第十七章 转基因技术

1、 第第17章章 转基因技术与作物育种转基因技术与作物育种l作物转基因育种作物转基因育种：根据育种目标，从供体生物：根据育种目标，从供体生物中分离目的基因，经中分离目的基因，经DNADNA重组与遗传转化或直接重组与遗传转化或直接运载进入受体作物，经过筛选获得稳定表达的运载进入受体作物，经过筛选获得稳定表达的遗传工程体，在经过田间试验与大田选择育成遗传工程体，在经过田间试验与大田选择育成转基因新品种或种质资源。转基因新品种或种质资源。 转基因作物（GMC，genetically modified crops） 第第17章章 转基因技术与作物育种转基因技术与作物育种经全国基因工程安全委员会批准商品化

2、生产的作物已有： 我国自行研制开发的抗虫转基因棉花（转Bt及Bt+CpTI双价抗 虫棉）；2004年种植转基因棉花370万公顷，占棉花种植面积的50% 美国Monsanto公司开发的Bt抗虫棉； 延迟成熟期的转基因番茄； 抗黄瓜花叶病毒(CMV)转基因番茄； 抗CMV转基因甜椒； 转查尔酮合酶（CHS）反义RNA基因矮牵牛。 第第17章章 转基因技术与作物育种转基因技术与作物育种由中国农科院生物工程中心开发的由中国农科院生物工程中心开发的BtBt棉对棉铃虫有显著的抗性。棉对棉铃虫有显著的抗性。与对照相比减少农药用量与对照相比减少农药用量8080，并减少用工，并减少用工150150个个/hm/h

3、m2 2，以上两，以上两者可使每公顷节省者可使每公顷节省15001500元，元，BtBt转基因棉种深受棉农的欢迎转基因棉种深受棉农的欢迎。 第第17章章 转基因技术与作物育种转基因技术与作物育种抗虫棉： 转入抗虫基因后，该基因在植株体内表达一种毒素，进入昆虫体内后，破坏其消化系统或其他组织导致其死亡。 第第17章章 转基因技术与作物育种转基因技术与作物育种 第第17章章 转基因技术与作物育种转基因技术与作物育种转基因西红柿具有更长的储藏期 第第17章章 转基因技术与作物育种转基因技术与作物育种l与常规育种技术相比，转基因育种具与常规育种技术相比，转基因育种具有很大优势：有很大优势： a.可以利

4、用的基因资源大大拓宽。 b.为培育优良品种提供了崭新的育种途径。 c.可以对植物的目标性状进行定向变异和定向选择。 d.可以大大提高选择效率，加速育种进程。 第第17章章 转基因技术与作物育种转基因技术与作物育种第一节 作物的转基因技术 第第17章章 转基因技术与作物育种转基因技术与作物育种一、转基因技术的发展现状（一）国际转基因植物研究与现状全球转基因作物种植面积比较全球转基因作物种植面积比较 （单位：万公顷）（单位：万公顷）作物 1996年 1997年 1997年/1996年 大豆玉米烟草棉花油菜合计 50301008012280 5103201601401201250 10.210.71

5、.61.8104.5 第第17章章 转基因技术与作物育种转基因技术与作物育种自从1983年第一株转基因烟草获得以来，至今已有120种植物转基因获得成功。1996年全球大面积种植，并不断扩大。国际农业生物技术应用服务局（ISAAA）统计结果一、转基因技术的发展现状（一）国际转基因植物研究与现状 第第17章章 转基因技术与作物育种转基因技术与作物育种全球转基因作物种植情况 第第17章章 转基因技术与作物育种转基因技术与作物育种(二) 我国转基因作物研究与利用概况 我国是世界上第一个商品化种植转基因作物的国家。自行培育的双价转基因烟草的抗病虫性达到60，产量比对照增加15，产值增加20，1992年每

6、亩增收200元，遗憾的是由于市场的原因现已不推广。 到1999年我国已批准中试的转基因作物有48项：包括水稻、小麦、玉米、番茄、白菜、番木瓜、甜瓜、花生、棉花、烟草、广藿香等11种作物；主要目标性状是抗虫、抗病、耐盐、抗冻、耐储藏和抗衰老等。 已批准环境释放的有49个品种，涉及水稻、玉米、大豆、马铃薯、番茄、甜椒、线辣椒、棉花、杨树、烟草等10种作物。 第第17章章 转基因技术与作物育种转基因技术与作物育种 第第17章章 转基因技术与作物育种转基因技术与作物育种二、转基因育种的程序基本过程目的基因或DNA的获取含有目的基因或者DNA的重组质粒的构建受体材料的选择和再生系统的建立转基因方法的确定

