抗肿瘤药物评价技术上课讲义

1、抗肿瘤药物抗肿瘤药物(yow)评评价技术价技术南京(nn jn)凯基生物科技发展公司联系电话025-52880812第一页，共36页。第二页，共36页。第三页，共36页。抗肿瘤药物药效学指导抗肿瘤药物药效学指导(zhdo)原则原则细胞毒类抗肿瘤药物非临床研究细胞毒类抗肿瘤药物非临床研究(ynji)技术指导原则技术指导原则化学药物一般药理学研究化学药物一般药理学研究(ynji)技术指技术指导原则导原则中药、天然药物一般药理学研究技术指导原则中药、天然药物一般药理学研究技术指导原则指导原则指导原则第四页，共36页。 体内抗肿瘤试验必须选用三种以上肿瘤模型，其中至体内抗肿

2、瘤试验必须选用三种以上肿瘤模型，其中至 少一种为人癌裸小鼠移植少一种为人癌裸小鼠移植(yzh)模型或其它人癌小鼠模型。模型或其它人癌小鼠模型。 试验结果三种模型均为有效，再重复一次也为有效试验结果三种模型均为有效，再重复一次也为有效 体外实验选用(xunyng)10-15株人癌细胞株 ，至少重复一次23抗肿瘤药物药效学研究抗肿瘤药物药效学研究(ynji)的要求的要求 体内、体外实验方法相结合；以体内实验为主体内、体外实验方法相结合；以体内实验为主1南京凯基生物科技发展公司联系电话025-52880812第五页，共36页。体外抗肿瘤活性试验体外抗肿瘤活性试验(shyn

3、) 对候选化合物进行初步筛选对候选化合物进行初步筛选了解候选化合物的抗瘤谱了解候选化合物的抗瘤谱为随后进行的体内抗肿瘤试验提供参考为随后进行的体内抗肿瘤试验提供参考试验目的试验目的第六页，共36页。体外抗肿瘤活性试验体外抗肿瘤活性试验(shyn)试验方法试验方法 选用选用10-1510-15株人癌细胞株株人癌细胞株 试验还应考察受试物对耐药肿瘤细胞系和正常人源细胞的作用和影响试验还应考察受试物对耐药肿瘤细胞系和正常人源细胞的作用和影响 使用使用(shyng)MTT(shyng)MTT还原法、磺酰罗丹明还原法、磺酰罗丹明B(SRB)B(SRB)染色法染色法 药物与细胞共培养时间一般为药物与细胞共

4、培养时间一般为48-72 48-72 小时，贴壁细胞需先贴壁小时，贴壁细胞需先贴壁24 24 小时小时后再给药。后再给药。 试验应设阴性、阳性、溶媒对照组，阳性对照用一定浓度的标准抗肿瘤试验应设阴性、阳性、溶媒对照组，阳性对照用一定浓度的标准抗肿瘤药。药。 试验至少应重复一次试验至少应重复一次 第七页，共36页。 四氮唑盐还原法体外抗肿瘤活性试验体外抗肿瘤活性试验(shyn)替替率。率。值。值。-第八页，共36页。 磺酰罗丹明染色法体外抗肿瘤活性试验体外抗肿瘤活性试验(shyn)(j su第九页，共36页。 染料(rnlio)排斥法体外抗肿瘤活性试验体外抗肿瘤活性试验(shyn)在在第十页，共

5、36页。 阿拉( l)马蓝法体外抗肿瘤活性试验体外抗肿瘤活性试验(shyn)为为第十一页，共36页。 集落形成(xngchng)法体外抗肿瘤活性试验体外抗肿瘤活性试验(shyn)第十二页，共36页。 生长(shngzhng)曲线测定法体外抗肿瘤活性试验体外抗肿瘤活性试验(shyn)和和1N0数。数。第十三页，共36页。体外抗肿瘤活性试验体外抗肿瘤活性试验(shyn)白血病（白血病（6株）：株）：CCRF-CEM、HL-60、K562、MOLT-4、RPMI-8226、SR肺癌（肺癌（9株）：株）：A549、EKVX、HOP-62、HOP-92、NCI-H23、NCI-H226、NCI-H322

