HPLC手性固定相法在体内药物分析中的应用（课堂PPT）

1、1HPLCHPLC手性固定相法手性固定相法在体内药物分析中的应用在体内药物分析中的应用2手性药物（手性药物（chiral drugchiral drug）药物分子结构中引入手性中心后，得到的一对互为实物药物分子结构中引入手性中心后，得到的一对互为实物与镜像的对映异构体。与镜像的对映异构体。这些对映异构体的理化性质基本相似，仅仅是旋光性有这些对映异构体的理化性质基本相似，仅仅是旋光性有所差别，分别被命名为所差别，分别被命名为R-R-型（右旋）或型（右旋）或S-S-型（左旋）、型（左旋）、外消旋。外消旋。3Mirror ImageMirror Image4OHCOOHHCH3OHCOOHHCH35

2、6手性药物药效学差异手性药物药效学差异两种对映体具有相同或相近的药理活性两种对映体具有相同或相近的药理活性 异丙嗪：抗组胺；普罗帕酮：抗心律失常异丙嗪：抗组胺；普罗帕酮：抗心律失常。一种对映体具有药理活性，另一种活性弱或无活性一种对映体具有药理活性，另一种活性弱或无活性 非甾体抗炎药物的非甾体抗炎药物的-芳基丙酸类化合物，如萘普生、布洛芬等。芳基丙酸类化合物，如萘普生、布洛芬等。两种对映体药理活性相似，但反应强度不同两种对映体药理活性相似，但反应强度不同 代表药物：抗癌药环磷酰胺，代表药物：抗癌药环磷酰胺， S-对映体活性是对映体活性是R-对映体的对映体的2倍。倍。 两种对映体具有不同的药理活

3、性两种对映体具有不同的药理活性 作用于不同的靶器官、组织而呈现不同的作用模式。作用于不同的靶器官、组织而呈现不同的作用模式。 代表药物：索他洛尔，代表药物：索他洛尔， S-对映体对映体阻断作用阻断作用 R-对映体对映体抗心律失常作用抗心律失常作用7手性药物药效学差异手性药物药效学差异两种对映体的作用相反两种对映体的作用相反 如：异丙肾上腺素（如：异丙肾上腺素（ 1-受体激动剂）受体激动剂） R-(-)-：受体激动作用：受体激动作用 S-(+)-：受体拮抗作用：受体拮抗作用一种对映体具有药理活性，另一种具有毒性作用一种对映体具有药理活性，另一种具有毒性作用 氯胺酮为中枢性麻醉药物，只有氯胺酮为中

4、枢性麻醉药物，只有(S)-(+)-对映体才具有麻醉作用，而对映体才具有麻醉作用，而(R)-(-)-对映对映体则产生中枢兴奋作用。体则产生中枢兴奋作用。 镇静药沙度利胺（反应停），镇静药沙度利胺（反应停）， (R)-对映体有镇静作用，对映体有镇静作用， (S)-对映体及其代谢产对映体及其代谢产物有严重的胚胎毒性和致畸作用。物有严重的胚胎毒性和致畸作用。对映体的作用互补性对映体的作用互补性 左旋多巴酚丁胺左旋多巴酚丁胺 -受体激动剂作用，对受体激动剂作用，对-受体的作用弱受体的作用弱 右旋体为右旋体为-受体激动受体激动剂，而对剂，而对-受体的作用弱受体的作用弱 外消旋体给药能增加心肌收缩力，但不增

5、加心率和血压。外消旋体给药能增加心肌收缩力，但不增加心率和血压。不同的作用靶点表现不同的特性不同的作用靶点表现不同的特性 药物作用于不同的组织（靶点、受体）呈现不同的特性，这类药物往往是多药物作用于不同的组织（靶点、受体）呈现不同的特性，这类药物往往是多功能的，作用是多方面的。功能的，作用是多方面的。8反应停事件反应停事件9手性药物的药代动力学手性药物的药代动力学| 吸收吸收 被动吸收：手性因素无影响。被动吸收：手性因素无影响。 主动转运和易化扩散：可能发生对映体间的竞争性相互作用和吸收的变化主动转运和易化扩散：可能发生对映体间的竞争性相互作用和吸收的变化| 分布分布 手性药物对映体竞争性的与

