测序技术研究进展

1、基因测序技术原理及进展 基因测序 满足高通量、高效率、高覆盖度 (序列组成) 基因检测 精准、明确的目标片段、个体差异（功能解释）测序与检测1975/19771985/19871990/2003测序技术发展时间轴 第1 代测序技术荧光标记Sanger 法 第2 代测序技术循环阵列合成测序法 第3 代测序技术单分子测序法代次第一代 第二代第三代版本 3.2Sanger法 ABI ABI/GenoMe MSCompleteGenomicsSBS合成法测序IlluminaSBL连接法测序ABI/Polonator G.007SBP焦磷酸测序RocheSM-SBSF

2、DHelicosFEPacificBioscience/VisiGen纳 米OxfordNanopore测序技术发展路线 化学裂解法 双脱氧链终止法 荧光自动测序法 杂交测序法荧光标记Sanger 法G1.1 化学裂解法对待测DNA 5末端进行放射性标记利用化学试剂在原DNA链某一种或某一类碱基处进行专一性切割。设计4组相互独立的化学反应分别得到部分降解产物。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，放射自显影检测获取核苷酸序列。G1.2双脱氧链终止法放射性标记的4种dNTP混合底物中的一种每次将一种23-双脱氧核苷酸(ddNTP)掺入到底物混合反应液中参与DNA链的合成设计4组相互独立的聚合反应分别得

3、到不同末端终止的合成片段产物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，放射自显影检测获取核苷酸序列。 读出模板读出模板互补序列互补序列dNTP 凝胶电泳凝胶电泳 较大片段较大片段 较小片段较小片段ddGTPddATPddCTP ddTTP 反应混合物反应混合物Klenow酶酶 未知序列的单链未知序列的单链DNA 读出待测读出待测序列序列CTGACTTCGACAAACAA5 3 A C T GddGddGddGddGGACTGAAGCTGTT3 5 CTGACTTCGACAA5 3 在1985年, Smith等采用激光激发标记的荧光,并用CCD检测 20世纪80年代初Jorgenson和Lukacs提出了

4、毛细管电泳技术 1992年美国的Mathies实验室首先提出阵列毛细管电泳(capillary array electrophoresis )新方法,并采用激光聚焦荧光扫描检测装置, 25只毛细管并列电泳,每只毛细管在1.5 h内可读出350 bp,DNA序列分析效率可达6 000 bp/h。G1.3 G1.3 荧光自动测序技术荧光自动测序技术 目前,应用最广泛的应用生物系统公司(applied biosystems,ABI)3730系列自动测序仪即是基于毛细管电泳和荧光标记技术的DNA测序仪,用CCD检测系统识别,并直接翻译DNA序列。310型全自动遗传分析仪型全自动遗传分析仪其他其他DNA

5、DNA全自动分析仪：全自动分析仪：ABI Prism 3100遗传分析仪遗传分析仪 3700型全自动遗传分析仪型全自动遗传分析仪ABI 3500 测序仪测序仪G1.4杂交测序技术 20世纪80年代末出现, 利用DNA杂交原理,将一系列已知序列的单链寡核苷酸片段固定在基片上,把待测的DNA样品片段变性后与其杂交,根据杂交情况排列出样品的序列信息。 优点：检测速度快, 检测成本低,具有部分第二代测序技术的特点。 缺点：误差较大,且不能重复测定。 第一代总结 通过几十年的逐步改进,第1代测序仪的读长可以超过1000 bp,原始数据的准确率可以高达99.999%,测定每千碱基序列的成本是0.5美元,每

6、天的数据通量可以达到600,000碱基. 由于其对电泳分离技术的依赖,使其难以进一步提升分析的速度和提高并行化程度,并且难以通过微型化降低测序成本.因此,需要开发全新的技术来突破这些局限.循环阵列合成测序法 第二代测序技术都采用了大规模矩阵结构的微阵列分析技术阵列上的DNA样本可以被同时并行分析.此外,测序是利用DNA聚合酶或连接酶以及引物对模板进行一系列的延伸,通过显微设备观察并记录连续测序循环中的光学信号实现的.第2代测序技术工作流程测序仪品牌技术原理开发商Roche 454焦磷酸测序RocheIllumina Solexa边合成边测序IlluminaABI SOLiD基于磁珠的大规模并行