7、和外源基因的转化转化体的筛选和鉴定转基因植株的育种利用 第第17章章 转基因技术与作物育种转基因技术与作物育种( (一一) )目的基因的获得目的基因的获得 根据获得基因的途径主要可以分为两大类：根据获得基因的途径主要可以分为两大类： 根据基因表达的产物根据基因表达的产物蛋白进行基因克隆；蛋白进行基因克隆； 从基因组从基因组DNADNA或或mRNAmRNA序列克隆基因。序列克隆基因。1.根据基因表达的产物蛋白进行基因克隆 主要步骤如下：利用这种方法人类首次人工合成了胰岛素基因。虽然在早期采用这种方式已经成功地克隆了许多基因。局限性：兼并密码子 效率低 未知基因及产物分离蛋白质明确氨基酸序列推导核

8、苷酸序列人工合成 第第17章章 转基因技术与作物育种转基因技术与作物育种2.2.从基因组从基因组DNADNA或或mRNAmRNA序列克隆基因序列克隆基因 (1)(1)同源序列法同源序列法 (Homology Based Candidate Gene Method) (Homology Based Candidate Gene Method) 根据基因家族成员所编码的蛋白质结构中具有保守氨基酸序列的特根据基因家族成员所编码的蛋白质结构中具有保守氨基酸序列的特点克隆基因家族未知成员。点克隆基因家族未知成员。氨基酸序列比较设计简并引物PCR扩增文库筛选/RACE 第第17章章 转基因技术与作物育种转

9、基因技术与作物育种 (2)(2)表达序列标签表达序列标签ESTEST是指能够特异性标记某个基因的部分序列，通常是指能够特异性标记某个基因的部分序列，通常包含了该基因足够的结构信息区，可以与其它基因相区分。主要是通过包含了该基因足够的结构信息区，可以与其它基因相区分。主要是通过cDNAcDNA的途径获得。的途径获得。 获得EST的途径: 大规模cDNA文库测序 各种mRNA水平的分析手段mRNAcDNA反转录酶cDNA文库PCR差异显示抑制消减杂交ESTRACE/文库筛选dbESTGenBank 第第17章章 转基因技术与作物育种转基因技术与作物育种(3)根据连锁图谱克隆目的基因 图位克隆技术(

10、Map-based cloning) 第第17章章 转基因技术与作物育种转基因技术与作物育种染色体步行(chromosome walking ）MrakerTarget gene 第第17章章 转基因技术与作物育种转基因技术与作物育种(4)(4)转座子标签法转座子标签法 转座子是染色体上一段可复制、移动的转座子是染色体上一段可复制、移动的 DNADNA片片段。当转座子插入到某个功能基因内部时，就会引起该基因的失活，段。当转座子插入到某个功能基因内部时，就会引起该基因的失活，并诱导产生突变型；当转座子再次转座或切离这一位点时，失活基因并诱导产生突变型；当转座子再次转座或切离这一位点时，失活基因的

11、功能又可得到恢复。的功能又可得到恢复。目前应用最为广泛的转座子系统是Ac/Ds玉米转座子系统。插入突变体筛选突变DNA文库，PCR，RACE鉴定性状遗传分析转座子DNA探针基因部分DNA探针筛选野生型DNA文库，PCR，RACE完整目的基因互补实验 第第17章章 转基因技术与作物育种转基因技术与作物育种(5)(5)差异显示法差异显示法 在生物个体发育不同阶段，或不同的组织与细胞中或不同环境下，基因表达差异。即不同基因有序的时空表达方式，叫做基因的差异表达。差异显示PCR(differential display-PCR,DD-PCR)是指通过对来源特定组织类型的总mRNA进行PCR扩增、电泳，

