第10章 甾体激素类药物的分析-2-2013

1、药物分析学（第十五章）甾体激素类药物的分析（甾体激素类药物的分析（2）本节教师：本节教师： 韩海韩海 （博士（博士/副教授副教授 )暨南大学药学院暨南大学药学院Tel:-mail: QQ: 560118562013.11.11 第二节第二节 鉴别实验鉴别实验n1. 物理常数物理常数n2.化学鉴别化学鉴别:母核和各种官能团的反应母核和各种官能团的反应n呈色反应、呈色反应、n官能团反应：沉淀反应、卤素反应官能团反应：沉淀反应、卤素反应n3.制备衍生物测定熔点制备衍生物测定熔点n4. 紫外分光光度法紫外分光光度法n5. 红外分光光度法红外分光光度法n6.色谱法色谱法TLC、

2、HPLC物理常数物理常数 呈色反应呈色反应n （一）与强酸的呈色反应（一）与强酸的呈色反应（甾体母核）（甾体母核）n与硫酸、磷酸、高氯酸、盐酸等呈色与硫酸、磷酸、高氯酸、盐酸等呈色. .n硫酸呈色反应硫酸呈色反应应用最广应用最广n1)1)反应颜色最丰富反应颜色最丰富n2)2)灵敏度较高灵敏度较高n可能机制为浓硫酸与甾体的酮基质子化反可能机制为浓硫酸与甾体的酮基质子化反应，形成正碳离子，然后与应，形成正碳离子，然后与HSOHSO4 4- -作用。作用。与硫酸显色反应与硫酸显色反应 显显 色色 荧光荧光 加水稀释加水稀释泼尼松龙泼尼松龙 深红深红 絮状絮状灰灰泼尼松泼尼松 橙橙 黄黄蓝绿蓝绿炔雌醚

3、炔雌醚 橙红橙红 黄绿黄绿 红色红色 炔雌醇炔雌醇 橙红橙红 黄绿黄绿 絮状絮状玫红玫红醋酸可的松醋酸可的松 黄或微黄或微 褪色并澄褪色并澄 带橙带橙 清清n特点：操作简便，反应灵敏，通过形成的颜特点：操作简便，反应灵敏，通过形成的颜色或荧光的不同而互相区别，但操作条件不色或荧光的不同而互相区别，但操作条件不易掌握。易掌握。n某些甾体激素药物与某些甾体激素药物与硫酸硫酸乙醇或硫酸乙醇或硫酸甲甲醇醇作用而呈色。如甲睾酮作用而呈色。如甲睾酮.n雌性激素药物常以硫酸雌性激素药物常以硫酸乙醇的呈色反应来乙醇的呈色反应来鉴别鉴别. .n例例: : ChpChp中雌二醇鉴别中雌二醇鉴别n取本品约取本品约2

4、 2mlml，加硫酸加硫酸2 2mlml溶解，有黄绿色荧溶解，有黄绿色荧光，加三氯化铁试液光，加三氯化铁试液2 2滴呈草绿色，再加水稀滴呈草绿色，再加水稀释，则变为红色。释，则变为红色。 （二）官能团的呈色反应（二）官能团的呈色反应n利用官能团的呈色反应可区别不同的药物利用官能团的呈色反应可区别不同的药物n 1.C17-醇酮基的呈色反应醇酮基的呈色反应nC17-醇酮基有还原性，能与氧化剂醇酮基有还原性，能与氧化剂四氮四氮唑盐唑盐反应显色。反应显色。n例例:(ChpChp中中醋酸泼尼松鉴别醋酸泼尼松鉴别)n醋酸泼尼松在碱性条件下与醋酸泼尼松在碱性条件下与氯化三苯四氮氯化三苯四氮唑试液唑试液反应生

5、成红色。反应生成红色。n讨论讨论：n1).本反应亦可用于本反应亦可用于薄层色谱法鉴别薄层色谱法鉴别甾体激甾体激素类药物的显色反应。素类药物的显色反应。 （如醋酸泼尼松片及眼膏、醋酸氟氢可的（如醋酸泼尼松片及眼膏、醋酸氟氢可的松软膏等）松软膏等）n2).该呈色反应不仅能用做皮质激素类药物该呈色反应不仅能用做皮质激素类药物的的鉴别鉴别和和检查检查(“其他甾体其他甾体”的检查的检查)，也，也是该类药物是该类药物含量测定含量测定的依据。的依据。n3).C17-醇酮基还可以和醇酮基还可以和斐林试液、多伦斐林试液、多伦试液试液发生反应。发生反应。n 2.酮基的呈色反应酮基的呈色反应nC3-酮基酮基、C20

