第3章核酸的结构与功能

1、 第第3 3章章 核酸的结构与功能核酸的结构与功能(nucleic acid)本章主要内容第一节第一节 核酸的结构、化学组成及功能核酸的结构、化学组成及功能 第二节第二节 核酸的结构与功能核酸的结构与功能 第三节第三节 核酸的理化性质核酸的理化性质第四节第四节 核酸的研究方法核酸的研究方法 教学目标教学目标1掌握DNA和RNA在组分、结构和功能上的差异。2了解核酸的结构和它们的性质、功能的关系。3认识核酸在生物科学上的重要性和实践意义。元素组成元素组成：C C、H H、O O、N N、P P等等基本单位基本单位：核苷酸：核苷酸核苷酸分子核苷酸分子含N碱基磷酸五碳糖核苷核苷第一节核酸的结构、化学

2、组成及功能核核酸酸的的组组成成核酸核酸核苷酸核苷酸磷酸磷酸核苷核苷戊糖戊糖碱基碱基水水解解核糖核糖脱氧核糖脱氧核糖嘌呤嘌呤嘧啶嘧啶 腺嘌呤腺嘌呤鸟嘌呤鸟嘌呤胞嘧啶胞嘧啶尿嘧啶尿嘧啶胸腺嘧啶胸腺嘧啶核核 酸酸代表代表戊糖戊糖，对，对DNADNA而言为而言为脱氧核糖脱氧核糖，对对RNARNA而言为而言为核糖核糖； 代表代表碱基碱基 代表代表磷酸基磷酸基核苷酸核苷酸 90% 90%以上分布于细胞核，其余分布于以上分布于细胞核，其余分布于核外核外如线粒体，叶绿体，质粒等。如线粒体，叶绿体，质粒等。分布于胞核、胞液。分布于胞核、胞液。(deoxyribonucleic acid, DNA)(ribonu

3、cleic acid, RNA)脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸 核糖核酸核糖核酸携带遗传信息，决定细胞和个携带遗传信息，决定细胞和个体的基因型体的基因型(genotype)。参与细胞内参与细胞内DNA遗传信息的表遗传信息的表达。某些病毒达。某些病毒RNA也可作为遗也可作为遗传信息的载体。传信息的载体。一、核苷酸的结构与组成NNHNN234567891嘌嘌 呤呤19875432NNHNN6NH2腺嘌呤（腺嘌呤（A）鸟嘌呤（鸟嘌呤（G）7NHN N9NNNH HO O2158432 261. 碱基 嘌呤嘌呤A A、G G 嘧啶嘧啶 C C、U U、T TNN123456尿嘧啶 (U)51NHOON234

4、6胞嘧啶胞嘧啶ON1NH23456NH2胸腺嘧啶胸腺嘧啶 (T)CH3 都具有芳香环的结构特征；都具有芳香环的结构特征； 嘌呤环和嘧啶环呈接近于平面的结构；嘌呤环和嘧啶环呈接近于平面的结构； 有酮式有酮式烯醇式（羟基）烯醇式（羟基） 或胺式或胺式亚胺式（氨基）互变异构亚胺式（氨基）互变异构。胺胺式式亚亚胺胺式式互互变变异异构构酮酮式式烯烯醇醇式式互互变变异异构构尿嘧啶尿嘧啶 U胸腺嘧啶胸腺嘧啶 T胞嘧啶胞嘧啶 C鸟嘌呤鸟嘌呤 G腺嘌呤腺嘌呤 A 稀有碱基稀有碱基 主要存在于主要存在于RNA 甲基化、氢化、硫化甲基化、氢化、硫化NNNNONH2H鸟嘌呤鸟嘌呤NNNNOH次黄嘌呤次黄嘌呤CH31-