6、血浆蛋白、酶或受体结合，都可引起对映体间相手性药物对映体竞争性的与血浆蛋白、酶或受体结合，都可引起对映体间相互作用及其在分布上的改变。互作用及其在分布上的改变。| 代谢代谢 相互抑制作用：对映体竞争同一代谢酶，会发生对映体间的相互抑制。相互抑制作用：对映体竞争同一代谢酶，会发生对映体间的相互抑制。 单向抑制作用：如果一个对映体是另一个对映体的代谢抑制剂，则会发生单单向抑制作用：如果一个对映体是另一个对映体的代谢抑制剂，则会发生单向抑制作用。向抑制作用。| 排泄排泄 肾脏排泄的立体选择性主要表现在肾小管分泌、主动转运和肾代谢过程，导肾脏排泄的立体选择性主要表现在肾小管分泌、主动转运和肾代谢过程，

7、导致对映体间发生相互作用。致对映体间发生相互作用。101 1992992年美国食品与药品监督管理局（年美国食品与药品监督管理局（FDAFDA）提出）提出发展单一对映体生产计划和对映体药物纯度的发展单一对映体生产计划和对映体药物纯度的鉴定规定后，如何能快速而准确的分离和测定鉴定规定后，如何能快速而准确的分离和测定手性药物已成为医药界关注的重大课题。手性药物已成为医药界关注的重大课题。11手性药物拆分方法 利用物理性质利用物理性质溶解度、吸附力等的差异，如：结晶溶解度、吸附力等的差异，如：结晶法、法、色谱法色谱法等；等； 利用反应速度差异的动力学拆分法；利用反应速度差异的动力学拆分法； 利用酶的高

8、度特异性的催化反应的酶拆分法利用酶的高度特异性的催化反应的酶拆分法12手性药物色谱法拆分超临界流体色谱法（超临界流体色谱法（SFC）气相色谱法（气相色谱法（GC）高效液相色谱法（高效液相色谱法（HPLC）高效毛细管色谱法（高效毛细管色谱法（HPCE）13手性手性HPLCHPLC法法 间接法（间接法（CDR） 柱前衍生化法，手性试剂衍生化法（CDR），将具有高光学纯度的手性衍生化试剂（CDR）反应引入第二个手性中心，形成非对映异构体，可在普通固定相上实现分离测定。 直接法直接法 手性选择剂键合到固定相表面或加入流动相中，药物对映体通过与手性选择剂形成的暂时的非对映络合物的能量差或稳定性不同而达到

9、分离的目的。 手性固定相法（CSP） 手性流动相法（CMPA）14手性柱的分类和应用举例手性柱的分类和应用举例| -氢键型键合固定柱氢键型键合固定柱 将有光学活性的有机小分子通过一定间隔基键合到硅胶柱上将有光学活性的有机小分子通过一定间隔基键合到硅胶柱上。以以Pirkle型应用最为广泛。型应用最为广泛。分离原理在与溶质间的分离原理在与溶质间的n-n相互作用，氢键作用和偶极相互作用，氢键作用和偶极-偶极作用。偶极作用。Pirkle型手性固定相通过链烃基将手性有机小分子链接到硅胶载体上制得。含型手性固定相通过链烃基将手性有机小分子链接到硅胶载体上制得。含端羧基或异氰酸酯基的手性基团的化合物与氨基键

10、合硅胶进行缩合反应分端羧基或异氰酸酯基的手性基团的化合物与氨基键合硅胶进行缩合反应分别形成含酰胺型或脲型结构的别形成含酰胺型或脲型结构的手性固定相。手性固定相。15手性柱的分类和应用举例手性柱的分类和应用举例|-氢键型键合固定柱氢键型键合固定柱 例：韩海等4用Pirkle型 Sumichiral OA手性柱对体内D-酸性氨基酸进行了拆分测定，并建立了快速分系统，用本系统对免疫功能低下的老年病小鼠动物模型快速老化小鼠亚系1 (SAMP1) 进行分析发现了其胸腺和脾脏中D-天门冬氨酸的含量较对照组同龄抗快速老化小鼠亚系1(SAMR1)有显著升高趋势。16手性柱的分类和应用举例手性柱的分类和应用举例