6、、 MNCI-H460、NCI-H522乳腺癌：乳腺癌：BT-549、HS578T、MCF-7、MCF-7/ADR、MDA-MB-231、ATCC、 MDA-MB-435、MDA-N、T-47D卵巢癌：卵巢癌：IGROV1、OVCAR-3、OVCAR-4、OVCAR-5、OVCAR-8、SK-OV-3肾癌：肾癌：786-0、A498、ACHN、CAKI-1、RXF-393、SN12C、TK-10、UO-31前列腺癌：前列腺癌：DU-145、PC-3中枢神经系统中枢神经系统(xtng)肿瘤：肿瘤：SF-268 、SF-295 、SF-539、 SFB-19 、SFB-75、U251黑色素瘤：黑色

7、素瘤：M14、MALME-3M、SK-MEL-2、SK-MEL-5、SK-MEL-28、UACC-62、 UACC-257、LOCIMV美国美国NCI抗肿瘤药物体外筛选抗肿瘤药物体外筛选(shixun)使用的使用的60种人类细胞种人类细胞第十四页，共36页。体外抗肿瘤活性试验体外抗肿瘤活性试验(shyn)瘤谱细胞株结合我国瘤谱细胞株结合我国实际情况实际情况呼吸系统、消化系统、呼吸系统、消化系统、血液系统、妇科肿瘤血液系统、妇科肿瘤选用人正常细胞株选用人正常细胞株初步确定受试样品对初步确定受试样品对正常组织和肿瘤组织正常组织和肿瘤组织的选择性的选择性选用耐药细胞株选用耐药细胞株考察受试样品的抗耐

8、考察受试样品的抗耐药作用药作用国内国内体外体外筛选筛选的细的细胞株胞株选择选择选用人血管内皮细胞选用人血管内皮细胞株进行同步考察株进行同步考察细胞株有相当一部分细胞株有相当一部分是国内自己建株是国内自己建株胃癌、肝癌胃癌、肝癌体外初筛经典三株细胞体外初筛经典三株细胞A549HepG-2HCT-116兼顾兼顾(jing)选择使用动物（小鼠）肿瘤与人的肿瘤细胞；选择使用动物（小鼠）肿瘤与人的肿瘤细胞；筛选实验以快速生长的细胞为主；筛选实验以快速生长的细胞为主；兼顾兼顾(jing)选择使用贴壁生长细胞与悬浮生长细胞选择使用贴壁生长细胞与悬浮生长细胞样品初筛时应该样品初筛时应该(ynggi)注意三点注

9、意三点第十五页，共36页。体外抗肿瘤活性试验体外抗肿瘤活性试验(shyn)药物与细胞共培养时间一般药物与细胞共培养时间一般(ybn)为为48-72 小时，贴壁细小时，贴壁细胞需先贴壁胞需先贴壁24 小时后再给药。小时后再给药。第十六页，共36页。体外抗肿瘤活性试验体外抗肿瘤活性试验(shyn)评价评价(pngji)标准标准以同一样品以同一样品(yngpn)不同浓度对肿瘤细胞抑制率作图可得到剂量不同浓度对肿瘤细胞抑制率作图可得到剂量效应曲线采用效应曲线采用Logit法计算半数有效浓度法计算半数有效浓度(IC50值或值或EC50值值)合成化合物或植物提取纯品的合成化合物或植物提取纯品的IC5010

10、 gm1或植物粗提物的或植物粗提物的IC5020 gm1时，则判断样品时，则判断样品(yngpn)在体外对肿瘤细胞有在体外对肿瘤细胞有杀伤作用。杀伤作用。体外试验至少重复一次体外试验至少重复一次第十七页，共36页。体外抗肿瘤活性试验体外抗肿瘤活性试验(shyn)体外筛选其他方法：体外筛选其他方法：MTS法、刃天青法法、刃天青法以线粒体为作用靶点的受试物不宜采用四氮唑盐还原法以线粒体为作用靶点的受试物不宜采用四氮唑盐还原法 溶媒对照组与阴性对照组比较，溶媒对照组与阴性对照组比较，OD值应在值应在5%，且无统计学差异，且无统计学差异应考虑到受试物在水溶液中的稳定性，比如环磷酰胺在水溶液中的半衰应考