7、连接测序ABI第二代测序技术的关键特点：第二代测序技术的关键特点：第一,通过有序或者无序的阵列配置实现大规模的并行化,以提供高程度的信息密度;第二,不采用电泳设备易于微型化.相对于第1代测序技术,样本和试剂的消耗量得以降低.G2.1 焦磷酸测序核心技术：“微乳粒PCR”油包水结构乳粒 酶化学发光反应 原理：原理：利用微乳滴PCR(emulsion PCR, emPCR)来生成扩增产物.利用水溶液与油混合形成油包水结构乳滴进行后续PCR反应的微型化学反应.碱基测定采用边合成边测序,利用焦磷酸法产生的光学信号来进行检测. 在三磷酸核苷结合到DNA链上的时候释放焦磷酸,通过ATP硫酰化酶和荧光素酶产

8、生一系列级联反应,导致生物化学发光放出光信号. 优点：焦磷酸测序的主要优势是它的速度和读长（将近500 碱基）。除了DNA 聚合酶反应所需化合物, 焦磷酸测序法并不需要额外的化合物用于DNA 链的延长, 降低了化学反应出现意外的几率。 缺点:这一技术平台主要的错误类型来自于同聚物，即相同碱基的延伸, 另一个缺点是由于它依赖于包含一系列酶的焦磷酸检测, 与其他二代测序技术相比, 其试剂价格相对较高。ATGATTTTTGATTTTTTG焦磷酸测序Base Calling Jonathan Rothberg博士是454的创始人。 2005年底，454公司推出Genome Sequencer 20 S

9、ystem (GS 20) ，开创了边合成边测序的先河。 2008又推出了性能更优Genome Sequencer FLX System (GS FLX)，使读长、准确性进一步提升。核心技术：“DNA簇”桥式PCR“可逆性末端终止子” 合成法测序 原理原理：使用荧光标记的核苷酸以及可逆的终止子。在每一轮测序循环中, 标记不同荧光基团的4 种核苷酸以及DNA聚合酶同时加入流通池通道中, 按照碱基互补配对的原则进行DNA 链的延伸。每个核苷酸的3羟基是被封闭起来, 以防止额外的延伸。采集荧光图像, 碱基特异的荧光标记揭示了这一轮中新加入核苷酸是什么, 也就获得模板中这一位置的DNA 序列。然后,打

10、开3端, 继续进行下一轮反应。这一过程重复多次,到50 个循环, 产生50 个碱基的DNA 序列。1000 molecules per 1 m cluster 1000 clusters per 100 m square40 million clusters per experimentPrepare DNA fragmentsLigate adaptersAttach single molecules to surfaceAmplify to form clusters20 micronsSequence5GTCAGTCAGTCAGT35CAGTCATCACCTAGCGTAFirst bas

11、e incorporatedCycle 1: Add sequencing reagentsRemove unincorporated basesDetect signalCycle 2-n: Add sequencing reagents and repeat1、每轮测序反应加入四种带有荧光标记的dNTP，末端带有可以被去除的阻断基团2、每轮反应只能整合一个核苷酸，仪器读取相应的荧光信号3、信号读取结束，用化学方法去除阻断基团，进行下一轮测序反应123789456T T T T T T T G T T G C T A C G A T The identity of each base of

12、a cluster is read off from sequential images根据每个点每轮反应读取的荧光信号序列，转换成相应的DNA序列Base calling from the raw dataBase calling from the raw data 优点：可扩展的超高通量 ，需要样品量少（低至100ng），运行成本较低，性价比高。成本低廉：每测量100万个碱基对所需成本3美元；可精确读取1 8个的连续重复碱基如AAAAAAAAAAAAAAAAAA，TTTTTTT。 缺点：其主要的缺点是由于光信号衰减和移相的原因使得序列读长较短（荧光标记、封闭基团）。 Illumina公司于