5、甲基次黄嘌呤甲基次黄嘌呤2. 戊糖核糖核糖脱氧脱氧核糖核糖OOHHOHHOHCH2HOHH12345/54321HH O CH2HHOHOHHHO/3. 核苷=戊糖+碱基嘌呤环上的嘌呤环上的N-9嘧啶环上的嘧啶环上的N-1腺嘌呤核苷（腺苷）腺嘌呤核苷（腺苷）OHOHOHOCH212345NNNN123456789CH3胞嘧啶脱氧核苷胞嘧啶脱氧核苷ONNH2123456/OHHNHOHCH2HOHH12345戊糖的戊糖的C-1。糖苷键糖苷键 稀有核苷：稀有核苷： 1 1、2-0-甲基甲基-核糖核糖-核苷核苷 2、稀有碱基、稀有碱基 DHU 3、连接方式、连接方式 （假尿嘧啶核苷）（假尿嘧啶核苷）

6、 假尿嘧啶核苷（假尿嘧啶核苷（）OHOHOHOCH2123451NHON23456 糖环与尿糖环与尿嘧啶环不是以嘧啶环不是以N-CN-C键相连，而键相连，而是以是以C-CC-C键相连键相连tRNAtRNA分子分子中特有的核苷中特有的核苷稀有核苷稀有核苷O4. 核苷酸=核苷+磷酸5-核苷酸核苷酸2 3POOCONNNNNH2234OOHOHH215HO 核苷酸结构简式核苷酸结构简式pN 2核苷酸核苷酸3核苷酸核苷酸5核苷酸核苷酸Np NNNNNHHNHNHOOOOHOHOHOHCH2POHOOOHO八种核苷酸八种核苷酸 DNA在单在单/二二/三前加脱氧两字三前加脱氧两字 如如AMP称腺苷一磷酸称

7、腺苷一磷酸(或腺苷酸）或腺苷酸） dAMP称为脱氧腺苷一磷酸（脱氧腺苷酸）称为脱氧腺苷一磷酸（脱氧腺苷酸）腺腺嘌嘌呤呤 A鸟鸟嘌嘌呤呤 G胞胞嘧嘧啶啶 C尿尿嘧嘧啶啶 U胸胸腺腺嘧嘧啶啶 TRNA AMPGMPCMPUMP未未发发现现DNAdAMPdGMPdCMP未未发发现现dTMP 甲基化修饰：甲基化修饰：“m”（methy-） 修饰基团在修饰基团在碱基碱基上：上： 写在碱基写在碱基左边左边 修饰基团在修饰基团在核糖核糖上：上： 写在碱基写在碱基右边右边 右下脚：修饰基团数目右下脚：修饰基团数目 右上脚：修饰位置右上脚：修饰位置 m3 G2,2,7 ATPOOOPOOPOO-ATPADPAM

8、POOPNNNNNH2OOHOHCH2O51焦磷酸焦磷酸5.5.核苷酸衍生物核苷酸衍生物 环状核苷酸环状核苷酸（cAMPcAMP） 35 cAMP在细胞在细胞内起传递细胞外信内起传递细胞外信号的作用，被称为号的作用，被称为“第二信使第二信使” 。二、核苷酸的功能 构成核酸大分子 参与物质代谢、能量代谢及其调节参与物质代谢、能量代谢及其调节第二节 核酸的结构与功能 核酸分子是由核苷酸单体通过3, ,5-磷酸二酯键聚合而成的多核苷酸长链。v 一级结构是指其核苷酸的排列顺序。一、核酸的一级结构 DNA与与RNA分子组成的比较分子组成的比较磷酸磷酸 核核 糖糖C，UA，GRNA磷酸磷酸脱氧核糖脱氧核糖

9、C，TA，GDNA磷酸磷酸 戊戊 糖糖嘧嘧 啶啶嘌嘌 呤呤链数链数双双链链单单链链 核酸链的表示方式核酸链的表示方式/OHHNHCH2HH2345/OHHNHCH2HH2345/OHHNHOHH2345OPOOO-OOPOOHCH2OOPOOOOPOO3,5-磷酸二酯键磷酸二酯键5-Pi3-OH1、字母式、字母式：ACGU2、线条式、线条式3、结构式、结构式脱氧核糖脱氧核糖二、二、DNA的高级结构与功能的高级结构与功能 1953年，年，J. Watson和和F. Crick 在前人研在前人研究工作的基础上，提究工作的基础上，提出了著名的出了著名的DNA双螺双螺旋结构模型，并对模旋结构模型，并对

