第一章 植物组织培养(1)

1、内蒙古大学生命科学学院内蒙古大学生命科学学院 生物楼生物楼302302林晓飞林晓飞植物细胞与植物细胞与基因工程基因工程生物技术概述生物技术概述概念：概念：生物技术生物技术(biotechnology), 也称也称生物工程生物工程( bioengineering),是指以现代是指以现代生命科学生命科学为为基础基础, 结合先进的工程技术手段和其他基结合先进的工程技术手段和其他基础学科的科学原理础学科的科学原理, 按照预先的设计改造按照预先的设计改造生物体或加工生物原料生物体或加工生物原料, 为人类生产出所为人类生产出所需要的产品或达到某种目的的一系列技术。需要的产品或达到某种目的的一系列技术。基本

2、内容：基本内容：主要包括主要包括基因工程、细胞工程、酶基因工程、细胞工程、酶 工程、发酵工程和蛋白质工程工程、发酵工程和蛋白质工程（1 1）细胞工程：）细胞工程： 用细胞生物学方法对细胞进行改用细胞生物学方法对细胞进行改造，使细胞按人类需要生产有用的产品，或者遗传造，使细胞按人类需要生产有用的产品，或者遗传物质，从而培育新的生物类型。包括：细胞杂交技物质，从而培育新的生物类型。包括：细胞杂交技术、单克隆抗体、细胞大规模培养技术。术、单克隆抗体、细胞大规模培养技术。本课程以植物细胞工程为核心进行介绍本课程以植物细胞工程为核心进行介绍细胞工程分类细胞工程分类根据研究对象的不同根据研究对象的不同植物

3、细胞工程植物细胞工程动物细胞工程动物细胞工程微生物细胞工程微生物细胞工程（1 1）基因工程：）基因工程：重组重组DNADNA技术技术基因工程的操作包含以下步骤：基因工程的操作包含以下步骤： 获得目的基因获得目的基因 构造重组构造重组 DNA DNA 分子分子 转化或转染转化或转染 表达表达 蛋白质产物的分离纯化蛋白质产物的分离纯化基因工程的科学价值和应用价值最大，是基因工程的科学价值和应用价值最大，是现代生物技术的核心和基础现代生物技术的核心和基础（3 3）酶工程：）酶工程：是酶学原理与化工技术结合而形成是酶学原理与化工技术结合而形成的应用技术领域，他是在一定的反应装置里，利用的应用技术领域，

4、他是在一定的反应装置里，利用酶的催化作用，将相应的原料转化为有关物质的技酶的催化作用，将相应的原料转化为有关物质的技术。术。酶工程在食品、轻工业、医药、能源开发与环境酶工程在食品、轻工业、医药、能源开发与环境工程中有广泛的应用：工程中有广泛的应用：例，乳品加工、啤酒发酵；例，乳品加工、啤酒发酵； 制药、诊断、检测、治疗；制药、诊断、检测、治疗；洗涤剂制造工业、塑料工业、造纸及化纤工业洗涤剂制造工业、塑料工业、造纸及化纤工业（4 4）蛋白质工程：又称为第二代基因工程，）蛋白质工程：又称为第二代基因工程，是利用基是利用基因工程等技术改良天然蛋白质的科学。通过对编码天因工程等技术改良天然蛋白质的科学

5、。通过对编码天然蛋白质的基因进行修饰，获取比天然蛋白更理想的然蛋白质的基因进行修饰，获取比天然蛋白更理想的新型蛋白质。新型蛋白质。（5 5）发酵工程：也被称为微生物工程）发酵工程：也被称为微生物工程 是指利用微生是指利用微生物发酵作用，通过现代工程技术手段来生产各种有用物发酵作用，通过现代工程技术手段来生产各种有用物质，或者把微生物直接用于生物反应器的技术。物质，或者把微生物直接用于生物反应器的技术。应用：制酒业（啤酒、白酒、葡萄酒等），制药业应用：制酒业（啤酒、白酒、葡萄酒等），制药业应用：工业、农业和医药方面应用：工业、农业和医药方面生物技术的分类生物技术的分类根据其在根据其在不同生物门类

6、不同生物门类的应用状况可划分为：的应用状况可划分为：植物生物技术、动物生物技术和微生物生物技术植物生物技术、动物生物技术和微生物生物技术根据其应用的行业不同可划分为：根据其应用的行业不同可划分为：农业生物技术、林业生物技术、医药生物技术农业生物技术、林业生物技术、医药生物技术环境生物技术、工业生物技术环境生物技术、工业生物技术广义的生物技术：广义的生物技术：传统的生物技术和现代生物技术传统的生物技术和现代生物技术传统的生物技术：传统的生物技术：古代发明并一直流传应用的发酵技术、古代发明并一直流传应用的发酵技术、酿酒、酿醋、制酱等。酿酒、酿醋、制酱等。现代生物技术：现代生物技术：是在分子生物学、

7、遗传学、微生物学、是在分子生物学、遗传学、微生物学、细胞生物学、生物化学等学科的迅速发展及相关技术突细胞生物学、生物化学等学科的迅速发展及相关技术突破的基础上产生并发展起来的。破的基础上产生并发展起来的。狭义的生物技术：狭义的生物技术：是以基因工程为标志的现代生物技术是以基因工程为标志的现代生物技术授课方式：理论教学与实验教学相结合授课方式：理论教学与实验教学相结合授课时数：授课时数：3 32 2学时（学时（2 2学分）学分）实验时数：实验时数：6464学时（学时（2 2学分）学分）参考教材：朱延明主编的参考教材：朱延明主编的植物生物技术植物生物技术 张献龙、唐克轩主编的张献龙、唐克轩主编的植