11、| 含肽或蛋白质键合相含肽或蛋白质键合相 将蛋白质、酶和抗体等生物大分子键合到硅胶，可用于分将蛋白质、酶和抗体等生物大分子键合到硅胶，可用于分离酸类、胺类、离酸类、胺类、-氨基酸类药物。氨基酸类药物。例：用T1-酸糖蛋白(T1-acidglycoprotein, AGP)Chiral-AGP 柱 顾景凯等对口服给药后兔血浆中新抗炎镇痛剂SFZ-47 ()-3H-1, 2-二氢-2-( 4-甲基苯胺基)-甲基-1-吡咯里嗪酮对映异构体进行了分离测定，两种异构体得到较好分离，血浆中(-)-SFZ-47对映体浓度始终高于(+)-SFZ-47, 说明(+)-SFZ-47体内优先消除。 王晓琳 液相色谱

12、法对注射及口服布洛芬精氨酸之后布洛芬对映体进行分离。 房晶等测定了苯磺酸左旋氨氯地平血药浓度。17手性柱的分类和应用举例手性柱的分类和应用举例| 含肽或蛋白质键合相含肽或蛋白质键合相 CHIROBIOTIC V 手性柱手性柱糖肽类抗生素（万古霉素）键合在硅胶上，由于万古霉素糖肽类抗生素（万古霉素）键合在硅胶上，由于万古霉素结构特点使柱子具有手性的氢键结合部位、肽键结合部结构特点使柱子具有手性的氢键结合部位、肽键结合部位和碳水化合物结合部位，可与被分离物质发生静电作位和碳水化合物结合部位，可与被分离物质发生静电作用、包合作用、偶极叠加作用、电荷转移作用、形成氢用、包合作用、偶极叠加作用、电荷转移

13、作用、形成氢键和立体排斥等作用，可采取正相、反相和新极性有机键和立体排斥等作用，可采取正相、反相和新极性有机相分离，对胺类、中性酰胺、脂类有很好的立体选择性相分离，对胺类、中性酰胺、脂类有很好的立体选择性例：有报道9-11用于血浆中布洛芬,卡维地洛对映体,氯胺酮对映体等分离测定。18手性柱的分类和应用举例手性柱的分类和应用举例| 含碳水化合物的手性固定相含碳水化合物的手性固定相 包括醋酸纤维素、其他纤包括醋酸纤维素、其他纤维素衍生物（如环糊精、冠醚）和直链淀粉等。维素衍生物（如环糊精、冠醚）和直链淀粉等。纤维素纤维素-三苯甲酸酯涂敷在氨丙基硅烷化硅胶上便得到三苯甲酸酯涂敷在氨丙基硅烷化硅胶上便

14、得到CTB固定相固定相19手性柱的分类和应用举例手性柱的分类和应用举例| 含碳水化合物的手性固定相含碳水化合物的手性固定相 微晶纤维素微晶纤维素+异氰酸苯酯异氰酸苯酯纤维素纤维素-三苯基氨基甲酸酯三苯基氨基甲酸酯三苯基氨基甲酸酯涂敷在氨基键合的硅胶上三苯基氨基甲酸酯涂敷在氨基键合的硅胶上CTPC20手性柱的分类和应用举例手性柱的分类和应用举例| 含碳水化合物的手性固定相含碳水化合物的手性固定相 微晶纤维素微晶纤维素+3，5-二甲基苯基异氰酸酯二甲基苯基异氰酸酯纤维素纤维素-三三3 5-二甲基苯基氨基二甲基苯基氨基甲酸酯甲酸酯纤维素纤维素-三三3 5-二甲基苯基氨基甲酸酯二甲基苯基氨基甲酸酯15

