生物选修三 1.1DNA重组技术的基本工具

1、设想一 能否培养出具有抗虫性状的抗虫棉呢？ 设想二 这些定向改造基因的设想能实现吗？基因工程基因工程 抗虫棉的抗虫棉的培育有哪些培育有哪些关键步骤？关键步骤？DNA DNA 重组技术的基本工具重组技术的基本工具本节知识内容本节知识内容 1 DNA1 DNA重组技术的基本工具重组技术的基本工具专题一专题一 基因工程基因工程“分子手术刀分子手术刀” ” 限制酶限制酶 “分子缝合针分子缝合针” ” DNADNA连接酶连接酶 “分子运输车分子运输车” 基因进入受体细胞的载体基因进入受体细胞的载体 黏性末端黏性末端平末端平末端12345脱氧核苷酸的结构脱氧核苷酸的结构 G1234512345 A3,5-

2、磷磷酸二酯酸二酯键键磷酸二酯键磷酸二酯键11仔细观察各限制酶仔细观察各限制酶 识别的特定序列有识别的特定序列有何何 特点？特点？限制酶的识别序列限制酶的识别序列限制酶所识别的序列的特点是：限制酶所识别的序列的特点是：呈现碱基互补对称，无论是呈现碱基互补对称，无论是6个个碱基还是碱基还是4个碱基，都可以找到个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的一条中心轴线，中轴线两侧的双链双链DNA上的碱基是上的碱基是反向对称反向对称重复重复排列的排列的 ，称为，称为回文序列回文序列中轴线在G与A之间切割大肠杆菌的一种限制酶(EcoR)只能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。EcoRIEcoRI限制

3、酶的作用限制酶的作用黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端EcoRIEcoRI限制酶的切割限制酶的切割 被限制酶切开的被限制酶切开的DNA两条两条单链的切口，带有几个单链的切口，带有几个伸出的伸出的核苷酸核苷酸，他们之间正好互补配他们之间正好互补配对，这样的切口叫对，这样的切口叫黏性末端黏性末端。SmaISmaI限制酶的切割限制酶的切割当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNADNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端平末端。限制性内切酶作用过程SmaISmaI只能识别CCCGGG序列，并在C和G之间切

4、开。中轴线SmaISmaI限制酶的作用限制酶的作用在G与C之间切割你能推测限制酶存在于原核生物中的你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗？作用是什么吗？原核生物易受自然界外源原核生物易受自然界外源DNA的入侵，的入侵，但生物但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。制，以防止外来病原物的侵害。限制酶限制酶就是细就是细菌的一种菌的一种防御性工具，防御性工具，当外源当外源DNA侵入时，会侵入时，会利用限制酶利用限制酶将外源将外源DNA切割掉，切割掉，以保证自身的以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到安全。所以

5、，限制酶在原核生物中主要起到切切割外源割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的、使之失效，从而达到保护自身的目的。目的。寻根问底寻根问底为什么限制酶不剪切细菌本身的为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶的细胞，其的细胞，其DNADNA分子中分子中不具备这种限制酶不具备这种限制酶的识别切割序列的识别切割序列，或者，或者通过甲基化酶将甲通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的种限制酶也不

6、会使自身的DNADNA被切断，并被切断，并且可以防止外源且可以防止外源DNADNA的入侵。的入侵。 基因的针线：基因的针线：DNA连接酶连接酶G A A T T CC T T A A GG A A T T CC T T A A GG C T T A A A A T T C GG C T T A A A A T T C GG C T T A A A A T T C G用同种限制酶切割用同种限制酶切割类型来源功能相同点差别EcoliDNA连接酶T4DNA连接酶大肠杆菌T4噬菌体恢复磷酸二酯键只能连接黏性末端能连接黏性末端和平末端(效率较低)阅读课本第阅读课本第5页页“分子缝合针”DNA连接酶的相关