6、-酮基能与酮基能与2，4-二硝基苯肼、二硝基苯肼、异烟肼、硫酸苯肼等羰基试剂反应形成黄异烟肼、硫酸苯肼等羰基试剂反应形成黄色的腙。色的腙。n例如例如:氢化可的松，其乙醇溶液加新制的氢化可的松，其乙醇溶液加新制的硫酸苯肼试液，加热即显黄色。硫酸苯肼试液，加热即显黄色。n 3.甲酮基甲酮基以及以及活泼亚甲基活泼亚甲基能与亚硝铁氰能与亚硝铁氰化钠、间二硝基酚、芳香醛类反应呈色。化钠、间二硝基酚、芳香醛类反应呈色。n其中其中亚硝基铁氰化钠亚硝基铁氰化钠反应是黄体酮的灵敏、反应是黄体酮的灵敏、专属的鉴别方法。专属的鉴别方法。n在一定的条件下，黄体酮显蓝紫色，其他在一定的条件下，黄体酮显蓝紫色，其他常用甾

7、体激素均不显蓝紫色，而呈现淡橙常用甾体激素均不显蓝紫色，而呈现淡橙色或不显色。色或不显色。n 4. 4.酚羟基酚羟基的呈色反应的呈色反应nC C3 3为酚羟基的雌激素，能与为酚羟基的雌激素，能与重氮磺酸重氮磺酸反反 应生成红色偶氮染料。应生成红色偶氮染料。nJP(14)JP(14)收载的苯甲酸雌二醇利用该法进行收载的苯甲酸雌二醇利用该法进行鉴别。鉴别。含炔基的甾含炔基的甾体激素体激素（如炔雌醇、（如炔雌醇、炔诺酮等）炔诺酮等）白色炔银盐沉淀白色炔银盐沉淀硝酸银硝酸银5. 乙炔基沉淀反应乙炔基沉淀反应RCCHAgNO3RCCAgn 6. 有机卤素反应有机卤素反应有机氟有机氟F有机破坏有机破坏有机

8、氯有机氯Cl 茜素氟蓝茜素氟蓝 硝酸亚铈硝酸亚铈硝酸硝酸硝酸银硝酸银AgCl 呈色呈色 n卤素在母核上：卤素在母核上：氧瓶燃烧法破坏氧瓶燃烧法破坏n如地塞米松磷酸钠如地塞米松磷酸钠n卤素在侧链上：卤素在侧链上：加热水解法破坏加热水解法破坏n如丙酸倍氯他索如丙酸倍氯他索7.酯的反应酯的反应 KOHOCOCHR醇制醇制 OCOCHCHCH SOHOHHC C17或或C21位羟基酯，应先位羟基酯，应先水解水解；再根据羧酸的性；再根据羧酸的性质鉴别。质鉴别。例：醋酸酯类药物例：醋酸酯类药物戊酸、己酸戊酸、己酸酯类药物，有特臭。酯类药物，有特臭。 制备衍生物测定其熔点制备衍生物测定其熔点n原理原理n1.

9、甾醇、甾酮类药物可与一些试剂反应生成甾醇、甾酮类药物可与一些试剂反应生成酯、酯、肟、缩氨脲肟、缩氨脲. 测定其熔点进行鉴别。测定其熔点进行鉴别。n2.利用醇制碱液水解甾体酯类生成相应的母体，利用醇制碱液水解甾体酯类生成相应的母体，测定其熔点进行鉴别。测定其熔点进行鉴别。n特点特点n繁琐费时，但专属性强繁琐费时，但专属性强.目前仍为一些国家药典目前仍为一些国家药典采用。采用。HO+COClKOHCOO+KCl+H2O炔雌醇炔雌醇m.p.201OCCH3O+2HONH2NCHOCH3NOH+2H2O黄体酮黄体酮双肟m.p.238苯丙酸诺龙苯丙酸诺龙缩氨基脲缩氨基脲m.p.178185分解分解OCO

10、CH2CH2OC6H5+NH2CNHNH2OHClNCH2NOH+H2O+HAcOCOCH2CH2N+H2OOHO+CH3CH2COOHOCOCH2CH3OKOH丙酸睾丸素丙酸睾丸素m.p.150156紫外分光光度法紫外分光光度法n原理原理：n具有具有C=C-C=O共轭系统，共轭系统，n -3-3-酮酮 240240nmnmn和和C=C-C=C共轭系统，共轭系统，n苯环（苯环（B B带：带：280280nmnm，K K带：带：220220nm nm ）n1.可用规定波长处的吸收度鉴别可用规定波长处的吸收度鉴别n如如:曲安西龙曲安西龙n2. 吸收度的比值法。吸收度的比值法。n如如: 丙酸倍氯米松

11、丙酸倍氯米松-3-3-酮酮 240240nmnm 红外分光光度法红外分光光度法n必要性必要性n1.许多重要的甾体激许多重要的甾体激素药物紫外光谱非常素药物紫外光谱非常相似，紫外光谱鉴别相似，紫外光谱鉴别缺乏专属性。缺乏专属性。n2.甾体激素药物化学甾体激素药物化学结构上仅有微小的差结构上仅有微小的差异，也难以用化学鉴异，也难以用化学鉴别法来区分。别法来区分。红外分光光度法的优势红外分光光度法的优势n1.对样品无破坏对样品无破坏, 样品用量较少样品用量较少 n2.特征性特征性极强、极强、 信息量丰富信息量丰富: n每种化合物每种化合物都有红外吸收，从红外光谱可以得都有红外吸收，从红外光谱可以得到