10、模型的生物学意义作出型的生物学意义作出了科学的解释和预测。了科学的解释和预测。1 1、DNADNA的二级结构的二级结构3 5 3 51）DNA分子由两条反平等排列的脱氧核苷酸链组成，一条链5 3 ，另一条链，另一条链3 5 。2）两条链均以）两条链均以“脱氧核糖磷酸脱氧核糖磷酸基团基团”为，以右手螺旋方式围为，以右手螺旋方式围绕同一公共轴盘旋，螺旋直径为绕同一公共轴盘旋，螺旋直径为2.37nm，并形成大沟和小沟。（1 1） DNA DNA的双螺旋结构的双螺旋结构2nm3.4nm小沟小沟大沟大沟3）碱基位于螺旋内侧，碱基平面与纵轴垂直，两条链上的碱基形成氢键，遵循互补配对原则：其中A=T, GC

11、，A+G=T+C5）氢键维持双螺旋的横向稳定性，碱基堆积力维持纵向稳定性，并更为重要。平面图平面图4）、 双螺旋直径2nm，每周10个碱基对，上升3.4nm，相邻碱基平面的距离为0.34nm，夹角36 DNA DNA的双螺旋结构稳定性的双螺旋结构稳定性 稳定的作用力？稳定的作用力？ 碱基堆积力碱基堆积力 氢键氢键 离子键离子键 不稳定的作用力？不稳定的作用力？ 静电斥力静电斥力 碱基分子内能碱基分子内能DNADNA的双螺旋结构的多态性的双螺旋结构的多态性Z 型 DNA左旋、细长 A型 DNA 短、左旋B型 相对湿度92%时的DNA纤维（2 2） 十字型结构十字型结构 DNADNA的类型的类型类

12、型类型 结晶状态结晶状态 螺距螺距 碱基距离碱基距离 每圈每圈 旋转旋转 (nm) (nm) bp(nm) (nm) bp数数 方向方向A A 相对湿度相对湿度75% 2.8 0.256 11 75% 2.8 0.256 11 右手右手 DNADNA钠盐钠盐B B 相对湿度相对湿度92%92% 3.4 0.34 10 3.4 0.34 10 右手右手 DNADNA钠盐钠盐C C 相对湿度相对湿度66% 3.1 0.332 9.3 66% 3.1 0.332 9.3 右手右手 DNADNA锂盐锂盐Z d(GCGCGC) 4.44 0.37 12 Z d(GCGCGC) 4.44 0.37 12

13、左手左手（2）（3 3） 三链螺旋三链螺旋通常是一条同型寡核苷酸与寡嘧啶核苷酸通常是一条同型寡核苷酸与寡嘧啶核苷酸-寡嘌呤核苷酸双螺寡嘌呤核苷酸双螺旋的大沟结合：旋的大沟结合：oligo(Py) : oligo(Pu)oligo(Py/Pu)T= A : A , CG ： C+T = A : T CG ： G第三股与寡嘌呤之间同向平行，并按第三股与寡嘌呤之间同向平行，并按Hoogsteen配对配对2 2、DNADNA的三级结构的三级结构 DNA在二级结构基础上进一步扭曲盘旋形成的特定构象。在二级结构基础上进一步扭曲盘旋形成的特定构象。 包括：包括： 不同二级结构单元间的相互作用不同二级结构单元

14、间的相互作用 单链与二级结构单元间的相互作用单链与二级结构单元间的相互作用 DNA的拓扑特征的拓扑特征 超螺旋超螺旋是是DNA三级结构的主要形式。三级结构的主要形式。 A.真核细胞染色体的DNA念珠状三级结构3、DNA与蛋白质形成的复合物与蛋白质形成的复合物DNA的存在形式的存在形式B. 原核生物以及真核生物细胞器环状DNA的超螺旋三级结构叶绿体中含有环状DNA线粒体中含有环状DNA细菌等原核生物细菌等原核生物固定固定负超螺旋负超螺旋（右手拓扑结构）（右手拓扑结构）反之，则为正超螺旋自然界通常为负超螺旋。DNA形成三级结形成三级结构及染色体的意构及染色体的意义何在？义何在？压缩分子空间压缩分子

