质的等电点蛋白质的等电点电泳现象电泳现象在不同的在不同的pHpH环境下，蛋白质的电学性质不同。环境下，

44、蛋白质的电学性质不同。 当溶液当溶液pH=pH=等电点时，等电点时，蛋白质粒子净电荷为零，在电场中不移动；蛋白质粒子净电荷为零，在电场中不移动；当溶液当溶液pHpH等电点时，等电点时，蛋白质粒子带负电荷，在电场中向正极移动；蛋白质粒子带负电荷，在电场中向正极移动；当溶液当溶液pHpH等电点时，等电点时，蛋白质粒子带正电荷，在电场中向负极移动。蛋白质粒子带正电荷，在电场中向负极移动。不同电荷量的蛋白,在纸电泳时,迁移距离不同（三）蛋白质的变性与复性（三）蛋白质的变性与复性蛋白质的变性蛋白质的变性（denaturation）在某些物理或化学因素的作用下，天然蛋白在某些物理或化学因素的作用下，天然蛋

45、白质严格的空间结构被破坏（不包括肽键的断质严格的空间结构被破坏（不包括肽键的断裂），从而引起蛋白质若干理化性质和生物学裂），从而引起蛋白质若干理化性质和生物学性质的改变，称为蛋白质的变性。性质的改变，称为蛋白质的变性。（主要是次级键变化）（主要是次级键变化）肽键不变、次级键变化，一级结构不变，分为可逆变性肽键不变、次级键变化，一级结构不变，分为可逆变性（3 3级以上结构被破坏）与不可逆变性（级以上结构被破坏）与不可逆变性（2 2级）级）引起蛋白质变性的因素引起蛋白质变性的因素 物理因素：高温破坏次级键、物理因素：高温破坏次级键、高压、紫外线、电离辐射、超声波等高压、紫外线、电离辐射、超声波等.

46、 . 化学因素：强酸、强碱破坏盐键化学因素：强酸、强碱破坏盐键有机溶剂（二甲基甲酰胺）破坏氢键有机溶剂（二甲基甲酰胺）破坏氢键 去污剂、尿素去污剂、尿素破坏疏水作用和氢键破坏疏水作用和氢键物理性质：物理性质：旋光性改变旋光性改变溶解度下降溶解度下降沉降率升高沉降率升高光吸收度增加光吸收度增加化学性质：化学性质：官能团反应性增加官能团反应性增加易被蛋白酶水解易被蛋白酶水解生物学性质：生物学性质：原有生物学活性丧失原有生物学活性丧失抗原性改变抗原性改变都与蛋白构象改变基团外露有关变性蛋白质的特征变性蛋白质的特征蛋白质的变性如不超过一定的限度，蛋白质的变性如不超过一定的限度，经适当处理后，可重新变为

47、天然蛋白经适当处理后，可重新变为天然蛋白质，这种现象称为蛋白质的复性。质，这种现象称为蛋白质的复性。与导致变性的因素、蛋白质种类、蛋与导致变性的因素、蛋白质种类、蛋白质分子结构的改变程度相关。白质分子结构的改变程度相关。蛋白质的复性蛋白质的复性（renaturationrenaturation）核糖核酸酶的变性与复性核糖核酸酶的变性与复性（四）蛋白质的颜色反应（四）蛋白质的颜色反应双缩脲：是两分子的尿素经加热失去一分双缩脲：是两分子的尿素经加热失去一分子子NHNH3 3而得到的产物。而得到的产物。双缩脲反应：双缩脲反应：双缩脲双缩脲 / / 两个两个以上肽键的多肽以上肽键的多肽 + + 碱性硫

48、碱性硫酸铜酸铜 紫红色或蓝紫色紫红色或蓝紫色络合物络合物为数不多的利用蛋白整体性质的显色反应为数不多的利用蛋白整体性质的显色反应反应名称反应名称试试 剂剂颜色颜色反应有关基团反应有关基团有 此 反 应 的有 此 反 应 的蛋 白 质 或 氨蛋 白 质 或 氨基酸基酸双缩脲反应双缩脲反应NaOH、CuSO2紫色或粉红紫色或粉红色色二个以上肽键二个以上肽键所有蛋白质所有蛋白质米伦反应米伦反应H g N O3、H g ( N O3)2及及HNO3混合物混合物红色红色 Tyr黄色反应黄色反应浓浓HNO3及及NH3黄色、橘色黄色、橘色 Tyr、Phe乙醛酸反应乙醛酸反应(Hopking-Cole反反应应