12、大量信息。到大量信息。官能团区官能团区的吸收反映了化合物中的吸收反映了化合物中官能团的特征，而官能团的特征，而指纹区指纹区的吸收对于指认分子的吸收对于指认分子提供了可靠的依据。提供了可靠的依据。红外分光光度法的应用红外分光光度法的应用n各国药典几乎均采用红外分光光度法鉴各国药典几乎均采用红外分光光度法鉴别甾体激素原料药物，中国药典中别甾体激素原料药物，中国药典中36种种甾体激素原料药物，其中甾体激素原料药物，其中33种采用该方种采用该方法鉴别！法鉴别！鉴别方法鉴别方法:按规定录制红外光按规定录制红外光谱图，要求供试品谱图，要求供试品光谱图与对照品光光谱图与对照品光谱图一致。谱图一致。甾体激素药

13、物的红外光谱特征甾体激素药物的红外光谱特征n红外光谱主要反映了化合物中官能团的红外光谱主要反映了化合物中官能团的特征特征.n甾体药物中有那些红外活性基团甾体药物中有那些红外活性基团?n1.基本骨架：基本骨架：n大量的大量的CHCH3 3、CHCH2 2、CHCH基团基团n.n. C-H 15001300 cm-1CH3 2962 cm-1，反对称伸缩振动反对称伸缩振动 2872 cm-1 ，对称伸缩振动对称伸缩振动 CH2 2926 cm-1，反对称伸缩振动反对称伸缩振动 2853 cm-1 ，对称伸缩振动对称伸缩振动 HC 29702850cm-11375 cm-1处的吸收分叉，等高处的吸收

14、分叉，等高CHH3CH3CCH31460，1375 cm-1同时有吸收同时有吸收伸缩伸缩振动振动弯曲弯曲振动振动n2.此类药物大部分含有此类药物大部分含有C=C双键双键a. CH伸缩振动频率大于伸缩振动频率大于3000cm-1（峰尖、弱）大约峰尖、弱）大约3040 3010cm-1 b. CC伸缩振动频率在伸缩振动频率在16201585cm-1, （峰尖、中等）峰尖、中等）c.CH（面外弯曲振动频率）与双键上氢面外弯曲振动频率）与双键上氢的数目，即取代情况有关。的数目，即取代情况有关。n3.此类药物大部分含有羰基此类药物大部分含有羰基n羰基峰极强羰基峰极强, 鉴别价值大鉴别价值大.n C=O

15、六员环六员环 17201705cm-1n C=O 五员环五员环 17491742cm-1n C=O C20 17101706cm-1n C=O 4 3 酮酮16841620cm-1n4.此类药物还可能含有羟基、醚键等特此类药物还可能含有羟基、醚键等特征结构。征结构。甾体激素药物某些基团的红外特征频率甾体激素药物某些基团的红外特征频率n见书见书292-293页表页表10-3n炔雌醇的红外吸收光谱炔雌醇的红外吸收光谱CHOHHHOHCH结构特征：结构特征：苯环、酚羟基、苯环、酚羟基、C17 OH C17 乙炔基乙炔基1505cm-1OH 3505cm -13300cm-1CH CC 1590cm-

16、13610cm-1OH 酚羟基酚羟基醇羟基醇羟基1616cm-1苯环的骨苯环的骨架振动架振动CHOHHHOHCH亚甲基、角甲基亚甲基、角甲基吸收带吸收带CH苯环指纹区苯环指纹区COHHHCH3O黄体酮黄体酮薄层色谱法薄层色谱法n特点特点：n简便、快速、分离效能高。简便、快速、分离效能高。n主要用于甾体激素类药物主要用于甾体激素类药物制剂的鉴别制剂的鉴别nChPChP很多甾体激素制剂均用该法鉴别。很多甾体激素制剂均用该法鉴别。n应用范围应用范围：n甾体激素制剂的鉴别、纯度检查以及含甾体激素制剂的鉴别、纯度检查以及含量测定前的分离和制剂稳定性的研究。量测定前的分离和制剂稳定性的研究。 方法方法：对

17、照品法对照品法 1.供试品点样通常需做供试品点样通常需做前处理前处理（如有机溶剂提（如有机溶剂提取），消除注射液、片剂及软膏剂等辅料的干扰。取），消除注射液、片剂及软膏剂等辅料的干扰。 2.要求供试品溶液所显主斑点的要求供试品溶液所显主斑点的颜色颜色和和位置位置与对与对照品溶液的主斑点相同。照品溶液的主斑点相同。显色方法显色方法：多用：多用荧光显色法或荧光淬灭法荧光显色法或荧光淬灭法荧光显色荧光显色高效液相色谱法高效液相色谱法n主要用于甾体激素类药物制剂的鉴别主要用于甾体激素类药物制剂的鉴别 方法：方法：对照品法对照品法 一般在含量测定的同时进行鉴别一般在含量测定的同时进行鉴别. 要求在含量测