11、虑到受试物在水溶液中的稳定性，比如环磷酰胺在水溶液中的半衰 期为期为3h脂溶性的受试物常用脂溶性的受试物常用DMSO助溶，但助溶，但DMSO终浓度终浓度(nngd)不低于不低于0.1%测出的测出的OD值有事会出现假阴性（加值有事会出现假阴性（加MTT等染色剂时更换培养基）等染色剂时更换培养基）注意事项注意事项第十八页，共36页。体内体内(t ni)抗肿瘤活性试验抗肿瘤活性试验举举例例(j l)HepG-2 72hGroupMeanSDInhibitive RateNegative Control 0.9550.010Positive Control 0.9520.0100.29%Solvent

12、 Control 0.1650.00782.74%化合物XXXIC50=22.588uM100M0.0510.00594.66%80M0.1010.00989.47%60M0.1520.00884.08%40M0.2850.00470.16%20M0.6620.01330.72%10M0.7660.02019.81%5M0.8470.01111.31%2.5M0.9180.0103.92%1.25M0.9400.0101.59%表表 化合物化合物XXX对人肝癌细胞对人肝癌细胞HepG-2体外增殖体外增殖(zngzh)的影响的影响第十九页，共36页。体外抗肿瘤活性试验体外抗肿瘤活性试验(shyn

13、)第二十页，共36页。体内抗肿瘤试验结果是评价体内抗肿瘤试验结果是评价(pngji)候选化合物有效性的最重要指候选化合物有效性的最重要指标标体内抗肿瘤试验必须选用三种以上肿瘤模型，其中至少一种为人体内抗肿瘤试验必须选用三种以上肿瘤模型，其中至少一种为人癌裸小鼠移植模型或其它人癌小鼠模型。试验结果三种模型均为癌裸小鼠移植模型或其它人癌小鼠模型。试验结果三种模型均为有效，再重复一次也为有效，评定该化合物对这些实验性肿瘤具有效，再重复一次也为有效，评定该化合物对这些实验性肿瘤具有治疗作用。有治疗作用。通常情况下，以人癌异体移植模型试验结果来评价通常情况下，以人癌异体移植模型试验结果来评价(pngji

14、)细胞毒细胞毒类抗肿瘤药物的有效性。类抗肿瘤药物的有效性。体内体内(t ni)抗肿瘤活性试验抗肿瘤活性试验第二十一页，共36页。体内体内(t ni)抗肿瘤活性试验抗肿瘤活性试验小鼠肿瘤模型小鼠肿瘤模型(mxng)大鼠肿瘤模型大鼠肿瘤模型(mxng)人源异种移植肿瘤模型人源异种移植肿瘤模型(mxng)动物模型动物模型第二十二页，共36页。实验实验(shyn)动物动物体内体内(t ni)抗肿瘤活性试验抗肿瘤活性试验动物要求健康，符合等级动物要求，三证动物要求健康，符合等级动物要求，三证 裸鼠：裸鼠：SPF级，小鼠：清洁级、级，小鼠：清洁级、SPF级级 实验动物质量合格证实验动物质量合格证 实验动物

15、生产许可证实验动物生产许可证 实验动物使用实验动物使用许可证许可证雌雄均可，但同一批实验中动物性别必须相同雌雄均可，但同一批实验中动物性别必须相同 妇科肿瘤使用雌性小鼠、前列腺癌等使用雄性小鼠妇科肿瘤使用雌性小鼠、前列腺癌等使用雄性小鼠小鼠鼠龄为小鼠鼠龄为5-6周，体重为周，体重为18-22克克 裸鼠裸鼠6周龄以后，会产生体液周龄以后，会产生体液(ty)免疫、免疫、NK细胞、细胞、B淋巴细淋巴细胞免疫，成瘤率会下降胞免疫，成瘤率会下降 同批动物体重相差不超过同批动物体重相差不超过20%评价同一物质的活性时，不同批次的实验必须采用同一品系的小评价同一物质的活性时，不同批次的实验必须采用同一品系的