7、内容，填写下表的相关内容，填写下表自主学习自主学习ATGCATGC连接酶连接磷酸二酯键连接酶连接磷酸二酯键DNADNA连接酶的作用过程：连接酶的作用过程：二、分子缝合针二、分子缝合针DNA连接酶连接酶 T磷磷酸酸二二酯酯键键1234512345 A作用部位：作用部位：（扶手）（扶手）（梯子）（梯子）DNA聚合酶聚合酶和和DNA连接酶有何连接酶有何相同点和不同点？相同点和不同点？DNA连接酶连接酶DNA聚合酶聚合酶连接连接DNA链链连接部位连接部位双链双链在两在两DNADNA片片断之间形成断之间形成磷酸二酯键磷酸二酯键单链单链将单个核苷酸加将单个核苷酸加到已存在的核酸到已存在的核酸片断片断33末

8、端形成末端形成磷酸二酯键磷酸二酯键连接黏性末端连接黏性末端连接黏性末端和平末端连接黏性末端和平末端分类分类作用作用E.coli DNA连接酶连接酶连接酶种类：连接酶种类：T4DNA连接酶连接酶核苷酸分子的连接：核苷酸分子的连接：ATGCATGCDNADNA聚合酶连接单链聚合酶连接单链DNADNA把单个脱氧核苷酸连接到把单个脱氧核苷酸连接到DNADNA片段上片段上三、分子运输车三、分子运输车基因进入受基因进入受体细胞的载体体细胞的载体 要让一个从甲生物细胞内取出来的基因在乙生要让一个从甲生物细胞内取出来的基因在乙生物体内进行表达，首先得将这个基因送到乙生物的物体内进行表达，首先得将这个基因送到乙

9、生物的细胞内去！细胞内去！能将外源基因送入受体细胞的工具能将外源基因送入受体细胞的工具就是就是载体载体。基因工程的载体被喻为基因工程的载体被喻为：分子运输车分子运输车基因工程的载体来源基因工程的载体来源：作为基因工程的载体需要怎样的条件呢？作为基因工程的载体需要怎样的条件呢？作为载体的必要条件作为载体的必要条件 1. 1.能自我复制能自我复制 能进入受体生物细胞并在受体生物细胞内复制能进入受体生物细胞并在受体生物细胞内复制并表达；并表达； 2.2.有一个至多个限制酶切位点有一个至多个限制酶切位点 能与目的基因结合能与目的基因结合 3.3.有遗传标记基因有遗传标记基因 便于观察便于观察 4.4.

10、对受体细胞无害、易分离对受体细胞无害、易分离 安全、比较容易得到安全、比较容易得到1 1、能自我复制、能自我复制2 2、具有一个或多个限制酶切点、具有一个或多个限制酶切点3 3、具有遗传标记基因、具有遗传标记基因4 4、对受体细胞无害、易分离、对受体细胞无害、易分离5 5、大小适合，便于操作、大小适合，便于操作质粒作为运载体的条件？在进行基因工程操作中在进行基因工程操作中,真正被用作载体的质粒都是在真正被用作载体的质粒都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的天然质粒的基础上进行过人工改造的基因操作基因操作的基本步骤的基本步骤 目目的基因是人们所的基因是人们所需要转移需要转移或或改造改造的基因。的

11、基因。 如如苏云金芽孢杆菌的苏云金芽孢杆菌的抗虫基因抗虫基因，还有，还有植物的植物的抗病（抗病毒、抗细菌）基因抗病（抗病毒、抗细菌）基因、种、种子子贮藏蛋白的基因贮藏蛋白的基因，以及人的，以及人的胰岛素基因、胰岛素基因、干扰素基因干扰素基因等。等。 步骤一步骤一：提取提取目的基因目的基因 步骤二：目的基因与运载体重组步骤二：目的基因与运载体重组 1 1）用）用一种一种限制酶切割运载体限制酶切割运载体（质粒），（质粒），使其出现使其出现一个切口一个切口，露出，露出黏性末端黏性末端。 2 2）用）用同一种同一种限制酶限制酶切断目的基因切断目的基因，使其，使其产生产生相同相同的的黏性末端黏性末端。