18、定项下记录的色谱图中，要求在含量测定项下记录的色谱图中，供试品峰的供试品峰的t tR R与对照品峰的与对照品峰的t tR R一致。一致。第三节、特殊杂质检查第三节、特殊杂质检查n 必要性必要性 ：甾体激素药物多由结构改造来，甾体激素药物多由结构改造来，可能带来可能带来原料、中间体、异构体、降解产原料、中间体、异构体、降解产物物以及以及试剂、溶剂试剂、溶剂等。等。n药典规定检查的重要项目有：药典规定检查的重要项目有： n（一）其他甾体（一）其他甾体n（二）硒（二）硒n（三）有机溶剂残留量（三）有机溶剂残留量 n（四）游离磷酸盐（四）游离磷酸盐 n此外，有些甾体药物还规定其他检查项目。此外，有些甾

19、体药物还规定其他检查项目。OHH3COOHH3COOHOLi/NH3 C2H5OH（可能残留）可能残留）弱酸弱酸雌二醇雌二醇3甲醚甲醚（可能残留）可能残留）苯丙酸诺龙苯丙酸诺龙的合成路线的合成路线I（可能残留）可能残留）II（可能残留）可能残留）OHOOCO(CH2)2-C6H5O强酸强酸（可能残留）可能残留）苯丙酰氯苯丙酰氯（可能残留）可能残留）HClIII（可能残留）可能残留）OHO苯丙酸诺龙苯丙酸诺龙的合成路线的合成路线II（一）其他甾体（一）其他甾体 定义定义：药物中存在的：药物中存在的具有甾体结构且与具有甾体结构且与标示药物结构不同标示药物结构不同的其他化合物都称为的其他化合物都称为

20、 “其他甾体其他甾体”。 具有互相不同的药理作用！具有互相不同的药理作用！ 有必要检查有必要检查来源来源：原料、中间体、异构体、降解产物：原料、中间体、异构体、降解产物特点特点：（1）可能存在）可能存在多个多个甾体杂质甾体杂质 （2）结构）结构类似类似，多数为，多数为未知物质未知物质分析方法必须分析方法必须具有一定具有一定分离分离能力能力其他甾体检查法其他甾体检查法n （一）一）TLC检查法（高低浓度对比法）检查法（高低浓度对比法）n使用使用最为普遍最为普遍的甾体特殊杂质检查法的甾体特殊杂质检查法n采用采用供试品的稀释溶液供试品的稀释溶液做对照，以做对照，以对照溶液斑对照溶液斑点颜色点颜色为参

21、比来控制杂质限量。为参比来控制杂质限量。n中国药典中国药典2002005 5版版3636种甾体激素原料药物，其中种甾体激素原料药物，其中3333种采用该方法检查特殊杂质！种采用该方法检查特殊杂质！n例：教材例：教材2 29494页醋酸泼尼松、炔雌醇的杂质检查页醋酸泼尼松、炔雌醇的杂质检查 3333种甾体激素药物种甾体激素药物TLCTLC色谱条件的特点总结色谱条件的特点总结 ： 1. 1.薄层板：大多采用薄层板：大多采用硅胶硅胶G G板板，少数采用硅胶，少数采用硅胶GFGF254254或硅胶或硅胶HFHF254254。 2. 2.溶剂溶剂: : 氯仿氯仿- -甲醇甲醇/ /甲醇甲醇/ /氯仿氯仿

22、/ /丙酮丙酮 3. 3.展开剂系统：首选不同比例的展开剂系统：首选不同比例的二氯甲烷二氯甲烷- -乙醚乙醚- -甲甲醇醇- -水水混合溶剂。（其他：苯混合溶剂。（其他：苯/ /无水乙醇无水乙醇/ /二氯甲烷二氯甲烷- -甲醇甲醇- -水水/ /氯仿氯仿- -甲醇等）甲醇等） 4. 4.显色剂：首选显色剂：首选碱性四氮唑蓝试液碱性四氮唑蓝试液。 （其他：硫酸（其他：硫酸- -乙醇乙醇/ /浓硫酸浓硫酸/10%/10%磷钼酸磷钼酸- -乙醇）乙醇） 5. 5.检测法：紫外灯检测法：紫外灯(254(254nm/365nm)nm/365nm)/ /日光检视日光检视。TLC判定方法判定方法v 规定杂质

23、斑点规定杂质斑点数目数目v 规定杂质斑点规定杂质斑点颜色颜色 供试品溶液如显杂供试品溶液如显杂质斑点，不得多于质斑点，不得多于XX个，其颜色与对个，其颜色与对照液的主斑点比较，照液的主斑点比较，不得更深。不得更深。 高低浓度对比法高低浓度对比法雌二醇杂质检查雌二醇杂质检查TLCTLC图图特点：特点： （1 1）简便易行，不需）简便易行，不需特殊的仪器；特殊的仪器； （2 2）不需对照品不需对照品；（3 3）要求杂质斑点与主）要求杂质斑点与主成分斑点的颜色相近成分斑点的颜色相近且显色灵敏度也接近。且显色灵敏度也接近。（4 4）不能控制全部杂质不能控制全部杂质的限量；也不能控制的限量；也不能控制杂