8、物生物技术植物生物技术 潘瑞炽主编的潘瑞炽主编的植物细胞工程植物细胞工程 谭晓风、张志毅主编的谭晓风、张志毅主编的林业生物技术林业生物技术基本教学计划基本教学计划主要教学内容主要教学内容第一篇第一篇 植物组织培养植物组织培养 植物组织培养的含义、特点及应用植物组织培养的含义、特点及应用 植物组织培养的基本要求植物组织培养的基本要求 培养基和培养条件培养基和培养条件 植物器官和组织培养植物器官和组织培养 体细胞胚胎发生与人工种子体细胞胚胎发生与人工种子第二篇第二篇 植物细胞工程植物细胞工程 植物细胞工程原理及应用途径植物细胞工程原理及应用途径 植物细胞培养植物细胞培养 原生质体培养及细胞融合原生

9、质体培养及细胞融合第三篇第三篇 植物基因工程植物基因工程 植物基因的克隆植物基因的克隆 植物基因工程载体的构建植物基因工程载体的构建 植物的遗传转化植物的遗传转化 转基因植物的安全性转基因植物的安全性主要教学内容主要教学内容植物细胞与基因工程大实验植物细胞与基因工程大实验周周次次 实验模块实验模块植物组织培养植物组织培养植物细胞工程植物细胞工程植物基因工程植物基因工程1 1MSMS培养基配制，包括培养基配制，包括MS母液及主要植物激素的配置（母液及主要植物激素的配置（2）2 2拟南芥种子的消毒及播种（拟南芥种子的消毒及播种（2）3 3拟南芥愈伤组织诱导（拟南芥愈伤组织诱导（2）4 4拟南芥试管

10、苗的移栽及驯化（拟南芥试管苗的移栽及驯化（2）5 5拟南芥愈伤组织的继代培养（拟南芥愈伤组织的继代培养（2）6 6农杆菌的转化及重组菌的筛选鉴定（农杆菌的转化及重组菌的筛选鉴定（2）7 7利用花序浸染法进行拟南芥的遗传转化（利用花序浸染法进行拟南芥的遗传转化（2）8 8细胞悬浮培养系的建立（细胞悬浮培养系的建立（2）9 9不定芽的分化培养（不定芽的分化培养（2）1010悬浮细胞的继代培养悬浮细胞的继代培养(1)拟南芥种子的采收（拟南芥种子的采收（1）1111转基因拟南芥的抗性筛选（转基因拟南芥的抗性筛选（2）1212原生质体分离及培养（原生质体分离及培养（2）1313不定根诱导不定根诱导及植株

11、再生（及植株再生（1）转基因拟南芥的移栽转基因拟南芥的移栽(1)1414原生质体的遗传转化（原生质体的遗传转化（2）1515转化细胞的荧光观察（转化细胞的荧光观察（2）1616基因组基因组DNA的提取及的提取及PCR检测（检测（2）实验材料：拟南芥实验材料：拟南芥 （Arabidopsis thaliana）为十字花科植物。为十字花科植物。 拟南芥的优点：拟南芥的优点：生长周期短生长周期短植株小、结子多。植株小、结子多。基因组小且已完成测序基因组小且已完成测序自花受粉，基因高度纯合自花受粉，基因高度纯合用理化因素处理突变率很高，用理化因素处理突变率很高，容易获得各种代谢功能的缺陷型容易获得各种

12、代谢功能的缺陷型遗传转化容易、转化率高遗传转化容易、转化率高实验模式：集中讲解、独立操作实验模式：集中讲解、独立操作实验开始时由实验教师集中讲解实验开始时由实验教师集中讲解实验目标实验目标、实验原理实验原理、操作步操作步骤骤、技术要点技术要点、相关设备的使用及注意事项相关设备的使用及注意事项；要求学生在；要求学生在规定规定的时间内择时独立完成各项实验内容的时间内择时独立完成各项实验内容。指导教师在实验过程中。指导教师在实验过程中进行指导和监督。进行指导和监督。实验室管理模式：全天候开放实验室管理模式：全天候开放根据自身情况，自主选择时间进行实验操作、培养物的观察和根据自身情况，自主选择时间进行

13、实验操作、培养物的观察和管理。实验教师及协助实验课的研究生轮流值班，对实验过程管理。实验教师及协助实验课的研究生轮流值班，对实验过程进行监督和管理。进行监督和管理。建议：采用预约的方式建议：采用预约的方式考核评价体系（预案）：考核评价体系（预案）：实验总结报告（论文形式）、实验操作、实验理论闭卷考试实验总结报告（论文形式）、实验操作、实验理论闭卷考试及课程讨论。及课程讨论。本章主要内容本章主要内容第一节第一节 植物组织培养的含义、特点及应用植物组织培养的含义、特点及应用第二节第二节 植物组织培养的基本要求植物组织培养的基本要求第三节第三节 培养基和培养条件培养基和培养条件第四节第四节 植物器官