15、空间人体每个体细胞人体每个体细胞DNA长长2m,细胞细胞直径直径0.1mm,细胞核细胞核0.05mm环状DNADNA4、DNA的功能的功能遗传物质遗传物质 DNA与与RNA分子组成的比较分子组成的比较磷酸磷酸 核核 糖糖C，UA，GRNA磷酸磷酸脱氧核糖脱氧核糖C，TA，GDNA磷酸磷酸 戊戊 糖糖嘧嘧 啶啶嘌嘌 呤呤链数链数双双链链单单链链三、三、RNA的高级结构与功能的高级结构与功能v 一级结构是指其核糖核苷酸的排列顺序。 RNA为单链分子为单链分子 RNA主要负责主要负责DNA遗传信息的遗传信息的翻译和表达翻译和表达 分子量比分子量比DNA小得多小得多RNA的种类、分布、功能的种类、分布

16、、功能除了上述三种除了上述三种RNA外，细胞的不同部位存在的许多其他种类的外，细胞的不同部位存在的许多其他种类的小分子小分子RNA，统称为，统称为非非mRNA小小RNA(small non-messenger RNAs, snmRNAs)。 核糖体核糖体RNA核内不均一核内不均一RNA核内小核内小RNA细胞核和胞液细胞核和胞液线粒体线粒体功功能能rRNAmRNA tRNAmtmRNAmttRNAHnRNASnRNASnoRNAscRNA/7SL-RNA核糖体组分核糖体组分转运氨基酸转运氨基酸参与参与hnRNAhnRNA的剪接、转运的剪接、转运信使信使RNARNA转运转运RNARNA胞浆小胞浆小

17、RNARNA细胞核和胞液细胞核和胞液线粒体线粒体功功能能mtrRNA蛋白质合成模板蛋白质合成模板rRNA的加工、修饰的加工、修饰蛋白质内质网定位合成蛋白质内质网定位合成的信号识别体的组分的信号识别体的组分核仁小核仁小RNARNA含量含量80510-15成熟成熟mRNAmRNA的前体的前体microRNA,mRNA微微RNARNA抑制基因的表达抑制基因的表达 约占总约占总RNA的的10-15% 在蛋白质生物合成中翻译在蛋白质生物合成中翻译AA信息、将相应信息、将相应AA转运到核糖核蛋白体转运到核糖核蛋白体 每一个每一个AA至少有一个相应的至少有一个相应的tRNA1 1、tRNAlTransfer

18、 RNA一级结构一级结构特点：特点： 约由约由7393个核苷酸组成个核苷酸组成 分子中含有较多的分子中含有较多的修饰成分修饰成分（10-20%） 3-末端都具有末端都具有CCAOH的结构的结构 tRNA是单链分子，其二级结构由部分双螺旋结构和环状突起构成三叶草形三叶草形氨基酸臂：氨基酸臂：由由7对对bp组成，富含组成，富含G， 末端为末端为CCA，接受活化，接受活化AA二氢尿嘧啶环（二氢尿嘧啶环（D环）环） 由由812个核苷酸组成个核苷酸组成反密码环：反密码环：识别密码子识别密码子额外环：额外环：大小是大小是tRNA分类的重要指标分类的重要指标假尿嘧啶核苷假尿嘧啶核苷-胸腺嘧啶核苷环胸腺嘧啶核

19、苷环 （T C环）环）tRNA的二级结构的二级结构tRNA的三叶草型二级结构的三叶草型二级结构1 12 23 3反密码子环反密码子环 反密码子反密码子D环环TC环环额外环额外环四四环环四四臂臂tRNA的三级结构的三级结构tRNA的三级结的三级结构：构：倒倒“L”形形5 末端帽子结构：末端帽子结构：m7GpppNmP3 末端有多聚腺苷酸尾巴结构末端有多聚腺苷酸尾巴结构(polyA) 单顺反子单顺反子（一条（一条mRNA链上有一个编码区）链上有一个编码区）（1）真核细胞）真核细胞mRNA 约占总约占总RNA的的5%。 不同细胞的不同细胞的mRNA链长和分子量差异很大。链长和分子量差异很大。 其功能