24、质的总量杂质的总量自身对照自身对照（二）二）HPLC法法n方法方法：n1.自身对照法（加自身对照法（加/不加校正因子）不加校正因子）n采用采用供试品的稀释溶液供试品的稀释溶液做对照，以做对照，以对照对照溶液主峰面积溶液主峰面积为参比来控制杂质限量。为参比来控制杂质限量。n例：教材例：教材2 29595页黄体酮杂质检查为页黄体酮杂质检查为不加不加校正因子的自身对照法。校正因子的自身对照法。n 2.主成分归一化法（主成分归一化法（HPLC-UV法检测法检测灵敏度较低时）灵敏度较低时）对照溶液0.02mg/ml供试液1 mg/ml黄体酮黄体酮中中有关物质有关物质检查检查供试品溶液的杂质峰供试品溶液的

25、杂质峰数不得超过数不得超过1 1个，其面个，其面积不得大于对照液的积不得大于对照液的主峰面积的主峰面积的3/43/4n 甾体激素药物甾体激素药物HPLCHPLC色谱条件的色谱条件的特点总结特点总结 ：n1.1.色谱柱：色谱柱：十八烷基硅烷键和硅胶十八烷基硅烷键和硅胶。 2. 2.流动相：各种不同比例的流动相：各种不同比例的甲醇甲醇- -水水混合混合溶剂。溶剂。 3. 3.检测器：紫外（检测器：紫外（214214nm/254nm/281nmnm/254nm/281nm，230nm/288nm230nm/288nm） 4. 4.判定方法判定方法: :规定杂质峰规定杂质峰数目数目 规定杂质峰规定杂质

26、峰面积面积HPLC法进行药物特殊杂质检查的法进行药物特殊杂质检查的特点特点 （1）需特殊的仪器；）需特殊的仪器； （2）不需对照品；）不需对照品； （3）可以控制杂质的总量可以控制杂质的总量； （4）杂质与主成分测定的灵敏度杂质与主成分测定的灵敏度可可以不同以不同。（用校正因子消除）。（用校正因子消除）（二）硒的检查（二）硒的检查来源来源 合成中用二氧化硒合成中用二氧化硒( (SeOSeO2 2) )脱氢脱氢原理原理nmA 环环己己烷烷苯苯并并苯苯硒硒二二唑唑二二氨氨基基萘萘 ,Se, .pH SeSe盐酸羟胺盐酸羟胺氧瓶燃烧氧瓶燃烧方法方法剧毒剧毒含硒物质含硒物质限量限量0.01%0.01%

27、（三）有机残留溶剂的检查（三）有机残留溶剂的检查n 必要性必要性 ：甾体激素药物在生产工艺中使：甾体激素药物在生产工艺中使用大量用大量有机溶剂有机溶剂。（特别是甲醇和丙酮）。（特别是甲醇和丙酮）n测定法：测定法：GCGC法法n示例示例 ：地塞米松磷酸钠有机残留溶剂的：地塞米松磷酸钠有机残留溶剂的检查方法。（教材检查方法。（教材396396页）页）判定标准判定标准1.甲醇甲醇 不得超过不得超过0.3%（g/g） 2.丙酮丙酮 不得超过不得超过0.5%（g/g） 内标法内标法 + 校正因子定量校正因子定量!限量确定的原则限量确定的原则药品注册的国际技术要求（药品注册的国际技术要求（ICHICH）规

28、定规定 甲醇甲醇第二类毒性溶剂第二类毒性溶剂限量限量0.3% 100） UV法法含量测定含量测定n与羰基试剂（异烟肼）反应与羰基试剂（异烟肼）反应 异烟肼比色法异烟肼比色法n2. C C1717 醇酮基（皮质激素）醇酮基（皮质激素）n还原性还原性 与氧化剂四氮唑盐反应显色与氧化剂四氮唑盐反应显色 四氮唑比色法四氮唑比色法n3.甾体母核（特别是雌激素母核）甾体母核（特别是雌激素母核）n可以以强酸的呈色可以以强酸的呈色 Kober反应比色法反应比色法n甾类药物含量测定方法有：甾类药物含量测定方法有：n1.反应比色法反应比色法（异烟肼比色法（异烟肼比色法、四氮唑比四氮唑比色法色法、Kober反应比色

29、法）反应比色法）n2.紫外分光光度法紫外分光光度法n3.高效液相色谱法高效液相色谱法n4.柱前衍生化柱前衍生化气相色谱法、气相色谱法、GC-MS法法n5.放射免疫分析法（放射免疫分析法（FIA），），ELISA技术技术一、一、高效液相色谱法高效液相色谱法n必要性必要性：甾体激素类药物常含有结构甾体激素类药物常含有结构相似的其他甾体杂质，对利用结构特相似的其他甾体杂质，对利用结构特征设计的比色法有干扰。征设计的比色法有干扰。n优点优点：用样量少，灵敏度高，用样量少，灵敏度高，分离效分离效果好，专属性强果好，专属性强 ChP中：中：89种种甾体激素原料和制剂甾体激素原料和制剂，有，有43种采种采用