14、和组织培养植物器官和组织培养第五节第五节 体细胞胚胎发生与人工种子体细胞胚胎发生与人工种子一、一、 植物组织培养的理论基础植物组织培养的理论基础（1）细胞学说）细胞学说SchleidenSchwann 生物是由细胞和细胞的产物所组成；生物是由细胞和细胞的产物所组成； 细胞是生物体结构和功能的基本单位细胞是生物体结构和功能的基本单位； 所有细胞在结构和组成上基本相似；所有细胞在结构和组成上基本相似； 新细胞是由已存在的细胞分裂而来；新细胞是由已存在的细胞分裂而来； 生物体是通过细胞的活动来反映其功能的生物体是通过细胞的活动来反映其功能的； 生物的疾病是因为其细胞机能失常生物的疾病是因为其细胞机能

15、失常。 细胞学说是细胞学说是18381839年间由德国的植物学家年间由德国的植物学家 施莱登施莱登（Schleiden）和动物学家）和动物学家 施旺施旺（Schwann）所提出）所提出,直到直到1858年才较完善。它是关于生物有机体组成的学说年才较完善。它是关于生物有机体组成的学说。主要内容有：主要内容有：内容：内容：指植物的每个细胞都指植物的每个细胞都包含着该物种的全部遗传信包含着该物种的全部遗传信息，从而具备发育成完整植息，从而具备发育成完整植株的遗传能力。在适宜条件株的遗传能力。在适宜条件下，任何一个细胞都可以发下，任何一个细胞都可以发育成一个新个体。育成一个新个体。 植物细胞全能性是植

16、物组织培养的理论基础植物细胞全能性是植物组织培养的理论基础19021902年，德国植物学家哈伯兰特预言植物体的任何年，德国植物学家哈伯兰特预言植物体的任何一个细胞，都有长成完整个体的潜在能力，这种潜一个细胞，都有长成完整个体的潜在能力，这种潜在能力就叫植物细胞的在能力就叫植物细胞的“全能性全能性”。 1958年德国的年德国的Steward 和和Reinert在固体在固体培养基上培养胡萝卜的根，发现愈伤组培养基上培养胡萝卜的根，发现愈伤组织中有些细胞可以发育成胚。织中有些细胞可以发育成胚。 （2 2）植物细胞的细胞全能性）植物细胞的细胞全能性二、二、 植物组织培养植物组织培养的技术背景的技术背景

17、（1 1）细胞离体培养试验）细胞离体培养试验19021902年德国植物学家年德国植物学家HaberlandtHaberlandt为了证明植物细胞具为了证明植物细胞具有全能性，首次提出细胞培养有全能性，首次提出细胞培养的概念，也是第一个用的概念，也是第一个用人工培养基对分离的植物细胞进行培养的人。人工培养基对分离的植物细胞进行培养的人。 但由于但由于HaberlandtHaberlandt使用的培养液成分简单，培养的细使用的培养液成分简单，培养的细胞是高度分化的细胞，又没采取消毒技术，所以实验胞是高度分化的细胞，又没采取消毒技术，所以实验失败，培养的细胞虽然存活了几个月但没能分裂。失败，培养的细

18、胞虽然存活了几个月但没能分裂。 （2 2）愈伤组织培养的成功）愈伤组织培养的成功Haberlandt、White和和Nobecourt被誉为植物组织培养的奠基人被誉为植物组织培养的奠基人 Haberlandt转而对损伤修复发生兴趣，提出激素作用的概念转而对损伤修复发生兴趣，提出激素作用的概念（leptohormone)；为后来激素理论的建立和在组织培养中的为后来激素理论的建立和在组织培养中的广泛应用奠定了基础广泛应用奠定了基础。 1934年年White用离体的番茄根建立了第一个活跃生长的无性系用离体的番茄根建立了第一个活跃生长的无性系；使根的离体培养实验首次获得了真正的成功，并首次发现和使根的

19、离体培养实验首次获得了真正的成功，并首次发现和提出提出B族维生素族维生素B1、维生素、维生素B6和烟酸的重要性和烟酸的重要性。 Cautheret在山毛柳和黑杨形成层组织的培养中也发现了在山毛柳和黑杨形成层组织的培养中也发现了B族族维生素的作用，并使培养获得了成功维生素的作用，并使培养获得了成功。1939年年 Nobecourt也用胡萝卜建立了类似的连续生长的组织培也用胡萝卜建立了类似的连续生长的组织培养物。养物。 19341934年，凯格等人从一些植物中分离出了这种物质年，凯格等人从一些植物中分离出了这种物质并命名它为吲哚乙酸，因而习惯上常把吲哚乙酸作并命名它为吲哚乙酸，因而习惯上常把吲哚乙

20、酸作为生长素的同义词为生长素的同义词 （3 3）生长素的发现）生长素的发现19281928年温特证实了胚芽的尖端确实产生了某种物质，年温特证实了胚芽的尖端确实产生了某种物质，能够控制胚芽生长能够控制胚芽生长, ,并把这种物质命名为生长素。并把这种物质命名为生长素。 18801880年达尔文父子对草的胚芽鞘向光性进行了研究。年达尔文父子对草的胚芽鞘向光性进行了研究。 （4 4）细胞分裂素的发现与不定器官分裂的控制）细胞分裂素的发现与不定器官分裂的控制19551955年从鲱鱼精子年从鲱鱼精子 DNADNA中分离到激动素；后来又从植中分离到激动素；后来又从植物（物（幼嫩的玉米种幼嫩的玉米种子）中分离