20、是将其功能是将DNA的遗传信息传递到蛋白质合的遗传信息传递到蛋白质合成基地成基地 核糖核蛋白体。核糖核蛋白体。2 2、mRNAMessenger RNA 5帽子帽子 密码子密码子 3polyA m7Gppp- AUG GUG UAA AAAAAA 5端非翻译区端非翻译区 编码区编码区 3非翻译区非翻译区真核生物真核生物mRNA的共价结构的共价结构帽子结构帽子结构帽子结构：识别翻译起始 polyA：维持mRNA的稳定性功能功能原核生物原核生物mRNA为多顺反子，无修饰碱基。为多顺反子，无修饰碱基。多顺反子多顺反子mRNA(polycistronic mRNA)：一条：一条mRNA链上有多个编码区

21、链上有多个编码区（2）原核细胞）原核细胞mRNA 约占全部约占全部RNA的的80% 是核糖核蛋白体的主要组成部分是核糖核蛋白体的主要组成部分 功能与蛋白质生物合成相关。功能与蛋白质生物合成相关。3 3、rRNARibosome RNA* rRNA的种类（根据沉降系数）的种类（根据沉降系数）真核生物真核生物5S rRNA28S rRNA5.8S rRNA18S rRNA原核生物原核生物5S rRNA23S rRNA16S rRNA所有所有rRNArRNA分子中都有大量的链内互补序列，可以形成链内碱基配对，使分子中都有大量的链内互补序列，可以形成链内碱基配对，使得得rRNArRNA高度折叠。高度折

22、叠。rRNArRNA二级结构中存在大量的茎环结构，且对同一沉降二级结构中存在大量的茎环结构，且对同一沉降系数的不同物种来源的系数的不同物种来源的rRNArRNA来说，虽然它们的一级结构同源性不同，但来说，虽然它们的一级结构同源性不同，但二级结构却非常相似。二级结构却非常相似。4、其他小、其他小RNA及及RNA组学组学非非mRNA小小RNA（small non-messenger RNA, snmRNA)：除了：除了tRNA,mRNA,rRNA外，）在细胞的不同部位还外，）在细胞的不同部位还存在存在 着许多其他各类的小分子着许多其他各类的小分子RNA，通称为，通称为snmRNA。RNA组学（组学

23、（RNomics）：研究细胞中：研究细胞中snmRNA种类、结种类、结构和功能，构和功能， snmRNA表达谱的变化及其与功能的关系。表达谱的变化及其与功能的关系。一、核酸的解离与溶解度1、分子量大，两性电解质，通常表现为酸性；、分子量大，两性电解质，通常表现为酸性；2、DNA的的pI为为4-4.5, RNApI为为2-2.5；3、溶解性：、溶解性：均微溶于水；不溶于一般有机溶剂，在均微溶于水；不溶于一般有机溶剂，在70%乙醇中沉淀；乙醇中沉淀； 4、粘度：、粘度：DNADNA粘度大，而粘度大，而RNARNA粘度小粘度小5、DNA对碱稳定，而对碱稳定，而RNA被稀碱水解。被稀碱水解。第第3 3

24、节节 核酸的理化性质核酸的理化性质 二、核酸的粘度核酸粘度大小规律：核酸粘度大小规律： DNARNA 双链双链DNA(dsDNA)单链单链DNA(SSDNA)三、核酸的紫外吸收三、核酸的紫外吸收 碱基具有共轭双键，因此具有紫外吸收性质，其吸收高峰接近260nm。 DNA DNA 紫外吸收光谱：紫外吸收光谱：1 1天然天然DNA;2.DNA;2.变性变性DNA;3DNA;3核苷酸中吸收值核苷酸中吸收值吸光度吸光度波长（波长（nm）OD260的应用：的应用：1. DNA1. DNA或或RNARNA的定量的定量OD260=1.0相当于相当于 50g/ml双链双链DNA 40g/ml单链单链DNA（或