30、用RP-HPLC法（一般用内标法）含量测定，法（一般用内标法）含量测定，占该类药物含量测定方法的占该类药物含量测定方法的48%，居首位，居首位。n实例实例：教材：教材397页页n特点总结特点总结：n1.分离模式分离模式: 反相分配反相分配色谱色谱n2.固定相固定相: 十八烷基硅烷键合硅胶十八烷基硅烷键合硅胶(ODS)n3.流动相流动相: 甲醇和水的混合液甲醇和水的混合液 ( (个别采用甲醇个别采用甲醇水水乙醚、乙腈乙醚、乙腈- -水水- -乙丙醇、乙丙醇、甲醇甲醇- -四氢呋喃四氢呋喃- -水等溶剂系统，有时在流动相水等溶剂系统，有时在流动相中加入中加入醋酸盐缓冲液醋酸盐缓冲液或或磷酸盐缓冲液

31、磷酸盐缓冲液调节调节pHpH值）值）n4.紫外直接检测紫外直接检测: (240nm或或280nm附近附近)n4 43 3酮基和苯环酮基和苯环二、紫外分光光度法二、紫外分光光度法n1.皮质激素、雄性激素、孕激素皮质激素、雄性激素、孕激素n4-3-酮基（酮基（C=C-C=O）共轭系统共轭系统nmax=240nmn 2. 雌激素（具有苯环）雌激素（具有苯环）n苯环（苯环（C=C-C=C）共轭系统，共轭系统，nmax=280nm（此吸收较弱）此吸收较弱）UV化合物结构max(nm)肾上腺皮质激素雄性激素孕激素雌激素2804-3-酮240醋酸地塞米松n优点优点：准确准确、简便，被广泛用于原料、简便，被广

32、泛用于原料和制剂的分析。和制剂的分析。n原料、注射液稀释成原料、注射液稀释成一定浓度一定浓度后即可直后即可直接测定。接测定。n但在但在片剂分析时需要预处理排除干扰。片剂分析时需要预处理排除干扰。 （赋形剂在（赋形剂在240240nmnm附近有吸收，需先用一附近有吸收，需先用一定溶剂提取、滤过。）定溶剂提取、滤过。）nChpChp中收载的中收载的89种甾体激素原料和制剂种甾体激素原料和制剂2525种用该法测定含量，占本类药物分析种用该法测定含量，占本类药物分析的的28%28%，仅次于，仅次于HPLCHPLC，居居第二位第二位。但现但现在正在被在正在被HPLCHPLC取代中！取代中！实例实例n1.

33、原料药原料药:n教材教材398页页: 炔雌醚炔雌醚n2.片剂片剂:n教材教材398页页: 醋酸泼尼松龙片醋酸泼尼松龙片n赋形剂在赋形剂在240240nmnm附近有吸收，需先用乙附近有吸收，需先用乙醇提取、滤过。醇提取、滤过。n计算计算 三、反应比色法三、反应比色法n方法介绍方法介绍:n比色法比色法: : 直接比色法直接比色法光度活性药物光度活性药物 反应比色法反应比色法非光度活性药物非光度活性药物弱、非光度活弱、非光度活性药物性药物强光度活性强光度活性药物药物化学反应化学反应优点优点：1. 适用于非光度活性药物适用于非光度活性药物2. 使待测组光谱位移，避免干扰，使待测组光谱位移，避免干扰，增

34、加选择性增加选择性3. 增加测定灵敏度增加测定灵敏度甾体激素的反应比色法甾体激素的反应比色法n异烟肼比色法异烟肼比色法、四氮唑比色法四氮唑比色法、Kober反反应比色法应比色法n（一）、异烟肼比色法（一）、异烟肼比色法n原理原理：异异烟烟腙腙（黄黄）异异烟烟肼肼酮酮基基（或或其其它它）3CHCl（缩合）（缩合）在一定波长下在一定波长下具有最大吸收具有最大吸收 四氮唑比色法四氮唑比色法 n基本原理：肾上腺皮质激素类基本原理：肾上腺皮质激素类C17-醇酮醇酮基具有还原性，在强碱性溶液中能将四基具有还原性，在强碱性溶液中能将四氮唑盐氮唑盐定量地还原定量地还原为有色甲为有色甲 n多为红色或蓝色。多为红

35、色或蓝色。n formazan在一定波长处进行比色测定。在一定波长处进行比色测定。 有有色色甲甲瓒瓒四四氮氮唑唑盐盐醇醇酮酮基基 COH -还原还原反应机理反应机理nC17-醇酮基失去醇酮基失去2个电子氧化为个电子氧化为20-酮基酮基-21醛基，在碱催化下，分子内部重排。醛基，在碱催化下，分子内部重排。n而四氮唑盐得到而四氮唑盐得到2个电子，开环形成甲个电子，开环形成甲而显色。而显色。四氮唑盐的种类四氮唑盐的种类n1.氯化三苯四氮唑氯化三苯四氮唑n2，3，5-三苯基氯化四氮唑三苯基氯化四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazolium chlorid，TTC）n其还原产物为不溶于水的