21、到具有相同生理活性的子）中分离到具有相同生理活性的细胞分裂素。细胞分裂素。19621962年年MurashigeMurashige和和SkoogSkoog发表了烟草某一品种的最适发表了烟草某一品种的最适的的MSMS培养基培养基19571957年年 MillerMiller和和SkoogSkoog提出了不定器官的分化由生长提出了不定器官的分化由生长素和细胞分裂素的比例来控制的假说。素和细胞分裂素的比例来控制的假说。19581958年美国植物学家斯图尔德（年美国植物学家斯图尔德（F.C.StewardF.C.Steward）等人，）等人，用胡萝卜韧皮部的细胞进行培养，终于得到了完整植用胡萝卜韧皮部

22、的细胞进行培养，终于得到了完整植株，并且这一植株能够开花结实，证实了哈伯兰特在株，并且这一植株能够开花结实，证实了哈伯兰特在五十多年前关于细胞全能性的预言。五十多年前关于细胞全能性的预言。 第一节第一节 植物组织培养概述植物组织培养概述一、植物组织培养的含义一、植物组织培养的含义 二、植物组织培养的特点二、植物组织培养的特点三、植物组织培养的应用三、植物组织培养的应用一、植物组织培养的含义一、植物组织培养的含义植物组织培养（植物组织培养（plant tissue culture)是将植物离体的器是将植物离体的器官、组织、细胞或原生质体在人工配制的培养基上，在官、组织、细胞或原生质体在人工配制的

23、培养基上，在适宜的条件下使其生长分化形成完整植株的过程。适宜的条件下使其生长分化形成完整植株的过程。植物组织培养必须具备的三个基本条件：植物组织培养必须具备的三个基本条件：1 1、外植体、外植体（explant)：由活体（由活体（in vivo)植物体上切取下来的，植物体上切取下来的，用于组织培养的各种接种材料。包括各种器官、组织、用于组织培养的各种接种材料。包括各种器官、组织、单单细细胞或原生质体等。胞或原生质体等。2 2、适宜的环境条件、适宜的环境条件: :培养基、光照、温度、湿度等培养基、光照、温度、湿度等3 3、无菌条件、无菌条件: :实验设备、谨慎细致的操作实验设备、谨慎细致的操作根

24、据外植体的种类不同可分为：根据外植体的种类不同可分为：器官培养、组织培养、器官培养、组织培养、细胞培养和原生质体培养细胞培养和原生质体培养根据培养方式不同可分为：根据培养方式不同可分为：固体培养：使用琼脂等固化剂将培养基固化后培养固体培养：使用琼脂等固化剂将培养基固化后培养液体培养：使用液体培养基培养进行震荡培养液体培养：使用液体培养基培养进行震荡培养根据培养过程不同可分为：根据培养过程不同可分为：初代培养：从植物体上分离的部分（外植体）进行初代培养：从植物体上分离的部分（外植体）进行 的第一次培养的第一次培养继代培养：初代培养后将培养物转移到新的培养基继代培养：初代培养后将培养物转移到新的培

25、养基 上的培养。上的培养。固体培养固体培养液体培养液体培养 二、植物组织培养的特点二、植物组织培养的特点 培养条件可以人为控制培养条件可以人为控制。 生长周期短，繁殖率高。生长周期短，繁殖率高。 管理方便，利于工厂化生产和自动化控制。管理方便，利于工厂化生产和自动化控制。三、植物组织培养的应用三、植物组织培养的应用（一）生产栽培上的应用（一）生产栽培上的应用（1 1）苗木的快速繁殖）苗木的快速繁殖 传统的无性繁殖方法，虽能保持优良性状但效率低。传统的无性繁殖方法，虽能保持优良性状但效率低。组织培养方法能保持优良性状的同时效率高。组织培养方法能保持优良性状的同时效率高。成功例成功例: :兰花兰花

26、 1 1外植体外植体 1 1年年 400400万个球万个球茎茎植物组织培养已成为良种繁育的手段，形成了产业化植物组织培养已成为良种繁育的手段，形成了产业化（2 2）无病毒苗的获得）无病毒苗的获得草莓皱缩病毒草莓皱缩病毒(SCV)(SCV)草莓斑驳病毒草莓斑驳病毒(SMV)(SMV)草莓镶脉病毒草莓镶脉病毒(SVBV)(SVBV)草莓轻型黄边病毒草莓轻型黄边病毒(SMYEV)(SMYEV)草莓潜隐环斑病毒草莓潜隐环斑病毒(SIRSV) (SIRSV) 感病毒后感病毒后长势长势慢，慢，植株矮化植株矮化表现为：表现为：叶片小、无光泽、失绿变黄、皱缩扭曲叶片小、无光泽、失绿变黄、皱缩扭曲 座座果少、果

27、实小、产量低果少、果实小、产量低 。病毒病毒无性繁殖无性繁殖含病毒植株组织培养组织培养无病毒植株无病毒植株无病毒苗可以减少无病毒苗可以减少病害，增加产量。病害，增加产量。（二）在遗传育种上的应用（二）在遗传育种上的应用（1 1）胚胎培养的应用）胚胎培养的应用远缘杂交远缘杂交幼胚早期败育幼胚早期败育植株植株植株植株胚胎培养胚胎培养早熟种果树早熟种果树三倍体果树三倍体果树种子发育不全种子发育不全植株植株胚乳胚乳培养培养三倍体三倍体六倍体六倍体加倍加倍（2 2）花药和花粉培养的应用）花药和花粉培养的应用花药花粉培养单倍体植株优点优点: : 获得纯品系获得纯品系 缩短育种的时间缩短育种的时间（三）在种