12、并找出待测组织和对照之间的特异扩增条带。叶mRNA 根mRNA 反转录 反转录 PCR 随机引物+3 锚定poly(t)引物 PCR PAGE叶根 第第17章章 转基因技术与作物育种转基因技术与作物育种(6) cDNA(6) cDNA微阵列微阵列, cDNA, cDNA 芯片芯片cDNA序列（纯样）机器点样在支持物,与荧光标记的不同mRNA样品分别进行杂交,通过激光共聚焦扫描分析不同cDNA序列的杂交信号强度,判断该cDNA在不同mRNA样品中的表达丰度.mRNA 1mRNA 2 第第17章章 转基因技术与作物育种转基因技术与作物育种（二）目的基因重组质粒的构建质粒重组的基本步骤：从原核生物中

13、获取目的基因的载体并进行改造；利用限制性内切核酸酶将载体切开，并用连接酶把目的基因连接到载体上，获得DNA重组体。目的基因体外重组到适当的已改造的质粒中包括保存用中间载体（大肠杆菌寄主）：pBR322、pUC、 pBluescript K、pKS,pGEM-T 繁殖载体（大肠杆菌寄主）： JM109, TOP10 植物转化载体（农杆菌寄主）： pBI121, pCAM1001 第第17章章 转基因技术与作物育种转基因技术与作物育种 第第17章章 转基因技术与作物育种转基因技术与作物育种 第第17章章 转基因技术与作物育种转基因技术与作物育种农杆菌农杆菌: : used extensively

14、for genetic engineering of plants. 包含包含TiTi质粒质粒 Tumor inducing plasmid (bacterial plasmid) T-DNA (Transferred-DNA), 可以转移进入植物基因组.Tumor induced byA. tumefaciens 第第17章章 转基因技术与作物育种转基因技术与作物育种T-DNA regionLeft borderRight bordervir genesori已知农杆菌附着到植物细胞后，只留在细胞间隙中。T-DNA首先在细菌中被加工、剪切、复制，然后转入植物细胞。auxin 第第17章章 转

15、基因技术与作物育种转基因技术与作物育种Ti质粒是根癌农杆菌染色体外的遗传物质，为双股共价闭合的环状DNA分子，其分子量为95156106D, 约有200kb组成。根据其诱导的植物冠瘿瘤中所合成的冠瘿碱种类不同，Ti质粒可以被分成四种类型：章鱼碱型(octopine)胭脂碱型(nopaline)农杆碱型（agropine）农杆菌素碱型（agrocinopine）或称琥珀碱型(succinamopine)TiTi质粒的遗传特性及类型质粒的遗传特性及类型 第第17章章 转基因技术与作物育种转基因技术与作物育种Ti质粒的功能区域（1）T-DNA区（transferred-DNA regions）： 农

16、杆菌侵染植物细胞时，从Ti质粒上切割下来转移到植物细胞的一段DNA，称为转移DNA。该DNA片段上的基因与肿瘤的形成有关。（2）Vir区（virulence region） 该区段上的基因能激活T-DNA转移，使农杆菌表现出毒性。T-DNA区与Vir区在质粒DNA上彼此相邻，约占Ti质粒DNA的三分之一。（3）Con区（regions encoding conjugations） 该区段上存在着与细菌接合转移的有关基因（tra），调控Ti质粒在农杆菌之间的转移。冠瘿碱能激活tra基因，诱导Ti质粒转移，因此称之为接合转移编码区。（4）Ori区（origin of replication） 该区

17、段基因调控Ti质粒的自我复制，故称之为复制起始区。 第第17章章 转基因技术与作物育种转基因技术与作物育种（三）受体材料的选择受体：受体：是指用于接受外源DNA的转化材料。（1）良好的植物基因转化系统应具有的条件：高效稳定的再生能力；受体材料要有较高的遗传能力；具有稳定的外植体来源；对选择性筛选剂敏感。对农杆菌的侵染具有敏感性,但不具备过敏性反应.（2）常用受体材料的类型：l愈伤组织再生系统l直接分化再生系统l原生质体再生系统l胚状体再生系统l生殖细胞再生系统 第第17章章 转基因技术与作物育种转基因技术与作物育种（四）转基因方法的确定和外源基因的转化1.载体介导转移系统 将外源基因重组进入适

18、合的载体系统，通过载体携带将外源基因导入植物细胞并整合在核染色体组中随着核染色体组一起复制和表达。 主要方法有：叶盘法真空渗入法原生质体共培养法 第第17章章 转基因技术与作物育种转基因技术与作物育种2.外源基因直接导入法 这是一种不需要借助载体介导，直接利用理化因素进行外援遗传物质转移的方法。 主要方法有：化学刺激法基因枪轰击法(gene gun )高压电穿孔法(electroporation)微注射法(microfibers )超声波介导法脉冲电泳法离子束介导法 microscopic gold particlesplant cells 第第17章章 转基因技术与作物育种转基因技术与作物育