16、小鼠鼠第二十三页，共36页。体内体内(t ni)抗肿瘤活性试验抗肿瘤活性试验肿瘤肿瘤(zhngli)瘤株瘤株用体外试验敏感细胞株进行体内抗人癌裸小鼠移植瘤试验。用体外试验敏感细胞株进行体内抗人癌裸小鼠移植瘤试验。 模型建立和模型建立和使用应注意：使用应注意：(1) 移植瘤一般由相应的细胞株移植而建立，对细胞株和移植瘤的化疗移植瘤一般由相应的细胞株移植而建立，对细胞株和移植瘤的化疗敏感性应予了解。敏感性应予了解。(2) 移植瘤复苏后一般应传移植瘤复苏后一般应传2-3代后再用于体内抗肿瘤试验。代后再用于体内抗肿瘤试验。(3) 对模型生长情况应全面对模型生长情况应全面(qunmin)了解，尤其是生长

17、快的模型了解，尤其是生长快的模型(4) 为了保持移植瘤的生物学特性和遗传特性，复苏后移植瘤体内传代为了保持移植瘤的生物学特性和遗传特性，复苏后移植瘤体内传代应少于应少于 15-20代代 第二十四页，共36页。呼吸系统肿瘤妇科肿瘤人肺癌 NCI-H460小鼠宫颈癌 U14人肺腺癌 A549人乳腺癌 MDA-MB-435消化系统肿瘤小鼠胃癌 MFC人乳腺癌 MDA-MB-231人胃癌 BGC-803人乳腺癌 MX-1人胃癌 HGC-27人乳腺癌 BCaP-37人低分化胃癌 BGC-823人宫颈癌 SiHa人低分化胃癌 MGC-803人宫颈癌 Hela人低分化胃癌 MKN-45人卵巢癌 A2780人

18、中分化胃癌 SGC-7901人卵巢癌 SK-OV-3人高分化胃癌 MKN-28生殖系统肿瘤人肾癌 Ketr-3小鼠肝癌 H22人膀胱癌 EJ人肝癌 QGY-7701人膀胱癌 T24人肝癌 SMMC-7721人前列腺癌 PC-3人肝癌 Bel-7402人前列腺癌 PC-3M人肝细胞性肝癌 IM3白血病人白血病 HL-60人肝癌 HepG-2人白血病 K562人结肠癌 Ls-174-T人耐阿霉素白血病 K562/Adr人结肠癌 CL187皮肤肿瘤小鼠黑色素瘤 B16F1人结肠癌 HCT-116小鼠黑色素瘤 B16F10人结肠癌 SW1116小鼠黑色素瘤 B16BL6人结肠癌 HT-29人黑色素瘤

19、A375人胰腺癌 BxPC-3人黑色素瘤 M14头颈部肿瘤人喉表皮癌 Hep-2其它肿瘤小鼠肉瘤 S180第二十五页，共36页。体内体内(t ni)抗肿瘤活性试验抗肿瘤活性试验小鼠肿瘤模型小鼠肿瘤模型优点：潜伏期短、移植瘤成活率高、生长均匀、无自发缓解、试验优点：潜伏期短、移植瘤成活率高、生长均匀、无自发缓解、试验周期短、费用低周期短、费用低缺点：动物肿瘤在生物学和遗传学上与临床不一致，在药物敏感性缺点：动物肿瘤在生物学和遗传学上与临床不一致，在药物敏感性方面与人体肿瘤方面与人体肿瘤 不一致不一致仅可用于候选化合物的初步筛选仅可用于候选化合物的初步筛选常用小鼠肿瘤常用小鼠肿瘤H22、S180、