28、质资源保存方面的应用（三）在种质资源保存方面的应用优越性优越性: : 利用较小的空间可以大量保存利用较小的空间可以大量保存 可避免病虫害可避免病虫害 不受外界不利环境条件的影响不受外界不利环境条件的影响 可在短时间进行迅速繁殖可在短时间进行迅速繁殖 有利于地区间、国际间种质资源的交换有利于地区间、国际间种质资源的交换附图附图1 1 中国农业科学院热带作物品种资源研究所中国农业科学院热带作物品种资源研究所 （工作人员在移植离体保存的热带植物工作人员在移植离体保存的热带植物 ）附图附图2 2 中国农业科学院热带作物品种资源研究所中国农业科学院热带作物品种资源研究所 （研究员在低温库观察保存的热带野

29、生兰花研究员在低温库观察保存的热带野生兰花） （四）组织培养在遗传、生理和病理学研究中的应用（四）组织培养在遗传、生理和病理学研究中的应用组织培养技术组织培养技术 遗传、生理和病理学研究遗传、生理和病理学研究推动推动 扩展应用扩展应用 花粉和花药花粉和花药培养培养单倍体植株单倍体植株纯和二倍体纯和二倍体加倍加倍花药花药远缘杂交远缘杂交染色体新类型染色体新类型遗传研究遗传研究培养培养细胞细胞培养培养细胞细胞植株植株生理研究生理研究发生研究发生研究培养培养四、植物组织培养技术的展望四、植物组织培养技术的展望19021902年德国植物生理学家年德国植物生理学家HaberlandtHaberlandt

30、提出细胞全能性提出细胞全能性在生命科学领域解决了许多科研和生产上的难题在生命科学领域解决了许多科研和生产上的难题100100多年多年现代生命科学的发展现代生命科学的发展促进生物技术发展促进生物技术发展现在现在农业林业园艺轻工业加工业牧业水产药业将来将来第二节第二节 植物组织培养的基本要求植物组织培养的基本要求一、植物组织培养的基本流程一、植物组织培养的基本流程二、植物组织培养实验室的布局和设置二、植物组织培养实验室的布局和设置三、植物组织培养实验室的主要仪器设备三、植物组织培养实验室的主要仪器设备四、植物组织培养实验室常用的器皿用具四、植物组织培养实验室常用的器皿用具一、植物组织培养的基本流程

31、一、植物组织培养的基本流程预备工作预备工作品种，材料品种，材料培养基培养基培养方法培养方法结果分析结果分析洗器皿洗器皿干燥干燥分装培养基、封口分装培养基、封口灭菌灭菌（准备室（准备室) ) ( (无菌操作室无菌操作室) ) ( (培养室培养室) )（生化分析（生化分析) )（细胞学分析（细胞学分析) )培养基配制培养基配制材料材料洗净、预处理洗净、预处理消毒消毒分离分离接种接种接种转移接种转移接种转移接种转移初代培养初代培养继代培养继代培养分化培养分化培养炼苗炼苗移栽移栽（温室、大棚（温室、大棚) )二二 、 植物组织培养实验室的布局和设置植物组织培养实验室的布局和设置（准备室）（准备室）给排

32、水系统给排水系统蒸馏水机蒸馏水机灭菌锅灭菌锅实验台实验台药品橱药品橱搁物架搁物架烘干箱烘干箱搁物架搁物架工作台工作台搁物架搁物架（无菌操作室）（无菌操作室）离心机离心机（光培养室）（光培养室）悬浮培养悬浮培养（暗培养室）（暗培养室）（摄影室）（摄影室）（缓冲间）（缓冲间）（细胞学实验）（细胞学实验）过道过道窗户窗户门门植物培养室规划图（林晓飞）植物培养室规划图（林晓飞）不间断电源表示电源插座的位置共计26处（间隔墙的两侧均须安装插座）两个水槽出需要给水口表示培养架，为需电源处本植物培养室需使用空调三台，须预留空调用电源预计总用电量为：预计总用电量为：10KW10KW比例尺1:100超净台无菌培

33、养区无菌培养区盆栽区盆栽区实验台超净台超净台超净台培养箱培养箱试剂架准备室准备室水槽水接种室接种室超净工作台超净工作台三、植物组织培养实验室的主要仪器设备三、植物组织培养实验室的主要仪器设备（一）常规设备：（一）常规设备：冰箱（冰箱（-20-20度）、天平、蒸馏水发生器、酸度度）、天平、蒸馏水发生器、酸度 计、电炉、水浴锅计、电炉、水浴锅（二）灭菌设备：（二）灭菌设备：高压灭菌锅、烘干箱、酒精灯、过滤除菌器高压灭菌锅、烘干箱、酒精灯、过滤除菌器（三）无菌操作设备：（三）无菌操作设备：超净工作台超净工作台（四）培养设备：（四）培养设备：培养架、光照培养箱、震荡培养器（恒温摇床）培养架、光照培养箱