36、其还原产物为不溶于水的深深红色红色三苯甲三苯甲(max:480490nm) 红四氮红四氮唑（唑（red tetrazoline，RT）。n2.蓝四氮唑蓝四氮唑（blue tetrazoline，BT），），即即3，3-二甲氧苯基二甲氧苯基-双双-4，4-（3，5-二二苯基）氯化四氮唑苯基）氯化四氮唑3，3-dianisole-bis4，4-（3，5-diphenyl）tetrazolium chloriden其还原产物为其还原产物为暗蓝色暗蓝色的双甲的双甲 ，max525nm。测定方法测定方法对照品法对照品法ChP TTC（RT） BP TTC（RT）USP BT 氢氢氧氧化化四四甲甲基基铵铵

37、对对照照液液供供试试液液ATTC4045暗暗Anm测定测定485实例：醋酸地塞米松磷酸钠含量测定实例：醋酸地塞米松磷酸钠含量测定nChP方法方法供试液：供试液：精密量取本品精密量取本品5 mL （约醋酸地塞米约醋酸地塞米松松25 mg），），置置100mL量瓶中，加无水乙醇量瓶中，加无水乙醇振摇使溶解，并稀释至刻度，摇匀。滤过，振摇使溶解，并稀释至刻度，摇匀。滤过，取续滤液为供试品溶液。取续滤液为供试品溶液。 对照液：对照液：精密称取醋酸地塞米松磷酸钠标准品精密称取醋酸地塞米松磷酸钠标准品25 mg，置置100mL量瓶中，加无水乙醇振摇量瓶中，加无水乙醇振摇使溶解，并稀释至刻度，摇匀。使溶解，

38、并稀释至刻度，摇匀。测定法：测定法：精密量取上述溶液各精密量取上述溶液各1 mL，分别分别置置干燥具塞试管干燥具塞试管中，各中，各精密加无水乙醇精密加无水乙醇9 mL与氯化三苯四氮唑试液与氯化三苯四氮唑试液1 mL，摇摇匀，再各匀，再各精密加氢氧化四甲基铵试液精密加氢氧化四甲基铵试液1 mL，摇匀，在摇匀，在25暗处放置暗处放置4050分分钟，照分光光度法，在钟，照分光光度法，在485 nm的波长处的波长处分别测定吸收度，计算。分别测定吸收度，计算。操作应避光。操作应避光。水分影响水分影响反应速度反应速度制造强碱制造强碱性环境性环境反应过程、反应产反应过程、反应产物怕光物怕光讨论讨论各种因素的

39、影响各种因素的影响n1.1.基团的影响基团的影响：C11= O C11OHC21OH C21-酯酯C16无论何种取代基无论何种取代基2. 2. 溶剂、水分的影响溶剂、水分的影响含水量含水量5%含水含水10%A10%含水含水30%几无反应几无反应 无水乙醇无水乙醇醛醛 A 无醛无水乙醇无醛无水乙醇C20C21ABCD12345678910111213141516171819n3.3.碱的种类和加入顺序的影响碱的种类和加入顺序的影响：反应应在反应应在强碱性强碱性（pH13.75）条件下进行条件下进行以以氢氧化四甲基铵氢氧化四甲基铵的结果最佳的结果最佳. 皮质激素和氢氧化四甲基铵长时间（皮质激素和氢

40、氧化四甲基铵长时间（2424h h）接触后，部分分解接触后，部分分解. .加入顺序：加入顺序：氢氢氧氧化化四四甲甲基基铵铵试试液液四四氮氮唑唑盐盐皮皮质质激激素素溶溶液液4. 4. O O2 2与光线的影响与光线的影响反应过程反应过程反应产物反应产物怕光怕光避光、快速避光、快速O O2 2影响影响颜色强颜色强度和稳度和稳定性定性隔绝空气、隔绝空气、 快速、充快速、充N2N2n5. 5. 温度与时间温度与时间ntn但但t 甲甲 分解分解%n一般以室温或一般以室温或30恒温条件下显色，恒温条件下显色，易得重现性较好的结果。易得重现性较好的结果。ChP 25 4045BP 30 1h特点：特点：缺点

41、缺点 影响因素太多，操作不易掌握。影响因素太多，操作不易掌握。优点优点 专属性很好专属性很好。意义：测定结果能指示药品的稳定性（氧意义：测定结果能指示药品的稳定性（氧化及降解产物无此反应）化及降解产物无此反应） 广泛应用于皮质激素的稳定性研究。广泛应用于皮质激素的稳定性研究。OOHCH3NCONHN H2OHCH3CONHNN+_H2O异烟肼比色法异烟肼比色法n反应式反应式：具有两个酮基的甾体激素具有两个酮基的甾体激素黄体酮、氢化可的松黄体酮、氢化可的松可可形成形成双腙双腙。 方法方法 ：对照品法：对照品法： 异异烟烟肼肼挥挥去去乙乙醇醇对对照照液液供供试试液液A CHCl暗暗45实例：实例：