15、%的量涂敷在氨丙基硅胶上的量涂敷在氨丙基硅胶上CDMPC-CSP21手性柱的分类和应用举例手性柱的分类和应用举例| 含碳水化合物的手性固定相含碳水化合物的手性固定相 -环糊精（环糊精（CD)手性固定相，手性固定相，CD与硅胶上不水解的硅烷链与硅胶上不水解的硅烷链相连，相连，CD分子呈锥筒状洞穴，大小有分子呈锥筒状洞穴，大小有CD环大小决定，洞环大小决定，洞穴内为疏水性缩醛氧原子，洞穴外沿为亲水性羟基，对穴内为疏水性缩醛氧原子，洞穴外沿为亲水性羟基，对映体以能否进入洞穴形成包合物及紧密程度，产生不同映体以能否进入洞穴形成包合物及紧密程度，产生不同的保留时间从而得到拆分。的保留时间从而得到拆分。2

16、2手性柱的分类和应用举例手性柱的分类和应用举例| 含碳水化合物的手性固定相含碳水化合物的手性固定相 举例举例周婕等用12新型键合直链纤维素衍生化合物手性固定相Chiralpak IC色谱柱(50 mm4.6 mm,5 m)，流动相正己烷异丙醇-二乙胺(80:20:0.1), 流速0.8 mL/min，检测波长273 nm，柱温25 ,血浆中西沙必利对映体能够完全分离，分离度1.65，其血浆提取回收率达87%，线性范围为10160 g/mL，最低检测限为5 g /mL，RSD4.0%。张亮等14以Chiralpak AD-RH(4.6 mm150 mm,5 m)色谱柱，10 mmol/L硼砂缓冲

17、液(0.1%三乙胺，pH 9.0)-乙腈-乙醇(50:25:25) 为流动相分离普萘洛尔对映体，检测波长为229 nm,研究普萘洛尔对映体及其外消旋体经大鼠皮肤渗透的对映体选择性。结果萘洛尔对映体在21 min 内完全分离(分离度Rf =2.2),在3200 g/mL内线性关系良好。Chiralpak AD 还用于建立了血浆中奥美拉唑对映体的分析方法15。23手性柱的分类和应用举例手性柱的分类和应用举例| 配体交换相配体交换相 将手性配体通过各种间隔基与硅胶键合，属亲水性固定相。将手性配体通过各种间隔基与硅胶键合，属亲水性固定相。通过一个金属离子与一个配体分子和一个对映体溶质分通过一个金属离子

18、与一个配体分子和一个对映体溶质分子结合成可逆的非对映体而达到分离。子结合成可逆的非对映体而达到分离。例：苏丹等16用Phenomenex chirex 3126 配体色谱柱，对肌肽对映体进行了拆分。24手性柱的分类和应用举例手性柱的分类和应用举例| 其他类型的手性柱其他类型的手性柱 分子印迹聚合物手性固定相（分子印迹聚合物手性固定相（MIP-CSP） 分子印迹聚合物分子印迹聚合物(MIPs)通过分子印迹技术合成的对特定目标分子（模板通过分子印迹技术合成的对特定目标分子（模板分子）及其结构类似物具有特异性识别和选择性吸附的分子）及其结构类似物具有特异性识别和选择性吸附的聚合物。聚合物。MIPs

19、发挥特异性识别作用的关键是其具有能与发挥特异性识别作用的关键是其具有能与模板分子及类似物的官能团相结合的特殊空穴模板分子及类似物的官能团相结合的特殊空穴17。MIP-CSP 依靠拥有对印迹单对映体立体结构具有记忆功依靠拥有对印迹单对映体立体结构具有记忆功能的结合位点来进行手性识别的，利用与不同对映体吸能的结合位点来进行手性识别的，利用与不同对映体吸附作用的差异实现拆分。附作用的差异实现拆分。 核酸类手性固定相核酸类手性固定相 寡糖类的手性固定相等寡糖类的手性固定相等25手性手性柱柱( (商品柱）商品柱） ChiralcelChiralcel柱类型与应用柱类型与应用 手性聚合物固定相手性聚合物固