25、（或RNA） 20g/ml寡核苷酸寡核苷酸2.2.判断核酸样品的纯度判断核酸样品的纯度 DNA纯品纯品: OD260/OD280 = 1.8 RNA纯品纯品: OD260/OD280 = 2.0 含杂蛋白及苯酚，降低含杂蛋白及苯酚，降低3.3.判断判断DNADNA是否变性是否变性在在DNA的变性过程中，光吸收值增大（的变性过程中，光吸收值增大（增色效应增色效应）在在DNA的复性过程中，光吸收值减小（的复性过程中，光吸收值减小（减色效应减色效应）四、核酸的变性、复性及杂交四、核酸的变性、复性及杂交 核酸变性指核酸双螺旋区碱基对间的氢键断裂，空间结构破坏，形成单链无规则线团状态的过程。 降解：核苷

26、酸骨架上降解：核苷酸骨架上3，5 -磷酸二酯键的断裂磷酸二酯键的断裂DNADNA变性的本质是双链间氢键的断裂变性的本质是双链间氢键的断裂1、变性、变性（denaturation） 核酸变性后，260nm的紫外吸收值明显增加，称增色效应。 加热DNA的稀盐溶液，达到一定温度(80100)后，核酸即发生热变性。热变性是核酸的重要性质。 热变性DNA缓慢冷却的过程，称退火。 核酸变性后，浮力密度增高、粘度降低、生物活性降低或丧失、酸碱滴定曲线改变。 指增色效应达指增色效应达50%时的温度时的温度 一般一般DNA Tm 值在值在85 - 90 C之间之间 Tm：DNA变性时，变性时，OD260达达到最

27、大值的到最大值的50%时的温度称时的温度称为为DNA的的解链温度解链温度或或融解温融解温度度(Tm)。大小与大小与G+C含量成正比。含量成正比。均一性高，变性的温度范围越窄均一性高，变性的温度范围越窄 。Tm值大小与下列因素有关：值大小与下列因素有关：（1 1）DNA的均一性的均一性： 测定测定Tm，可推知，可推知G-C含量。含量。G-C%=（Tm-69.3）2.44（2）GC含量：含量：不易用稀电解质保存不易用稀电解质保存DNA（3）介质中的离子强度：介质中的离子强度：2 2、复性复性（renaturation） 变性变性DNA在适当的条件下，两条彼此分开的在适当的条件下，两条彼此分开的单链

28、重新缔合成双螺旋单链重新缔合成双螺旋复性复性。DNA复性复性复性的程度、速率与复性条件有关：复性的程度、速率与复性条件有关： 热变性热变性DNA骤然冷却（淬火）不可能复性骤然冷却（淬火）不可能复性 将变性将变性DNA缓慢冷却（退火）可以复性缓慢冷却（退火）可以复性热变性的热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，经缓慢冷却后即可复性，这一过程称为这一过程称为退火退火(annealing) 。 分子量越大复性越难；分子量越大复性越难； 浓度越大，复性越容易；浓度越大，复性越容易； 核酸变性后复性时，不同来源的核酸变性后复性时，不同来源的DNA形成形成双链，或双链，或DNA单链和单链和RNA链形成链形成

29、DNA-RNA杂杂合双链的过程称合双链的过程称分子杂交分子杂交。3.核酸杂交（核酸杂交（Hybridization)DNA-DNA杂交双链分子杂交双链分子变性变性 复性复性 不同来源的不同来源的DNA分子分子核酸的分子杂交RNADNA热变性热变性复性复性分子杂交分子杂交DNA-RNA杂交链杂交链 SouthernSouthern杂交杂交 NorthernNorthern杂交杂交 WesternWestern杂交杂交五、核酸的水解五、核酸的水解 酸、碱、酶水解酸、碱、酶水解 作用于磷酸二酯键和糖苷键作用于磷酸二酯键和糖苷键 DNA/RNA对酸对酸/ /碱的碱的有差别有差别糖苷键糖苷键比比磷酸酯键