12、3 3）将切下的目的基因片段）将切下的目的基因片段插入运载体插入运载体（质粒）的（质粒）的切口处，再加入适量切口处，再加入适量DNADNA连接酶连接酶，形成了一个形成了一个重组重组DNADNA分子分子（重组质粒）（重组质粒） 目目的基因与运载体的结合过程，实际的基因与运载体的结合过程，实际上是不同来源的上是不同来源的基因重组基因重组的过程的过程。基因操作基因操作的基本步骤的基本步骤 常用的受体细胞：常用的受体细胞： 有有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。酵母菌和动植物细胞等。 将目的基因导入受体细胞的原理将目的基因导入受体细胞的原理借助借助细

13、菌细菌或病毒侵染细胞或病毒侵染细胞的途径，的途径，还有显微注射法。还有显微注射法。 步骤三：目的基因导入受体细胞步骤三：目的基因导入受体细胞步骤四：目的基因的检测和表达步骤四：目的基因的检测和表达1 1、筛选具有目的基因的受体细胞的依据：、筛选具有目的基因的受体细胞的依据：运载体上的标记基因是否表达运载体上的标记基因是否表达2 2、判断目的基因是否表达：、判断目的基因是否表达：目的基因是否控制合成了相应目的基因是否控制合成了相应的产物，表达了相关的性状。的产物，表达了相关的性状。基因操作基因操作的基本步骤的基本步骤基基因操作的基本步骤因操作的基本步骤 步骤四：目的基因的检测和表达步骤四：目的基

14、因的检测和表达四环素四环素抗性基因抗性基因氨苄青霉氨苄青霉素抗性基因素抗性基因重组重组DNADNA分子的模拟操作分子的模拟操作 材料用具：材料用具： 纸圈模拟质粒，长方形纸板模拟目纸圈模拟质粒，长方形纸板模拟目的基因所在的基因所在DNADNA片段，剪刀代表限制酶，片段，剪刀代表限制酶，透明胶代表透明胶代表DNADNA连接酶。连接酶。重组重组DNADNA分子的模拟操作分子的模拟操作 方法步骤：方法步骤：1 1、根据碱基互补配对原则，将纸板上相应互补链的碱基序列、根据碱基互补配对原则，将纸板上相应互补链的碱基序列补充完整。补充完整。2 2、根据质粒和目的基因所在片段上碱基排列特点，选择合适、根据质

15、粒和目的基因所在片段上碱基排列特点，选择合适的限制酶进行切割。的限制酶进行切割。 （1 1）EcoREcoR限制酶只能识别限制酶只能识别GAATTCGAATTC序列，并在序列，并在G G和和A A之间切之间切开形成黏性末端。开形成黏性末端。 （2 2）HindHind限制酶只能识别限制酶只能识别AAGCTTAAGCTT序列，并在序列，并在A A和和A A之间切之间切开形成黏性末端。开形成黏性末端。3 3、将切下的目的基因重组到质粒的切口处，用透明胶将切口、将切下的目的基因重组到质粒的切口处，用透明胶将切口黏结起来，完成重组黏结起来，完成重组DNADNA分子的模拟制作。分子的模拟制作。 如果你的

16、操作是正确的，不同颜色的黏性末端能够互如果你的操作是正确的，不同颜色的黏性末端能够互补配对。如果你制作的黏性末端不能互补配对，说明操作补配对。如果你制作的黏性末端不能互补配对，说明操作有误，应检查出错的原因。有误，应检查出错的原因。课本知识回顾课本知识回顾 基因工程又叫做基因工程又叫做 或或 。通俗地说，就。通俗地说，就是按照人们的意愿，把一种生物是按照人们的意愿，把一种生物的某种的某种 提取出来，加以提取出来，加以 ， 然后然后放到另一种生物的细胞里，放到另一种生物的细胞里， 改造生物的遗传性状。改造生物的遗传性状。基因拼接技术基因拼接技术DNA重组技术重组技术基因基因修饰改造修饰改造定向地