34、、震荡培养器（恒温摇床）（五）其他设备：（五）其他设备：显微镜、离心机等显微镜、离心机等真空烘箱真空烘箱 真空烘箱真空烘箱 植物光照培养箱植物光照培养箱双层大容量恒温培养振荡器 四、植物组织培养实验室常用的器皿用具四、植物组织培养实验室常用的器皿用具（一）培养用器皿（一）培养用器皿 试管、三角瓶、试管、三角瓶、L L和和T T型管、培养皿、广口瓶型管、培养皿、广口瓶（二）操作用器皿（二）操作用器皿 试剂瓶、容量瓶、量筒、移液管（枪）、烧杯试剂瓶、容量瓶、量筒、移液管（枪）、烧杯（二）操作用器械（二）操作用器械 镊子镊子 剪刀剪刀 解剖刀解剖刀 接种工具接种工具第三节第三节 培养基及培养条件培养

35、基及培养条件一、培养基一、培养基二、植物组织培养的环境条件二、植物组织培养的环境条件离体培养的植物也受到温度，光照，湿度，气体离体培养的植物也受到温度，光照，湿度，气体及培养基的组成，及培养基的组成，pHpH等各种环境条件的影响。等各种环境条件的影响。一、一、 培养基培养基( (一一) )培养基的成分培养基的成分培养基中应包括植物生长必需的培养基中应包括植物生长必需的1616种营养元素和某些种营养元素和某些生理活性物质。生理活性物质。可概括为可概括为5 5大类：大类：无机营养、有机物、植物生长调节无机营养、有机物、植物生长调节剂、琼脂及其他添加物。剂、琼脂及其他添加物。1 1无机营养物无机营养

36、物 植物生长必须的有植物生长必须的有1 16 6种元素：种元素： 大量元素：大量元素：氮（氮（N N）、）、 磷（磷（P P）、）、 钾（钾（K K）、）、 钙（钙（CaCa）、镁（）、镁（MgMg）、硫（）、硫（S S） 微量元素：微量元素：铁（铁（FeFe）、硼（）、硼（B B）、）、 锰（锰（MnMn）、）、 铜（铜（CuCu）、锌（）、锌（ZnZn）、钼（）、钼（M MO O）、）、 氯（氯（ClCl）、碘、碘 (I) (I) 、 钴钴 (Co)(Co) 、钠钠 (Na)(Na)国际植物生理协会国际植物生理协会: :微量元素微量元素0.5m mol/L0.5m mol/L大量元素大量元

37、素无机氮无机氮可以两种形式供应，即可以两种形式供应，即硝态氮硝态氮和和铵态氮铵态氮。有些培养基。有些培养基以硝态氮为主，另一些以铵态氮为主，多数二者兼而有之。以硝态氮为主，另一些以铵态氮为主，多数二者兼而有之。氮（氮（N N）氨基酸，维生素，蛋白质和核酸的重要组成氨基酸，维生素，蛋白质和核酸的重要组成钙（钙（CaCa）细胞壁及细胞内信号传导途径中的重要组成细胞壁及细胞内信号传导途径中的重要组成磷（磷（P P）细胞核主要组分，磷脂，核酸，酶，维生素细胞核主要组分，磷脂，核酸，酶，维生素钾（钾（K K）促进光合，激活许多酶促进光合，激活许多酶镁（镁（MgMg）硫（）硫（S S）影响酶的活性和方向及

38、新陈代谢影响酶的活性和方向及新陈代谢大量元素的主要生理功能：大量元素的主要生理功能：微量元素微量元素 浓度为浓度为1010-5-51010-7-7mol/L,mol/L,稍高发生毒害，稍高发生毒害， 缺少表现缺素症状。缺少表现缺素症状。铁（铁（FeFe）维持叶绿体功能即叶绿体的氧化还原过程维持叶绿体功能即叶绿体的氧化还原过程铜（铜（CuCu）可促进离体根的生长可促进离体根的生长锰（锰（MnMn）锌（）锌（ZnZn）钼（）钼（M Mo o）酶的活性组分酶的活性组分铁往往以无机铁供应，如硫酸亚铁，为了防止沉淀，目前皆铁往往以无机铁供应，如硫酸亚铁，为了防止沉淀，目前皆用螯合铁，用螯合铁，即硫酸亚铁

39、（即硫酸亚铁（FeSOFeSO4 4）加乙二胺四乙酸钠）加乙二胺四乙酸钠（NaNa2 2EDTAEDTA）配）配成。成。微量元素的主要生理功能：微量元素的主要生理功能：2 2有机物质有机物质 主要有两类：主要有两类：一是作为有机营养物质，为植物细胞提供碳、氢、一是作为有机营养物质，为植物细胞提供碳、氢、氧、氮等必要元素氧、氮等必要元素，如糖类（蔗糖、葡萄糖和果，如糖类（蔗糖、葡萄糖和果糖）、氨基酸及其酰胺类（如甘氨酸、天门冬酰胺、糖）、氨基酸及其酰胺类（如甘氨酸、天门冬酰胺、谷氨酰胺）谷氨酰胺）另一类是一些生理活性物质，在植物代谢中起一定另一类是一些生理活性物质，在植物代谢中起一定作用，作用，