20、定相Chiralcel柱类型与应用柱类型与应用柱型号柱型号Chiralcel OAChiralcel OBChiralcel OCChiralcel ODChiralcel OEChiralcel OFChiralcel OGChiralcel OJChiralcel OKChiralcel ADChiralcel ASChiralcel OT(+)Chiralcel O(+)聚三苯甲基乙丁烯酸酯酯，酰胺，含磷化合物，芳香化合物酯，酰胺，含磷化合物，芳香化合物聚吡啶二苯甲基乙丁烯酸酯酯，酰胺，含磷化合物酯，酰胺，含磷化合物淀粉三（3，5-二甲苯基氨基甲酸酯）生物碱，胺，莨菪碱，受体拮抗剂生物碱

21、，胺，莨菪碱，受体拮抗剂淀粉三（S）-1-苯乙基氨基甲酸酯）生物碱，胺，莨菪碱生物碱，胺，莨菪碱纤维素三（对甲苯基甲酸酯）甲基芳基酯，甲氧基芳基酯甲基芳基酯，甲氧基芳基酯纤维素三肉桂酸酯芳香化合物芳香化合物纤维素三（对氯苯基氨基甲酸酯）内酰胺，生物碱，二氢吡啶内酰胺，生物碱，二氢吡啶纤维素三（对甲苯基氨基甲酸酯）内酰胺，生物碱内酰胺，生物碱纤维素（3，5-二甲苯基氨基甲酸酯）生物碱，胺，莨菪碱，受体拮抗剂生物碱，胺，莨菪碱，受体拮抗剂纤维素二苄醚芳香化合物芳香化合物纤维素三苯甲酸酯脂肪酸族和芳香族小分子化合物脂肪酸族和芳香族小分子化合物纤维素三苯氨基甲酸酯环戊烯酮类环戊烯酮类固定相，官能团固定

22、相，官能团拆分化合物类型拆分化合物类型纤维素三乙酯脂肪酸族小分子化合物脂肪酸族小分子化合物26手性柱（商品柱）手性柱（商品柱） Astec CYCLOBOND系列系列(键合环糊精手性柱键合环糊精手性柱),手性、非手性选择性，可与LC-MS兼容； Astec CHIROBIOTIC系列系列(大环糖肽型手性柱大环糖肽型手性柱),可用于含水和非水流动相，特别适用于极性和可电离化合物的分离； Astec Cellulose DMP系列系列(纤维素型手性柱纤维素型手性柱),适用于正相、极性有机和SFC模式； Astec P-CAP和和P-CAP-DP系列系列(多环胺聚合物手性柱多环胺聚合物手性柱),溶剂

23、范围广； Astec CLC (Copper Ligand Exchange) 系列系列(配位交换型手性配位交换型手性柱柱),用于分析非芳香有机酸、氨基酸、胺类等物质27自制柱用于手性药物体内分析自制柱用于手性药物体内分析举例举例周仁丹等20采用对硝基苯氨基甲酸酯衍生化6-叠氮基-环糊精，将衍生化的配体与含炔键的SBA-15 硅胶进行点击反应( Click chemistry) ，合成新型对硝基苯氨基甲酸酯化-环糊精键合SBA-15 硅胶手性固定相( NPCSP) 。在极性有机溶剂模式下，成功实现了人血浆中-受体阻滞剂普萘洛尔对映体的快速手性分离。杨沛等21通过在不同粒径的氨丙基硅烷化的硅胶(

24、APS)上涂敷具有手性识别的纤维素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)(CDMPC),制备出了纤维素衍生物类的手性固定相(CSP),采用高效液相色谱法在合成的CSP上进行了-受体阻滞剂(普萘洛尔、美托洛尔、阿替洛尔)的手性拆分和对映体的含量测定并测定了血浆中普萘洛尔。罗迎彬等22用含不同取代基的苯甲酰氯修饰壳聚糖4 种新的衍生物，以N，N-二甲基甲酰胺为溶剂，将壳聚糖衍生物涂敷于大孔的3-氨丙基硅胶上，制得相应的手性固定相，结果表明以上固定相均有较好的对映体选择性。28其他其他|非手性非手性-手性手性HPLC法，法，先用非手性HPLC法使样品中内源性杂质与待测物分离, 收集对映体流分，再用手性HPLC法对对映