19、种 第第17章章 转基因技术与作物育种转基因技术与作物育种（五）.转化体的鉴定 通过筛选得到的再生植株初步证明标记基因整合进入受体细胞。至于目的基因是否整合到受体核基因组、是否表达，还必须对抗性植株进一步检测。(1)DNA水平的鉴定 检测内容：是否整合、拷贝数、整合位置。 检测方法：特异性PCR（以外源基因两侧序列设计引物） Southern杂交（外源目的基因序列为探针） 第第17章章 转基因技术与作物育种转基因技术与作物育种转基因植株中转基因植株中CryIAc基因的基因的Southern鉴定鉴定Southern assay of CryIAc in putative transgenic p

20、lants 第第17章章 转基因技术与作物育种转基因技术与作物育种特异性PCR检测外源基因整合到受体 第第17章章 转基因技术与作物育种转基因技术与作物育种(2) 转录水平的鉴定常用的方法Northern杂交（标记的RNA为探针对总RNA杂交）RT-PCR 检测mRNAcDNAPCR 第第17章章 转基因技术与作物育种转基因技术与作物育种Northern杂交 1x 5xEvent11234234 第第17章章 转基因技术与作物育种转基因技术与作物育种（3）翻译水平的鉴定为检测外源基因转录形成的mRNA能否翻译，还必须进行翻译或者蛋白质水平检测。主要方法：Western杂交 免疫检测 第第17章

21、章 转基因技术与作物育种转基因技术与作物育种WerternWertern杂交或蛋白质分析杂交或蛋白质分析 第第17章章 转基因技术与作物育种转基因技术与作物育种表型选择表型选择 第第17章章 转基因技术与作物育种转基因技术与作物育种第二节转基因作物的遗传特点 第第17章章 转基因技术与作物育种转基因技术与作物育种一、外源基因整合机制（一）同源重组整合（homologous recombination） 外源DNA与受体细胞染色体DNA上的同源序列之间发生交换替代，并整合到受体染色体组上。（二）位点特异性重组（site-specific recombination） 在两条DNA的特异位点上，通

22、过位点特异性重组酶的作用对DNA进行特异性切割，实现外源基因的整合。 第第17章章 转基因技术与作物育种转基因技术与作物育种（三）转座作用（transposition） 通过体外重组将外源基因插入到转座子系统中，当携带有目的DNA片段的重组转座成分复制并整合插入到染色体其他区域时实现外源基因的整合。（四）异常重组（illegimate recombination） 异常重组整合是外源基因整合到植物基因组的最常见方式。 第第17章章 转基因技术与作物育种转基因技术与作物育种二、整合后的外源基因在植物体内的表现共抑制：向受体植物种导入一个与受体内某基因同源的基因，导入的基因及受体内与它同源的基因表

23、达都可能减弱的现象。基因沉默：转基因植株由于外源基因的结构被破坏或者外源基因插入了染色体异染色质区域，出现外源基因序列不表达。 第第17章章 转基因技术与作物育种转基因技术与作物育种第三节转基因作物品种的选育 第第17章章 转基因技术与作物育种转基因技术与作物育种一、转基因作物育种目标的制定依据市场经济的需要和生产发展前景依据不同的自然环境、栽培条件落实具体性状目标要考虑品种的搭配要充分考虑转基因作物，尤其是外援目的基因对人类健康和环境安全的影响 第第17章章 转基因技术与作物育种转基因技术与作物育种二 转基因作物品种的选育 纯系育种 回交育种 杂交育种 杂交种 第第17章章 转基因技术与作物

24、育种转基因技术与作物育种第四节 转基因作物的生物安全性 第第17章章 转基因技术与作物育种转基因技术与作物育种对转基因作物的安全性争论，国际上有几个典型的事件。 Pusztai事件：英国Rowett研究所有位Pusztai博士，他用转雪花莲凝集素基因的土豆喂大鼠，1998年秋天在英国电视台发表讲话，声称大鼠食用了这种土豆后，体重和器官重量减轻，免疫系统受到了破坏。后果：绿色和平组织、地球之友等反生物技术组织把这种土豆说成“杀手”，并策划了破坏转基因作物试验地等行动，焚烧了印度的两块试验田，甚至美国加州大学戴维斯分校的非转基因试验材料也遭破坏，以致研究生毕业论文都无法如期完成。英国皇家学会组织了