20、Lewis第二十六页，共36页。人癌裸鼠异种移植肿瘤模型人癌裸鼠异种移植肿瘤模型优点：实验结果与临床较符合、优点：实验结果与临床较符合、可用于研究获得性药物抗性可用于研究获得性药物抗性缺点：饲养条件要求高、接种成活率低、移植瘤个体差异大、缺点：饲养条件要求高、接种成活率低、移植瘤个体差异大、部分模型部分模型 很难构建、生存时间不适合作为试验终点很难构建、生存时间不适合作为试验终点人癌裸鼠皮下移植瘤操作简单、易于观察与结果判定，但皮下移植瘤缺人癌裸鼠皮下移植瘤操作简单、易于观察与结果判定，但皮下移植瘤缺乏肿瘤最典型的特性乏肿瘤最典型的特性- -转移，是现在评价抗肿瘤药物活性的主要模型转移，是现在

21、评价抗肿瘤药物活性的主要模型体内体内(t ni)抗肿瘤活性试验抗肿瘤活性试验第二十七页，共36页。体内体内(t ni)抗肿瘤活性试验抗肿瘤活性试验溶于水的药物，用生理盐水或蒸馏水配制；如用酸、碱溶解溶于水的药物，用生理盐水或蒸馏水配制；如用酸、碱溶解(rngji)者，可先用者，可先用小量酸小量酸(0.1-0.5N HCl)或碱或碱(NaHCO3、Na2CO3、NaOH)溶解溶解(rngji)，调节，调节pH在在4.5-9.0的范围内。用乙醇、丙二醇、吐温的范围内。用乙醇、丙二醇、吐温80、DMSO助溶的药物，或助溶的药物，或用吐温用吐温60、吐温、吐温80、2-3%淀粉、淀粉、0.5%羧甲基纤

22、维素制成混悬液的药物，羧甲基纤维素制成混悬液的药物，可腹腔注射或口服，但必须设相同浓度的溶剂对照组。用注射用花生油可腹腔注射或口服，但必须设相同浓度的溶剂对照组。用注射用花生油配制的溶液或乳剂可口服、皮下或肌肉注射配制的溶液或乳剂可口服、皮下或肌肉注射药物药物(yow)配制配制第二十八页，共36页。体内体内(t ni)抗肿瘤活性试验抗肿瘤活性试验试验设模型对照组、阳性对照组、治疗组。试验设模型对照组、阳性对照组、治疗组。治疗组设高、中、低三个剂量组。小鼠肿瘤和腹水瘤接种后次日将治疗组设高、中、低三个剂量组。小鼠肿瘤和腹水瘤接种后次日将动物随机分组，裸鼠移植瘤用游标卡尺动物随机分组，裸鼠移植瘤用

23、游标卡尺(yubio kch)测量移植测量移植瘤直径，待肿瘤生长至瘤直径，待肿瘤生长至100300mm3后将动物随机分组。后将动物随机分组。动物数普通小鼠每组动物数普通小鼠每组10只，裸鼠只，裸鼠6只。只。组别设置组别设置(shzh)试验设计试验设计第二十九页，共36页。体内体内(t ni)抗肿瘤活性试验抗肿瘤活性试验治疗组设高、中、低剂量治疗组设高、中、低剂量(jling)治疗组，一般按治疗组，一般按4:2:1设置设置如何确定试验剂量如何确定试验剂量(jling)临床等效剂量临床等效剂量(jling)（根据体表面积换算）（根据体表面积换算）根据半数致死量（根据半数致死量（1/10-1/20预

24、摸）或者高剂量预摸）或者高剂量(jling)使用最使用最大耐受量或大耐受量或LD10的剂量的剂量(jling)根据文献估计剂量根据文献估计剂量(jling)剂量剂量(jling)设置设置试验设计试验设计第三十页，共36页。体内体内(t ni)抗肿瘤活性试验抗肿瘤活性试验模型对照组给予相应的溶剂；模型对照组给予相应的溶剂；阳性阳性(yngxng)对照药选用对该动物敏感的、临床应用的抗肿瘤药物对照药选用对该动物敏感的、临床应用的抗肿瘤药物（阳性（阳性(yngxng)组必须作出阳性组必须作出阳性(yngxng)结果，否则有理由怀结果，否则有理由怀疑筛选方法和指标的可信度）疑筛选方法和指标的可信度）如