17、定向地DNA 重组技术的基本工具重组技术的基本工具“分子手术刀分子手术刀” “分子缝合针分子缝合针” “分子运输车分子运输车”限制限制（性核酸内切）（性核酸内切）酶酶DNA连接酶连接酶基因进入受体细胞的载体基因进入受体细胞的载体原核生物中分离纯化出来原核生物中分离纯化出来特定的核苷酸序列特定的核苷酸序列磷酸二酯键磷酸二酯键粘性末端粘性末端平末端平末端1、种类：、种类：2、作用部位：、作用部位：两类两类连接黏性末端连接黏性末端Ecoli DNA连接酶连接酶T4 DNA连接酶连接酶磷酸二酯键磷酸二酯键连接黏性末端和平末端连接黏性末端和平末端通常有三种通常有三种:作为载体的条件：作为载体的条件： 在

18、进行基因工程操作中在进行基因工程操作中,真正被用作载体的质粒都是真正被用作载体的质粒都是在在 质粒质粒噬菌体衍生物噬菌体衍生物动植物病毒动植物病毒天然质粒天然质粒人工改造人工改造的的能自我复制；有切割位点；能自我复制；有切割位点；有遗传标记基因；对受体细胞无害、易分离有遗传标记基因；对受体细胞无害、易分离基础上进行过基础上进行过在基因工程中，切割运载体和在基因工程中，切割运载体和含有目的基因的含有目的基因的DNA片段，需片段，需使用（使用（ ）A.同种限制酶同种限制酶 B. 两种限制酶两种限制酶C.同种连接酶同种连接酶 D. 两种连接酶两种连接酶P4 寻根问底寻根问底 1.1.根据你所掌握的知

19、识，你能分析出限制酶存根据你所掌握的知识，你能分析出限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗？在于原核生物中的作用是什么吗？ 提示：原核生物容易受到自然界外源提示：原核生物容易受到自然界外源DNADNA的入的入侵，但是，生物在长期的进化过程中形成了一侵，但是，生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNADNA侵入时，会利用限制酶将外源侵入时，会利用限制酶将外源DNADNA切割掉，切割掉，以保证自身的安全。以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物所以，

20、限制酶在原核生物中主要起到切割外源中主要起到切割外源DNADNA、使之失效，从而达、使之失效，从而达到保护自身的目的。到保护自身的目的。P6 寻根问底寻根问底 2. DNA2. DNA连接酶与连接酶与DNADNA聚合酶是一回事吗？为什么聚合酶是一回事吗？为什么？ 答：不是一回事。答：不是一回事。 基因工程中所用的连接酶有两种：一种是基因工程中所用的连接酶有两种：一种是从大肠杆菌中分离得到的，称之为从大肠杆菌中分离得到的，称之为E Ecolicoli连接连接酶。另一种是从酶。另一种是从T4T4噬菌体中分离得到，称为噬菌体中分离得到，称为T4T4连接酶。这两种连接酶催化反应基本相同，都连接酶。这两

21、种连接酶催化反应基本相同，都是连接双链是连接双链DNADNA的缺口（的缺口（nicknick），而不能连接单），而不能连接单链链DNADNA。DNADNA连接酶和连接酶和DNADNA聚合酶都是形成磷酸二聚合酶都是形成磷酸二酯键酯键（在相邻核苷酸的（在相邻核苷酸的3 3位碳原子上的羟基与位碳原子上的羟基与5 5位碳原子上所连磷酸基团的羟基之间形成），位碳原子上所连磷酸基团的羟基之间形成），那么，二者的那么，二者的差别差别主要表现在什么地方呢？主要表现在什么地方呢？寻根问底寻根问底 （1 1）DNADNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核酸片段核酸片段的的33末端的