40、如如B B族维生素；盐酸硫胺素族维生素；盐酸硫胺素（V VB B1 1）、）、盐酸盐酸吡哆吡哆醇（醇（V VB B6 6）、烟酸）、烟酸(VB(VB3 3) )等，浓度一般在等，浓度一般在0.1-1.0 mg/L,0.1-1.0 mg/L,还包括还包括生物素生物素(VH)(VH)、抗坏血酸（抗坏血酸（VCVC）、）、肌醇、单核肌醇、单核苷苷酸及其碱基（如腺嘌呤等）。酸及其碱基（如腺嘌呤等）。3 3植物生长刺激物质植物生长刺激物质主要加入植物天然的五类激素物质及其人工主要加入植物天然的五类激素物质及其人工合成的合成的类似生长激素物质。类似生长激素物质。生长素类：生长素类：吲哚乙酸吲哚乙酸（IAA

41、IAA）、萘乙酸、萘乙酸(NAA)(NAA)、 2 2，4-4-二氯苯乙酸二氯苯乙酸(2,4-D)(2,4-D)、 吲哚丁酸吲哚丁酸(IBA)(IBA)吲哚乙酸吲哚乙酸（IAA）活性较低，高温高压易降解。活性较低，高温高压易降解。萘乙酸萘乙酸(NAA)、吲哚丁酸、吲哚丁酸(IBA)活性较强，用于诱导生活性较强，用于诱导生根，与细胞分裂素配合诱导芽。根，与细胞分裂素配合诱导芽。2，4-二氯苯二氯苯氯氯乙酸乙酸(2,4-D)、诱导愈伤组织的形成，诱导愈伤组织的形成，低浓度时有利于诱导胚状体的分化形成。低浓度时有利于诱导胚状体的分化形成。配制：生长素溶于配制：生长素溶于95%的酒精或的酒精或0.1m

42、ol/L的的NaOH中。中。细胞分裂素：细胞分裂素：激动素（激动素（KT)、6-苄基腺嘌呤苄基腺嘌呤(6-BA)、玉米素玉米素(ZT)6-6-苄基腺嘌呤激动素苄基腺嘌呤激动素（6-BA6-BA）, ,激动素（呋喃氨基嘌呤，激动素（呋喃氨基嘌呤，KTKT）是常用的。）是常用的。促进细胞的分裂和诱导不定芽的分化。促进细胞的分裂和诱导不定芽的分化。配制：细胞分裂素溶于配制：细胞分裂素溶于0.5mol/L0.5mol/L或或1mol/L1mol/L的盐酸。的盐酸。赤霉素类中赤霉素类中常用的：常用的： 赤霉素赤霉素(GA3)。刺激器官生长，。刺激器官生长，抑制器官发生，在组织培养中应用较少。抑制器官发生

43、，在组织培养中应用较少。配制：赤霉素溶于水后不稳定，溶于配制：赤霉素溶于水后不稳定，溶于95%的酒精，使用前过滤的酒精，使用前过滤4.4.其他附加成分其他附加成分活性炭活性炭 吸附外植体释放的有害物质，如酚类，因吸附外植体释放的有害物质，如酚类，因吸附不具有选择性，也吸附有益物质，使用时要慎吸附不具有选择性，也吸附有益物质，使用时要慎重，用量控制在重，用量控制在0.5%0.5%3%3%。天然提取物天然提取物 常用的有常用的有10%10%20%20%的椰乳（的椰乳（CMCM） 100100200mg/L200mg/L的水解酪蛋白（的水解酪蛋白（CHCH） 0.01%0.01%0.05%0.05%

44、的酵母提取物（的酵母提取物（YEYE） 番茄汁（番茄汁（TJTJ）及玉米胚乳等）及玉米胚乳等抗生物质抗生物质(antibiotic)(antibiotic) 包括青霉素、链霉素、庆包括青霉素、链霉素、庆大霉素等，用量在大霉素等，用量在5 5- -20mg/L20mg/L之间。添加抗生物质可之间。添加抗生物质可防止菌类污染，减少培养中材料的损失防止菌类污染，减少培养中材料的损失。5.5.琼脂琼脂(agar)(agar)海藻中提取的多糖类物质，仅溶于水，海藻中提取的多糖类物质，仅溶于水，温度低于温度低于4040度度时凝固成凝胶状时凝固成凝胶状。起固化培养基的作用。起固化培养基的作用。琼脂粉的琼脂粉

45、的用量在用量在6 6- -10g10gL L之间若浓度太高，培养基就之间若浓度太高，培养基就会变得很硬，营养物质难以扩散到培养的组织中去。会变得很硬，营养物质难以扩散到培养的组织中去。若浓度过低，凝固性不好。若浓度过低，凝固性不好。一般琼脂以颜色浅、透明度好、洁净的为上品。一般琼脂以颜色浅、透明度好、洁净的为上品。凝固凝固能力下降的因素能力下降的因素 长时间长时间的高温的高温 过酸过碱过酸过碱 时间过久，琼脂变褐时间过久，琼脂变褐6. 6. 水水植物生长所需的各种营养物质植物生长所需的各种营养物质均需溶于水均需溶于水才能被细才能被细胞吸收。胞吸收。培养目的不同要求不同纯度的水培养目的不同要求不