13、2007年促成Genome Analyzer的商品化。 荷兰科学家利用它首次绘出女性的基因组图谱。此外第一个亚洲人图谱，第一个癌症病人图谱和第一个非洲人图谱全是依赖Genome Analyzer完成的。 Illumina估计占有60%左右的测序市场 连接法测序 核心技术： 荧光标记的8核苷酸探针 双碱基编码策略原理：原理： 与454情况相同也采用了微乳滴PCR 与微球相结合的策略来扩增DNA 模板。连接反应的底物是8碱基单链荧光探针混合物，按照碱基互补规则与单链DNA模板链配对。SOLiD 利用探针的连接反应读取模板的利用探针的连接反应读取模板的DNA序列序列下图的双碱基编码矩阵规定了该编码区

14、16种碱基对和4种探针颜色的对应关系主要步骤： 231文库准备 SOLiD系统能支持两种测序模板:片段文库( fragment library)或配对末端文库(mate-paired library)。片段文库就是将基因组DNA打断,两头加上接头,制成文库。该文库适用于转录组测序、RNA定量、miRNA研究、重测序、甲基化分析及ChIP测序等。配对末端文库是将基因组DNA打断后,与中间接头连接,环化,然后用EcoP15酶切,使中间接头两端各有27 bp的碱基,最后加上两端的接头,形成文库。该文库适用于全基因组测序、SNP分析、结构重排及拷贝数分析等。 232扩增 SOLiD用的是与454技术类

15、似的乳液PCR对要测序的片段进行扩增。在微反应器中加入测序模板、PCR反应元件、微珠和引物,进行乳液PCR(emulsion PCR)。PCR反应结束后,磁珠表面就固定有拷贝数目巨大的同一DNA模板的扩增产物。 233微珠与玻片连接 乳液PCR完成之后,变性模板,富集带有延伸模板的微珠,微珠上的模板经过3修饰,可以与玻片共价结合。SOLiD系统最大的优点就是每张玻片能容纳更高密度的微珠,在同一系统中轻松实现更高的通量。含有DNA模板的磁珠共价结合在SOLiD玻片表面, SOLiD测序反应就在SOLiD玻片表面进行。每个磁珠经SOLiD测序后得到一条序列。http:/绿宇生物科技 专业建库 测序

16、 QQ:110199525每个探针进行检测的两个碱基后面有三个匹配碱基，因此一条测序引物读取的序列是不完整的每个探针进行检测的两个碱基后面有三个匹配碱基，因此一条测序引物读取的序列是不完整的测序引物与测序引物与adapteradapter退火退火探针连接，检测荧光探针连接，检测荧光切除荧光基团切除荧光基团第二轮探针连接，检测荧光第二轮探针连接，检测荧光切除荧光基团切除荧光基团测序引物沿着测序引物沿着Adapter移动移动5次，确保每个位点都被检测次，确保每个位点都被检测(二）（三）0位置是位置是Adapter的最后一个碱基，因此只检测一次，的最后一个碱基，因此只检测一次，该碱基是进行解码所必须

17、的。该碱基是进行解码所必须的。http:/绿宇生物科技 专业建库 测序 QQ:110199525 优点： SOLiD系统原始碱基数据的准确度大于99.94%，是目前新一代基因分析技术中准确度最高的。就通量而言，SOLiD 3系统是革命性的，超高通量是该系统最突出的特点，目前SOLiD 3单次运行可产生50GB的序列数据，相当于17倍的人类基因组覆盖度。 缺点：该技术主要的缺点是序列读长相对较短（30-35bp）. 这也是由于同一簇扩增产物中存在移相造成的。 2005年，在454推出了GS20焦磷酸测序平台，ABI迅速收购了一家测序公司，并在2007年底推出了SOLiD 新一代测序平台 。 以四

18、色荧光标记寡核苷酸的连续连接合成为基础，取代了传统的聚合酶连接反应。 三种第二代测序技术对比三种第二代测序技术对比454 sequencing读取长度大，400bp可以对未知基因组进行从头测序de novo sequencing当遇到polymer时，如AAAAAA等，荧光强度和碱基个数不成线性关系，判定重复碱基个数有困难Solexa sequencing高度自动化的系统读取片段多，适合进行大量小片段的测序，如microRNA profiling基于可逆反应，随反应轮数增加，效率降低，信号衰减，读取序列较短，给de novo sequencing 拼接带来困难SOLiD sequencing每