25、同行评审，并于1999年月发表评论，指出Pusztai的试验有六方面的错误：不能确定转基因和非转基因马铃薯的化学成分有差异；对食用转基因土豆的大鼠，未补充蛋白质以防止饥饿；供试动物数量少，饲喂几种不同的食物，且都不是大鼠的标准食物，缺少统计学意义；试验设计差；统计方法不当；试验结果无一致性等。 第第17章章 转基因技术与作物育种转基因技术与作物育种 斑蝶事件： 1999年5月，康奈尔大学的一个研究组在Nature杂志上发表文章，声称转基因抗虫玉米的花粉飘到一种名叫“马利筋”的杂草上，用马利筋叶片饲喂美国大斑蝶，导致44的幼虫死亡。 这一实验结果在科学上没有说服力：玉米的花粉非常重，扩散不远，在

26、玉米地以外米，马利筋叶片/CM2上只找到一个玉米花粉；2000年开始在美国三个州和加拿大进行的田间试验都证明，抗虫玉米花粉对斑蝶并不构成威胁，实验室试验中用倍于田间的花粉量来喂大斑蝶的幼虫，也没有发现对其生长发育有影响。 斑蝶减少的真正原因，一是农药的过度使用，二是墨西哥生态环境的破坏。 第第17章章 转基因技术与作物育种转基因技术与作物育种 加拿大“超级杂草”事件：由于基因漂流，在加拿大油菜地里发现了个别油菜植株可以抗一种、两种或三种除草剂，因而有人称此为“超级杂草”，并怪罪于转基因。基因漂流并不是从转基因作物开始。如果没有基因漂流，就不会有进化，世界上也就不会有这么多种的植物和现在的作物栽

27、培品种。举例来说，小麦由、三个基因组组成，它是由分别带有、基因组的野生种经过基因漂流合成的。所以，以此来禁止转基因作物，也是没有道理的。 第第17章章 转基因技术与作物育种转基因技术与作物育种中国t抗虫棉破坏环境事件： 2002年6月3日，南京环科所与绿色和平组织在北京召开会议，月日China daily上发表了题为“GM Cotton Damage Enviroment”的文章。 当天,绿色和平组织在其网站上刊登了南京环科所、绿色和平组织顾问薛达元先生长达26页的英文报告，从而再次引发国际争论，在欧、美产生巨大反响。 月日德国农业报发表了题为 “中国研究：棉破坏环境巨大”。 绿色和平组织的“

28、中国项目主管”声称：“棉农将面对不受控制的超级害虫”、 “转基因抗虫棉不但没有解决问题，反而制造了更多的问题”、“棉农将被迫使用更多、更毒的农药”。 事实上，抗虫棉在中国实践多年，深受广大棉农的欢迎。中国、美国、德国、加拿大、比利时、印度等国的科学家已在网上纷纷发表评论，反驳绿色和平组织的观点。 第第17章章 转基因技术与作物育种转基因技术与作物育种我们所要了解的我们所要了解的-转基因植物的潜在风险转基因植物的潜在风险: :1. 转基因植物释放引发“超级杂草”目前转入植物的基因以抗除草剂的为多，其次以抗虫和抗病毒，然后是抗逆。如果这些基因逐渐在野生种群中定居后，就具有选择优势的潜在可能，成为难

29、以控制的“超级杂草”。 第第17章章 转基因技术与作物育种转基因技术与作物育种2. 转基因植物中35S启动子的生物安全性启动子是基因表达所必需的，决定了外源基因表达空间、表达时间和表达强度等，是人们定向改造生物的重要限制因素。最常用的启动子是35S启动子，该启动子能够在植物组织中高水平表达。因此已经被引入许多转基因植物中。潜在风险问题: 35S启动子内有一重组热点。（1）如果35S启动子插入到隐性病毒基因组旁，可能会重新活化病毒。（2）启动子插入到某一编码毒素蛋白的基因上游，可能会增强该毒素的合成。（3）当转基因植物被动物或人类食用后，35S启动子可能会插入到某一致癌基因上游，活化并且导致癌变。 第第17