46、同纯度的水 蒸馏水蒸馏水 大多数组织培养大多数组织培养 去离子水去离子水 原生质体培养等要求较高的培养原生质体培养等要求较高的培养 自来水自来水 大规模生产的组培化工厂大规模生产的组培化工厂( (二二) )培养基的种类，配方及特点培养基的种类，配方及特点1.1.常用培养基的种类及配方常用培养基的种类及配方根据营养水平根据营养水平含无机营养，有机化合物，糖和水含无机营养，有机化合物，糖和水培养基培养基基本培养基：基本培养基：完全培养基：完全培养基：基本培养基基本培养基+ +植物生长调节物质植物生长调节物质 + +其他有机附加物其他有机附加物常用的常用的MS,MS,改改MS,WhiteMS,Whi

47、te, ,改改White,Nitsch,N6,B5White,Nitsch,N6,B5等等2.2.常用培养基的特点常用培养基的特点高盐成分培养基高盐成分培养基 MS,LS,ERMS,LS,ER等，等，MSMS的钾，铵，硝酸盐的钾，铵，硝酸盐的用量较大，微量元素齐全，用于的用量较大，微量元素齐全，用于愈伤组织，或用于胚、愈伤组织，或用于胚、茎段、茎尖及花药培养茎段、茎尖及花药培养。硝酸钾含量较高的培养基硝酸钾含量较高的培养基 B5,N6,SHB5,N6,SH等等 B5 B5 适合于南洋杉，葡萄，豆科和十字花科适合于南洋杉，葡萄，豆科和十字花科 N6 N6 单子叶植物，单子叶植物，禾谷类植物的花药

48、和花粉培养禾谷类植物的花药和花粉培养 SH SH 单子叶植物及双子叶植物的培养单子叶植物及双子叶植物的培养中盐成分培养基中盐成分培养基 尼许尼许 H H，NitschNitsch, Miller, , Miller, 培养基等培养基等适合大豆愈伤组织培养和花药培养，适合大豆愈伤组织培养和花药培养，更适合木本植物的组织培养更适合木本植物的组织培养 低盐成分培养基低盐成分培养基 怀特怀特 White, White, KnopKnop培养基，适合生根培养培养基，适合生根培养( (三三) )培养基的配制培养基的配制1.1.制备母液制备母液 为了避免每次配制培养基都要对几十种化学药品进为了避免每次配制培

49、养基都要对几十种化学药品进行称量，应该将培养基中的各种成分，行称量，应该将培养基中的各种成分，按原量按原量1010倍、倍、100100倍或倍或10001000倍称量，配成浓缩液倍称量，配成浓缩液，这种浓缩液叫，这种浓缩液叫做母液。这样，每次配制培养基时，取其总量的做母液。这样，每次配制培养基时，取其总量的1/101/10、1/1001/100、1/10001/1000，加以稀释，即成培养液。，加以稀释，即成培养液。培养液中各类物质制备母液的方法说明如下培养液中各类物质制备母液的方法说明如下: : (1)(1)大量元素。大量元素。大量元素包括硝酸铵等用量较大的几大量元素包括硝酸铵等用量较大的几种

50、化合物。制备时，按表中排列的顺序，以其种化合物。制备时，按表中排列的顺序，以其1010倍倍或或2020倍的用量，分别称出并进行溶解，以后按顺序倍的用量，分别称出并进行溶解，以后按顺序混在一起，最后加蒸馏水，使其总量达到混在一起，最后加蒸馏水，使其总量达到1 1升，此升，此即大量元素母液。即大量元素母液。 （2)2)微量元素。微量元素。因用量少，为称量方便和精确起见，因用量少，为称量方便和精确起见，应配成应配成100100倍或倍或10001000倍的母液。配制时，每种化合物倍的母液。配制时，每种化合物的量加大的量加大100100倍或倍或10001000倍，逐次溶解并混在一起，制倍，逐次溶解并混在

51、一起，制成微量元素母液。成微量元素母液。(3)(3)铁盐。铁盐。铁盐要单独配制。由硫酸亚铁铁盐要单独配制。由硫酸亚铁(FeSO47H2O)(FeSO47H2O) 5.575.57克和乙二胺四乙酸二钠克和乙二胺四乙酸二钠(NaEDTA)7.45(NaEDTA)7.45克溶于克溶于1 1升升水中配成。水中配成。常需调节常需调节pHpH值到值到5.5,5.5,平置于棕色瓶中避光保平置于棕色瓶中避光保存。存。每配每配1 1升培养基，加铁盐升培养基，加铁盐5 5毫升。毫升。(4)(4)有机物质。有机物质。主要指氨基酸和维生素类物质。应配成主要指氨基酸和维生素类物质。应配成100100倍或倍或100010

52、00倍的母液。配制时，每种倍的母液。配制时，每种有机有机物的量加大物的量加大100100倍或倍或10001000倍，逐次溶解，制倍，逐次溶解，制成有机母液。成有机母液。(5)(5)植物激素。植物激素。最常用的有生长素和细胞分裂素。这类物质使用浓最常用的有生长素和细胞分裂素。这类物质使用浓度很低，一般为度很低，一般为0.010.011010毫克毫克/ /升。可按用量的升。可按用量的100100倍倍或或10001000倍配制母液，配制时要单个称量，分别贮藏。倍配制母液，配制时要单个称量，分别贮藏。配制植物生长素时，应先按要求浓度称好药品，置配制植物生长素时，应先按要求浓度称好药品，置于小烧杯或容量瓶中，用于小烧杯或容