49、)乙醛酸试剂及浓乙醛酸试剂及浓H2SO4紫色紫色 Trp坂口反应坂口反应(Sakaguchi反应反应)-萘酚、萘酚、NaClO红色红色胍基胍基Arg酚试剂反应酚试剂反应(Folin-Cioculteu反应反应)碱性碱性CuSO4及磷及磷钨酸钨酸-钼酸钼酸蓝色蓝色酚基、吲哚基酚基、吲哚基Tyr茚三酮反应茚三酮反应茚三酮茚三酮蓝色蓝色自由氨基及羧基自由氨基及羧基-氨基酸氨基酸 蛋白质的颜色反应蛋白质的颜色反应OHN第五节 蛋白质研究相关技术分离测序鉴定一一 蛋白质的分离纯化蛋白质的分离纯化 层析层析 电泳电泳（二）分离方法分类介绍（二）分离方法分类介绍利用物质分子量、密度、形状的不同，利用物质分子

50、量、密度、形状的不同，经超速离心后分布于不同的液层而分离。经超速离心后分布于不同的液层而分离。超速离心也可用来测定蛋白质的分子量，超速离心也可用来测定蛋白质的分子量，蛋白质的分子量与其沉降系数蛋白质的分子量与其沉降系数S S成正比。成正比。( () )分子大小（超速离心）分子大小（超速离心）()分子大小(凝胶过滤分离蛋白质凝胶过滤分离蛋白质)n概念：概念： 在蛋白质溶液中加入大量中性盐，以破坏蛋白在蛋白质溶液中加入大量中性盐，以破坏蛋白质的胶体性质，使蛋白质从溶液中沉淀析出，质的胶体性质，使蛋白质从溶液中沉淀析出，称为盐析。称为盐析。n常用的中性盐有：硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等。常用的中性盐有：

51、硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等。 ()溶解度溶解度-盐析盐析盐析时，溶液的盐析时，溶液的pHpH在蛋白质的在蛋白质的等电点处等电点处效果最好。效果最好。盐析沉淀蛋白质时，通常不会引起蛋白质的变性。盐析沉淀蛋白质时，通常不会引起蛋白质的变性。分段盐析：半饱和硫酸铵溶液可沉淀血浆球蛋白，分段盐析：半饱和硫酸铵溶液可沉淀血浆球蛋白，而饱和硫酸铵溶液可沉淀血浆清蛋白。而饱和硫酸铵溶液可沉淀血浆清蛋白。()溶解度溶解度-盐析盐析n 凡能与水以任意比例混合的有机溶剂，凡能与水以任意比例混合的有机溶剂，如乙醇、甲醇、丙酮等，均可用于沉淀如乙醇、甲醇、丙酮等，均可用于沉淀蛋白质。蛋白质。n沉淀原理是：沉淀原理是：A

52、 A、脱蛋白胶体上水膜作用；、脱蛋白胶体上水膜作用；B B、使水的介电常数降低，蛋白分子异种、使水的介电常数降低，蛋白分子异种电荷相互吸引力增加电荷相互吸引力增加, ,蛋白质溶解度降低。蛋白质溶解度降低。 ( () )溶解度溶解度- -有机溶剂沉淀有机溶剂沉淀( () )电荷差异（离子交换层析）电荷差异（离子交换层析）( () )亲和特性（亲和层析）亲和特性（亲和层析）(1)(1)、末端分析、末端分析N N末端测定末端测定SangerSanger法法EdmanEdman法法DNSDNS法法氨肽酶法氨肽酶法C C末端测定末端测定肼解法肼解法羧肽酶法羧肽酶法二 蛋白质一级结构的测定2 2、二硫键的

53、拆开和肽链的分离、二硫键的拆开和肽链的分离3 3、肽链的部分水解和肽段的分离、肽链的部分水解和肽段的分离（1 1）溴化氰裂解）溴化氰裂解（2 2）部分酸水解）部分酸水解（3 3）酶水解（牢记四种酶解方式）酶水解（牢记四种酶解方式）常考察内容 酸碱 CNBr 酶（1 1）酸水解）酸水解 常用常用6 mol/L的盐酸或的盐酸或4 mol/L的硫酸在的硫酸在105-110条件下进行水解，反应时间约条件下进行水解，反应时间约20小时。小时。 此法的优点是此法的优点是不容易引起水解产物的消旋化。缺点是色氨酸被沸酸完全破坏不容易引起水解产物的消旋化。缺点是色氨酸被沸酸完全破坏； 含有含有羟基的氨基酸如丝氨