22、羟基上，形成磷酸二酯键末端的羟基上，形成磷酸二酯键；而；而DNADNA连接酶是在两个连接酶是在两个DNADNA片段之间形成磷酸片段之间形成磷酸二酯键二酯键，不是在单个核苷酸与，不是在单个核苷酸与DNADNA片段之间形成片段之间形成磷酸二酯键。磷酸二酯键。 （2 2）DNADNA聚合酶是以一条聚合酶是以一条DNADNA链为模板链为模板，将单个，将单个核苷酸通过磷酸二酯键形成一条与模板链互补核苷酸通过磷酸二酯键形成一条与模板链互补的的DNADNA链；而链；而DNADNA连接酶是将连接酶是将DNADNA双链上的两个缺双链上的两个缺口同时连接起来。因此口同时连接起来。因此DNADNA连接酶不需要模板连

23、接酶不需要模板。 此外，二者虽然都是由蛋白质构成的酶，但组此外，二者虽然都是由蛋白质构成的酶，但组成和性质各不相同。成和性质各不相同。P7 P7 思考与探究思考与探究 1.1.限制酶在限制酶在DNADNA的任何部位都能将的任何部位都能将DNADNA切开吗？以切开吗？以下是四种不同限制酶切割形成的下是四种不同限制酶切割形成的DNADNA片段：片段： (1) CTGCA (2) AC (3) GC G TG CG (4) G (5) G (6) GC CTTAA ACGTC CG (7) GT (8)AATTC CA G 你是否能用你是否能用DNADNA连接酶将它们连接起来？连接酶将它们连接起来？

24、 答：答： 2 2和和7 7能连接形成能连接形成ACGTACGT TGCATGCA； 4 4和和8 8能连接形成能连接形成GAATTCGAATTC CTTAAGCTTAAG； 3 3和和6 6能连接形成能连接形成GCGCGCGC CGCGCGCG； 1 1和和5 5能连接形成能连接形成CTGCAGCTGCAG GACGTCGACGTC。 2.2.联系你已有的知识，想一想，为什么细菌中限联系你已有的知识，想一想，为什么细菌中限制酶不剪切细菌本身的制酶不剪切细菌本身的DNADNA？ 提示：迄今为止，基因工程中使用的限制酶绝大提示：迄今为止，基因工程中使用的限制酶绝大部分都是从细菌或霉菌中提取出来的

25、，它们各自部分都是从细菌或霉菌中提取出来的，它们各自可以识别和切断可以识别和切断DNADNA上特定的碱基序列。上特定的碱基序列。 细菌中限制酶之所以不切断自身细菌中限制酶之所以不切断自身DNADNA，是因为微，是因为微生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，对于外源入侵的机制，对于外源入侵的DNADNA可以降解掉。可以降解掉。 生物在长期演化过程中，含有某种限制酶的细胞生物在长期演化过程中，含有某种限制酶的细胞，其，其DNADNA分子中或者分子中或者不具备这种限制酶的识别切不具备这种限制酶的识别切割序列割序列，或者，或者通过甲基化酶将甲基转移到

26、所识别通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。 这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的的DNADNA被切断，并且可以防止外源被切断，并且可以防止外源DNADNA的入侵。的入侵。P7 P7 思考与探究思考与探究 3.3.天然的天然的DNADNA分子可以直接用做基因工程载体吗分子可以直接用做基因工程载体吗？为什么？为什么？ 提示：基因工程中作为载体使用的提示：基因工程中作为载体使用的DNADNA分子很多分子很多都是质粒（都是质粒（plasmidplasmid），即独立于细菌拟核处染），即独立于细菌拟核处染色体色体DNADNA之外的一种可以自我复制、双链闭环的之外的一种可以自我复制、双链闭环的裸露的裸露的DNADNA分子。是否任何质粒都可以作为基因分子。是否任何质粒都可以作为基因工程载体使用呢？其实不然，作为基因工程使用工程载体使用呢？其实不然，作为基因工程