19、个碱基读取两次非常高的准确性，特别是对于SNP的检测灵活的系统，完善的磁珠编码系统，可以进行样品的pooling，分割测序区域读取长度受连接反应的轮数限制，给de novo sequencing 拼接带来困难http:/绿宇生物科技 专业建库 测序 QQ:110199525G3 单分子测序(SMS) 第二代测序技术在制备测序文库时都需要经过PCR扩增，而这一PCR过程可能引入突变或者改变样品中核酸分子的比例关系。另外二代测序的读长普遍偏短，在进行数据拼接时会遇到麻烦。为了克服这样的缺点，业界发展出了以单分子实时测序和纳米孔为标志的第三代测序技术。一些已经或正在开发的平台 Helicos Hel

20、iScope Pacific Biosciences Oxford Nanopore HeliScope近来市场上最早出现的单分子测序仪器.基于单个分子水平上边合成边测序的技术.定位：待测DNA被随机打断成小片段，在每个小片段（200 bp）的末端加上poly-dA，并于玻璃芯片上随机固定多个poly-dT引物，其末端皆带有荧光标记，以利于精确定位。测序：逐一加入荧光标记的可逆性末端终止子。通过掺入、检测和切除的反复循环，即可实时读取大量序列。 成果：利用HeliScope测序仪，QuakeQuake博士本人的基因组报告发表在Nature Biotechnology上。他是继James Wat

21、son和Craig Venter之后第三位基因组测序的非匿名个体。经过4轮运行，他们产生了数十亿个序列读取，测序的覆盖度达2828倍,覆盖了90%90%的人类参考基因组。序列读长24-70 bp,平均读长为32 bp,并鉴定出280万个SNP位点和752个拷贝数变异。这次测序花了4 4个星期的时间，试剂花费为4800048000美元。 Pacific Biosciences Pacific Biosciences公司致力于开发一种新的测序技术单分子实时技术(single molecule real time,SMRT)。 这一单分子合成测序技术依赖于被称为零级波导(zero mode wave

22、guide,ZMW)的纳米结构来实时观察DNA的聚合。 该结构在一片薄金属膜上刻出数以千计直径数十纳米的亚波长小孔.并将金属膜附着在透明的支持基质上.由于每个小孔的尺寸低于光的波长,所以当光线从透明一侧照射时无法透射.并且在每个小孔的底部形成指数衰减的消逝波,这样创造了一个很小体积的检测空间.每个小孔底部固定一个聚合酶分子. 激光在进入ZMW后迅速衰减，因此，只有底部30 nm被照亮，随后核苷酸涌入ZMW中，并在阵列表面扩散。当聚合酶检测到正确的核苷酸时，便将其掺入新生链中，这个过程需要几毫秒，而单纯的扩散只需要几微秒。这种时间差使掺入的核苷酸产生了很高的信号强度，类似于脉冲信号。因此，ZMW

23、有能力在荧光标记核苷酸的背景下检测单个掺入事件。主要技术及现存问题： PacificBio的技术在高速测序、长序列产出和低成本方面有着巨大的潜力.但是,与其他单分子测序平台一样,实时检测单个分子对于提高原始数据准确率是一个挑战,并可能成为一个障碍.如前所述,可以通过对同一样品进行重置后进行多次测序来减少误读. Oxford Nanopore 设计一种基因工程蛋白质纳米孔.通过遗传工程改造, 构建一种将氨基化环糊精(Am-inocyclodextrin)配体共价连接到位于脂双层膜中的-溶血蛋白内的生物纳米孔.纳米孔中连接有一个核酸外切酶。当从纳米孔中连接有一个核酸外切酶。当从DNA模板链上被陆续模板链上被陆续切割下来的核苷酸依次进入纳米孔时，就会与环糊精分子发切割下来的核苷酸依次进入纳米孔时，就会与环糊精分子发生暂时的结合，从而干扰通过纳米孔的电流，每一个碱基都生暂时的结合，从而干扰通过纳米孔的电流，每一个碱基都会有其特有的干扰电流产生。会有其特有的干扰电流产生。 优点：仪器构造简单，使用成本低廉，不需要对核苷酸进行标记，也不需要复杂的光学探测系统。同时因为它