42、nChP：倍他倍他米松米松倍他米松磷酸钠倍他米松磷酸钠倍他米松倍他米松讨论讨论n1.1.溶剂选择：溶剂选择：无水乙醇和无水甲醇无水乙醇和无水甲醇好，好，其他溶剂受异烟肼盐酸盐溶解度影响不其他溶剂受异烟肼盐酸盐溶解度影响不宜采用。宜采用。n甲醇稳定性较好，呈色强度较高。但对甲醇稳定性较好，呈色强度较高。但对植物油溶解度小。一般采用无水乙醇作植物油溶解度小。一般采用无水乙醇作为整个反应的介质。（为整个反应的介质。（倍他米松、倍他米倍他米松、倍他米松磷酸钠等）松磷酸钠等）n2.2.酸的种类和浓度以及异烟肼的浓度：酸的种类和浓度以及异烟肼的浓度：n酸与异烟肼试剂的摩尔比为酸与异烟肼试剂的摩尔比为2:1

43、2:1时可获得时可获得最大吸收度。最大吸收度。n酸度酸度异烟肼盐异烟肼盐n酸度酸度 AAn试液配制试液配制:n取异烟肼取异烟肼75mg75mg，加盐酸加盐酸0.0.1m11m1加甲醇使加甲醇使溶解成溶解成1 10000mlml。盐酸：盐酸：0.00740.0074mol/Lmol/L（硫酸：（硫酸：0.00370.0037mol/Lmol/L 醋酸：醋酸：4.44.4mol/Lmol/L）异烟肼：异烟肼：0.003650.00365mol/Lmol/L n3.3.水分、水分、O O2 2与光线的影响与光线的影响n(1)(1)水分增高吸收度降低，缩合物水解；水分增高吸收度降低，缩合物水解；n可逆

44、反应可逆反应:n含水量含水量腙水解腙水解A%n故仪器及试剂应尽量避免水分故仪器及试剂应尽量避免水分n(2)(2)温度升高，反应加速。温度升高，反应加速。n(3)(3)在不挥发溶剂、不吸收水分时，光与在不挥发溶剂、不吸收水分时，光与氧不影响反应。氧不影响反应。（具塞容器）（具塞容器）n4.4.反应的专属性：反应的专属性：n反应速度反应速度C3 = O C17= O 、 C20= O C11= O 不反应不反应室温不到室温不到1 1h h即可定量即可定量地与酸性异烟肼反应地与酸性异烟肼反应长时间放置或加热长时间放置或加热后方可反应完全后方可反应完全本法对本法对4 4-3-3-酮基甾体酮基甾体具有一

45、定的专属性。具有一定的专属性。C20C21ABCD12345678910111213141516171819KOBER反应比色法反应比色法n定义定义：指：指雌激素雌激素与硫酸与硫酸-乙醇共热呈色，乙醇共热呈色，用水或稀硫酸稀释后重新加热发生颜色用水或稀硫酸稀释后重新加热发生颜色改变，并在改变，并在515nm附近有最大吸收。附近有最大吸收。n原理：（两步反应）原理：（两步反应）max=465max=515桃桃红红黄黄色色雌雌激激素素乙乙醇醇 OHSOHOHCH3O SOHCH3CH3O SOHCH3CH3O实线实线第一步反应第一步反应虚线虚线第二步反应第二步反应n可能原理可能原理（了解）（了解）

46、n通过通过去羟基、重排及甲基由去羟基、重排及甲基由C13移到移到C17；然后被硫酸氧化形成具有较长共轭双键发然后被硫酸氧化形成具有较长共轭双键发色团的产物色团的产物 又进一步生成具有吸收光又进一步生成具有吸收光谱红移发色团的产物。谱红移发色团的产物。max=515nm实例实例nChP 复方炔诺酮滴丸中炔雌醇片的含量复方炔诺酮滴丸中炔雌醇片的含量测定方法测定方法n教材教材402页页缺点：缺点：1.第二步反应难以彻底第二步反应难以彻底进行，会出现双色。进行，会出现双色。 2. 辅料，赋形剂干扰测定辅料，赋形剂干扰测定改进铁酚试剂法铁酚试剂法五、体内甾体激素类药物分析（了解）五、体内甾体激素类药物分

47、析（了解）四、非水滴定四、非水滴定米非司酮米非司酮Doping control滥用药物检测刺激剂刺激剂麻醉剂麻醉剂-阻断剂阻断剂利尿剂利尿剂遮蔽剂遮蔽剂合成类固醇及合成类固醇及22激动剂激动剂肽类激素肽类激素外源性内源性1、甾体激素类药物的结构中能和四、甾体激素类药物的结构中能和四氮唑盐发生显色反应的基团氮唑盐发生显色反应的基团 A. 酚羟基酚羟基 B. 活泼次甲基活泼次甲基 C. 甲酮基甲酮基 D. C17 -醇酮基醇酮基 E. 酮基酮基2、用异烟肼比色法测定甾体激素药物含、用异烟肼比色法测定甾体激素药物含量时，其溶液的环境是量时，其溶液的环境是 A酸性酸性 B中性中性 C强碱性强碱性 D弱