25、受试物为一抗癌药物的衍生物或类似物时，必须选用该抗癌药物作如受试物为一抗癌药物的衍生物或类似物时，必须选用该抗癌药物作为阳性为阳性(yngxng)对照药对照药原型剂对照原型剂对照阳性阳性(yngxng)对照药选择原则对照药选择原则 疗效确切与被试物质化学结构类似；疗效确切与被试物质化学结构类似；与被试物质有类似的作用机理与被试物质有类似的作用机理 对照组设置对照组设置(shzh)试验设计试验设计第三十一页，共36页。体内体内(t ni)抗肿瘤活性试验抗肿瘤活性试验分组当日开始给药，根据不同药物的代谢动力学和毒性反应等确定给药方案。分组当日开始给药，根据不同药物的代谢动力学和毒性反应等确定给药方

26、案。给药途径应与推荐临床用药的途径相同。给药途径应与推荐临床用药的途径相同。 给药次数较多，或被试物质溶解性较差，静脉给药有困难时，可考虑使用腹腔给药次数较多，或被试物质溶解性较差，静脉给药有困难时，可考虑使用腹腔给药，但在评价药效给药，但在评价药效(yo xio)时要注意这两种给药途径是有差别的。时要注意这两种给药途径是有差别的。可采取瘤周、瘤内、肌肉、皮下给药途径。可采取瘤周、瘤内、肌肉、皮下给药途径。腹水瘤试验时一般不能应用腹腔给药途径。腹水瘤试验时一般不能应用腹腔给药途径。给药方案给药方案(fng n)和给药途径和给药途径试验设计试验设计第三十二页，共36页。腹水瘤模型腹水瘤模型接种给

27、药后，观察和记录接种给药后，观察和记录动物动物(dngw)死亡时间，死亡时间，计算生存天数。如阴性计算生存天数。如阴性对照组对照组20%动物动物(dngw)存活时间超过存活时间超过4周，表明腹水瘤生长不周，表明腹水瘤生长不良，实验作废。良，实验作废。检测(jin c)指标检测(jin c)指标裸鼠移植瘤模型裸鼠移植瘤模型推荐使用测量瘤径的方法，推荐使用测量瘤径的方法，动态观察受试物抗肿瘤的动态观察受试物抗肿瘤的效应。效应。肿瘤直径肿瘤直径(zhjng)的测量次的测量次数根据移植瘤的生长情况数根据移植瘤的生长情况而定，一般为每周而定，一般为每周2-3次次,每次测量同时还需称鼠重。每次测量同时还需

28、称鼠重。免疫缺陷小鼠皮下移植的肿瘤很少发生转移，多数死于原发肿瘤。而临床免疫缺陷小鼠皮下移植的肿瘤很少发生转移，多数死于原发肿瘤。而临床肿瘤病人大多死于肿瘤转移，动物和临床肿瘤病人的死亡原因不同。因此，肿瘤病人大多死于肿瘤转移，动物和临床肿瘤病人的死亡原因不同。因此，对于人癌异体移植试验，生命延长率并不是理想的观测指标。对于人癌异体移植试验，生命延长率并不是理想的观测指标。体内抗肿瘤活性试验体内抗肿瘤活性试验第三十三页，共36页。体内体内(t ni)抗肿瘤活性试验抗肿瘤活性试验裸鼠皮下移植裸鼠皮下移植(yzh)瘤模型瘤模型肿瘤体积肿瘤体积(tumor volume,TV)的计算公式的计算公式(gngsh)为：为：V = 1/2ab2 或或/6abc其中其中a、b、c分别表示长宽高。两公式分别表示长宽高。两公式(gngsh)的相关性极好，可采用任一公式的相关性极好，可采用任一公式(gngsh)。根据测量结果计算出相对肿瘤体积（根据测量结果计算出相对肿瘤体积（relative tumor volume，RTV），），