54、酸或苏氨酸有一小部分被分解；天门冬酰胺和谷氨酰胺侧链的酰胺基被水解成了羟基的氨基酸如丝氨酸或苏氨酸有一小部分被分解；天门冬酰胺和谷氨酰胺侧链的酰胺基被水解成了羧基羧基。肽链的水解方式肽链的水解方式（）碱水解（）碱水解 一般用一般用5 mol/L氢氧化钠煮沸氢氧化钠煮沸10-20小时。小时。 由于水解过程中由于水解过程中许多氨基酸都受到不同程度的破坏许多氨基酸都受到不同程度的破坏，产率不高。，产率不高。 部分的水解部分的水解产物发生产物发生消旋化消旋化。 该法的优点是该法的优点是色氨酸色氨酸在水解中不受破坏。在水解中不受破坏。（）部分酸水解（）部分酸水解 稀酸Asp的羧基端 浓酸羟基氨基酸的氨基

55、端（）（）CNbr裂裂解解Met的羧基端专一性好，切点少（）酶水解（）酶水解 目前用于蛋白质肽链断裂的蛋白水解酶（proteolytic enzyme）或称蛋白酶（proteinase）已有十多种。 应用酶水解多肽不会破坏氨基酸，也不会发生消旋化。水解的产物为较小的肽段。 最常见的蛋白水解酶有以下几种： Trypsin ：R1=赖氨酸赖氨酸Lys和精氨酸和精氨酸Arg侧链（专一性较强，水解速度快）侧链（专一性较强，水解速度快） 碱性氨基酸羧基端碱性氨基酸羧基端NHCHCOR4NHCHCOR3NHCHCOR2NHCHCOR1水解位点水解位点胰蛋白酶胰蛋白酶 胰凝乳蛋白酶（胰凝乳蛋白酶（Chymo

56、trypsin）：）：R1=苯丙氨酸苯丙氨酸Phe,色氨酸色氨酸Trp,酪氨酸酪氨酸Tyr; 亮氨酸亮氨酸Leu，蛋氨酸，蛋氨酸Met和组氨酸和组氨酸His水解稍慢。水解稍慢。 芳香氨基酸羧基端芳香氨基酸羧基端NHCHCOR4NHCHCOR3NHCHCOR2NHCHCOR1糜蛋白酶糜蛋白酶水解位点水解位点 Pepsin：R1=苯丙氨酸苯丙氨酸Phe,色氨酸色氨酸Trp,酪氨酸酪氨酸Tyr; 亮氨酸亮氨酸Leu水解速度较快。水解速度较快。 主要是酸性氨基酸和芳香氨基酸羧酸端主要是酸性氨基酸和芳香氨基酸羧酸端NHCHCOR4NHCHCOR3NHCHCOR2NHCHCOR1胃蛋白酶胃蛋白酶水解位点水

57、解位点 thermolysin：R2=苯丙氨酸苯丙氨酸Phe,色氨色氨酸酸Trp,酪氨酸酪氨酸Tyr; 亮氨酸亮氨酸Leu，异亮氨，异亮氨酸酸Ileu,蛋氨酸蛋氨酸Met以及其它疏水性强的以及其它疏水性强的氨基酸水解速度较快。氨基酸水解速度较快。NHCHCOR4NHCHCOR3NHCHCOR2NHCHCOR1嗜热菌蛋白酶嗜热菌蛋白酶水解位点水解位点4、测定每一段氨基酸顺序、测定每一段氨基酸顺序(edman降解降解)5、由重叠片段推断肽链顺序、由重叠片段推断肽链顺序6 、确定二硫键位置、确定二硫键位置确定二硫键位置(一一) 氨基酸的分析氨基酸的分析纸层析法纸层析法:利用极性与非极性氨基酸在水和利

58、用极性与非极性氨基酸在水和有机溶剂中的溶解度不同的特点，在滤有机溶剂中的溶解度不同的特点，在滤纸上进行分离的方法纸上进行分离的方法(分配层析分配层析);柱层析法：根据氨基酸的柱层析法：根据氨基酸的离子交换离子交换反应的原反应的原理，如理，如HPLC;薄层层析法：利用薄层层析法：利用吸附吸附原理进行层析的方法，原理进行层析的方法，在玻板上的薄层吸附剂上进行。在玻板上的薄层吸附剂上进行。三三 蛋白的鉴定及定量蛋白的鉴定及定量YXRf=X/Y?Filter-paper Chromatography溶剂前沿Thin-layer ChromatographyThin-layerThin-layer1cmPumpdetectorcollectorfilterinjectormobile phaseconstant temperatureovenprocessorandcontrolerPrinterColumnHPLCM in u te s024681 0mAU0