30、磷酸酯键更易被酸水解；更易被酸水解；嘌呤嘌呤碱比碱比嘧啶嘧啶碱的糖苷键对酸更不稳定；碱的糖苷键对酸更不稳定；对酸最不稳定的对酸最不稳定的：嘌呤嘌呤与脱氧核糖间糖苷键与脱氧核糖间糖苷键1、酸水解、酸水解DNA:pH2.8、100加热加热1h，或，或pH1.6，37 对水透析对水透析可除去嘌呤碱可除去嘌呤碱形成无嘌呤酸（形成无嘌呤酸（apurinic acid，APA）2、碱水解、碱水解RNA磷酸酯键磷酸酯键被水解被水解生成生成2/3 -核苷酸核苷酸DNA则不受影响则不受影响l脱氧核糖无脱氧核糖无2OH，l不能形成碱水解中间产物不能形成碱水解中间产物DNA在在1mol/LNaOH中加热至中加热至1

31、004h，可得，可得到小分子的寡聚脱氧核苷酸。到小分子的寡聚脱氧核苷酸。3 3、酶水解、酶水解磷酸二酯键磷酸二酯键（1 1）酶分类）酶分类 根据底物分为根据底物分为： DNase、RNase 根据作用方式根据作用方式：核酸外切酶核酸外切酶 从一端（从一端（3/5）逐个水解）逐个水解核酸内切酶核酸内切酶 从中间开始在某个位点切断从中间开始在某个位点切断按照作用的化学键按照作用的化学键 磷酸二酯酶磷酸二酯酶（phosphodiesterase） 断断3-OH形成的酯键形成的酯键 5-磷酸核苷磷酸核苷 断断5-OH形成的酯键形成的酯键 3-磷酸核苷磷酸核苷 磷酸单酯酶磷酸单酯酶（phosphomon

32、oesterase） 切去核酸分子末端磷酸基切去核酸分子末端磷酸基 及核苷酸的磷酸基及核苷酸的磷酸基其它：对底物二级结构的专一性其它：对底物二级结构的专一性 双链酶双链酶：作用于双链核酸作用于双链核酸 单链酶单链酶：作用于单链核酸作用于单链核酸+PyPyPyPyPyPyPuPuPPPPPPPPPP2H2O（2）RNase （1）牛胰核糖核酸酶（）牛胰核糖核酸酶（RNase ）作用：嘧啶核苷作用：嘧啶核苷3磷酸与其它核苷酸连键磷酸与其它核苷酸连键 专一性极高的内切酶专一性极高的内切酶产物：产物： 3 3嘧啶核苷酸嘧啶核苷酸/ /其结尾的寡核苷酸其结尾的寡核苷酸PPPPPPP2H2OPP+OHOH

33、PPPPPGAGAAAGGCUUC （2）核糖核酸酶）核糖核酸酶T1 （RNase T1）作用：作用：3鸟苷酸与相邻核苷酸鸟苷酸与相邻核苷酸5OH连键连键产物：产物：3鸟苷酸或以其为末端的寡核苷酸鸟苷酸或以其为末端的寡核苷酸（3）核糖核酸酶）核糖核酸酶T2 （RNase T2 ） 作用位点为作用位点为Ap残基残基 可将可将tRNA完全降解为完全降解为3腺苷酸结尾腺苷酸结尾的寡核苷酸的寡核苷酸DNase：牛胰脱氧核糖核酸酶：牛胰脱氧核糖核酸酶 Mg2+激活、柠檬酸盐抑制激活、柠檬酸盐抑制 切断双链或单链切断双链或单链DNA 以以5磷酸磷酸为末端的寡聚核苷酸为末端的寡聚核苷酸 DNase ：牛脾脱

34、氧核糖核酸酶：牛脾脱氧核糖核酸酶 Mg2+抑制抑制 3磷酸磷酸为末端的寡聚核苷酸为末端的寡聚核苷酸（3）DNase链球菌脱氧核糖核苷酸酶：链球菌脱氧核糖核苷酸酶： 内内切酶，作用于切酶，作用于DNA 产物为产物为5磷酸为末端磷酸为末端的碎片的碎片限制性内切酶限制性内切酶( (细菌细菌) ) 主要降主要降解外源解外源DNA 具严格的具严格的碱基序列碱基序列专一性专一性 EcoR E：大肠杆菌：大肠杆菌E.coli属名属名 co：种名种名的头两个字母的头两个字母 R：大肠杆菌的：大肠杆菌的菌株菌株 ：该细菌中已分离出的这类：该细菌中已分离出的这类酶的编号酶的编号 限制性内切酶通常与限制性内切酶通常

35、与甲基化酶甲基化酶成对存在：成对存在：具有相同的底物专一性，识别相同碱基序列具有相同的底物专一性，识别相同碱基序列。 甲基供体：甲基供体：S S腺苷甲硫氨酸腺苷甲硫氨酸 甲基受体：甲基受体：DNA上上的的A与与C甲基化使细菌自身的甲基化使细菌自身的DNADNA带上标记带上标记5 -T-A-G-C-T-A- -T-A-G-C-T-A-33-A-T-C-G-A-T- - A-T-C-G-A-T- 5 5 -T-A-G-C-T-A- -T-A-G-C-T-A-33-A-T-C-G-A-T- - A-T-C-G-A-T- 5 非特异性的糖苷酶非特异性的糖苷酶 碱基特异碱基特异N糖苷酶糖苷酶水解糖苷键水

36、解糖苷键（4）N糖苷酶糖苷酶 制备天然核酸必需采用温和的条件制备天然核酸必需采用温和的条件，防止过酸、过碱，避免剧烈搅拌，尤，防止过酸、过碱，避免剧烈搅拌，尤其重要的是防止核酸酶的作用其重要的是防止核酸酶的作用一、核酸的分离、纯化及鉴定第4节 核酸研究方法真核真核DNADNA以核蛋白（以核蛋白（DNPDNP）形式存在，）形式存在，DNPDNP溶于水溶于水或高盐溶液（或高盐溶液（1mol/L NaCl1mol/L NaCl），但不溶于低盐），但不溶于低盐溶液（溶液（0.14mol/L NaCl0.14mol/L NaCl），据此，采用高盐），据此，采用高盐提取，低盐沉淀，可将提取，低盐沉淀，可将

37、DNPDNP与与RNARNA核蛋白分开核蛋白分开，提取出，提取出DNPDNP。去除蛋白质：水饱和酚，氯仿异戊醇。去除蛋白质：水饱和酚，氯仿异戊醇。DNADNA沉淀：沉淀：0.3M NaAC-70%0.3M NaAC-70%乙醇乙醇1、DNA的提取制备制备RNARNA时，最重要的是使时，最重要的是使RNaseRNase灭活：灭活：所有容器都要经过所有容器都要经过高温处理高温处理，不能高温高压的，不能高温高压的用用0.10.1焦碳酸二乙酯（焦碳酸二乙酯（DEPCDEPC）处理。处理。 DEPC DEPC能使蛋白质乙基化而破坏能使蛋白质乙基化而破坏RNaseRNase活性；活性；加入加入强变性剂强变

38、性剂（如胍盐）使（如胍盐）使RNaseRNase失活；失活；在在RNARNA的反应体系内加入的反应体系内加入RNaseRNase的的抑制剂抑制剂（如（如RNasin)RNasin)2、RNA的提取（2）定糖法定糖法 RNA：核糖核糖 糠醛糠醛 绿色物质绿色物质（670-680nm） DNA：脱氧核糖：脱氧核糖+二苯胺二苯胺兰色物质兰色物质（595-620nm）苔黑酚/地衣酚浓HCl浓硫酸（1）紫外分光光度法1个A50g/ml 双链DNA 40g/ml RNA或单链DNA3、核酸含量测定（3）定磷法定磷法 核酸含磷量为核酸含磷量为9.5% 1g磷相当于磷相当于10.5g核酸核酸（4）琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 溴乙锭溴乙