第一章 蛋白质

1、生物大分子的结构与功能生物大分子的结构与功能u蛋白质 生命功能的执行者u核酸 基因信息的传递u酶 生物催化剂蛋白质的结构与功能第第 一一 章章Structure and Function of Protein概述概述u元素组成与基本单位 平均含氮量 氨基酸u分子结构 结构层次u结构与功能的关系u理化性质与分离纯化蛋 白 质 的 分 子 组 成The Molecular Component of Protein第第 一一 节节蛋白质的元素组成u主要：主要：C、H、O、N和和S。平均含氮量：平均含氮量：1616u次要：次要：磷、磷、金属元素以及碘金属元素以及碘 。一、氨基酸 构建蛋白质的基本单位u

2、编码氨基酸二十种编码氨基酸二十种u除脯氨酸和甘氨酸外，其余均属于除脯氨酸和甘氨酸外，其余均属于L-氨基酸。氨基酸。手性手性L-氨基酸的基本结构C CH HH H2 2N NCOOHCOOHR R碳原子碳原子, ,不对称碳原子不对称碳原子侧链侧链Chiral carbon氨基酸的名称与符号（一）氨基酸的分类u非极性疏水性氨基酸：7种u极性氨基酸：13种极性中性氨基酸：8种酸性氨基酸： Asp Glu （两个羧基）碱性氨基酸： Lys Arg（两个氨基） His按R侧链基团的极性极性：极性极性其它分类其它分类u芳香族氨基酸Phe、Trp、Tyru含羟基的氨基酸Tyr、Ser、Thr几种特殊氨基酸几

3、种特殊氨基酸 Pro Pro（亚氨基酸）（亚氨基酸）CH2CHCOO-NH2+CH2CH2CH2CHCOO-NH2+CH2CH2-OOC-CH-CH2-S+NH3S-CH2-CH-COO-+NH3-OOC-CH-CH2-S+NH3S-CH2-CH-COO-+NH3 Cys Cys +胱氨酸胱氨酸二硫键二硫键-HH-OOC-CH-CH2-SH+NH3-OOC-CH-CH2-SH+NH3HS-CH2-CH-COO-+NH3HS-CH2-CH-COO-+NH3（二）氨基酸的理化性质（二）氨基酸的理化性质u 两性解离两性解离 两性电解质两性电解质 ampholyte 等电点等电点(isoelectri

4、c point, pI) w 溶液的溶液的pH值值w 兼性离子兼性离子pH=pI+OH-pHpI+H+OH-+H+pH 蓝紫色蓝紫色化合物化合物570nm570nm吸收值吸收值氨基酸的含量氨基酸的含量定量分析定量分析茚茚三酮反应三酮反应二、肽u肽肽键键(peptide bond)氨基酸的羧基与氨基脱水缩合而形成氨基酸的羧基与氨基脱水缩合而形成酰酰胺键胺键u寡寡肽肽(oligopeptide)：10u多多肽肽(polypeptide): C=O H- -N。蛋白质分子中氢键的形成蛋白质分子中氢键的形成H在蛋白质分子中，由于存在数目众多的氢键，在蛋白质分子中，由于存在数目众多的氢键，故氢键在稳定故

5、氢键在稳定蛋白质蛋白质的空间结构上起着重要的空间结构上起着重要的作用。的作用。但氢键的但氢键的键能键能较低（较低（12 kJ/mol），），易被破易被破坏。坏。 2. 疏水键：疏水键：非极性物质在含水的极性环境中存在时，会相非极性物质在含水的极性环境中存在时，会相互 聚 集 ， 称 为互 聚 集 ， 称 为 疏 水 键疏 水 键 或或 疏 水 作 用 力疏 水 作 用 力（hydrophobic interaction）。（假力）。（假力）蛋白质分子中的许多蛋白质分子中的许多氨基酸残基侧链也是氨基酸残基侧链也是非极性的，这些非极非极性的，这些非极性的基团在含水环境性的基团在含水环境中也可相互聚

6、集，形中也可相互聚集，形成疏水键，如成疏水键，如Leu，Ile，Val，Phe，Ala等的侧链基团。等的侧链基团。3. 离子键：离子键：离子键离子键，又称为，又称为盐键（盐键（salt bond）是由带是由带正正电荷电荷基团与带基团与带负电荷负电荷基团之间相互吸引而形基团之间相互吸引而形成的化学键。成的化学键。在近中性环境中，蛋白质分子中的在近中性环境中，蛋白质分子中的酸性酸性氨基氨基酸残基侧链电离后带负电荷，而酸残基侧链电离后带负电荷，而碱性碱性氨基酸氨基酸残基侧链电离后带正电荷，二者之间可形成残基侧链电离后带正电荷，二者之间可形成离子键。离子键。 蛋白质分子中离子键的形成蛋白质分子中离子键

7、的形成4范德华氏力（范德华氏力（van der Waals force)：分子间存在的相互作用力。分子越大该力分子间存在的相互作用力。分子越大该力越强。与物质的聚集有关。越强。与物质的聚集有关。它对物质的沸点、熔点、气化热、熔化热、溶解度溶解度、表面张力、粘度粘度等性质有决定性的影响。 维系蛋白质分子构象的非共价键维系蛋白质分子构象的非共价键蛋白质分子中蛋白质分子中某一段某一段肽肽链的链的主链空间构象主链空间构象定义定义 维系键：维系键： 氢键氢键 二级结构二级结构 secondary structure两个肽平面以一个C为中心发生旋转二面角二面角 - -螺旋螺旋 ( -helix ) - -

8、折叠折叠 ( -pleated sheet ) - -转角转角 ( -turn ) 无规卷曲无规卷曲 ( random coil ) 蛋白质二级结构的主要形式蛋白质二级结构的主要形式自然界中的螺旋结构自然界中的螺旋结构旋转楼梯旋转楼梯压缩弹簧压缩弹簧 -螺旋螺旋u-螺旋结构特征为：螺旋结构特征为： (1) (1) 主要为主要为右手螺旋右手螺旋 (2) (2) 螺旋以螺旋以氢键氢键维系维系1-41-4 (3) 3.6/ (3) 3.6/圈圈 螺距螺距0.544nm0.544nmHairdressers can change the shape of hair by giving it a per

9、manent wave. -折叠折叠-折叠包括顺向平行和逆向平行两种类型折叠包括顺向平行和逆向平行两种类型 -转角和无规卷曲转角和无规卷曲 - -转角转角无规卷曲是用来阐述没有确定规律性的那部无规卷曲是用来阐述没有确定规律性的那部分肽链结构。分肽链结构。 丝心蛋白丝心蛋白在生物化学与分子生物学领域中，在生物化学与分子生物学领域中，模体模体是指具是指具有特定生物学功能的模式化序列或结构。有特定生物学功能的模式化序列或结构。模体包括三类：模体包括三类：( (三三) ) 模体模体重要概念：重要概念： motif序列模体序列模体 指指DNA或蛋白质分子中具有特定生物学功能的序列模或蛋白质分子中具有特定

10、生物学功能的序列模式，如纤连蛋白中能与其受体结合的式，如纤连蛋白中能与其受体结合的RGD三肽。三肽。结构模体结构模体 指蛋白质分子中由氨基酸残基空间排布所形成的具有指蛋白质分子中由氨基酸残基空间排布所形成的具有特定生物学功能的结构模式，通常也称为超二级结构，如锌特定生物学功能的结构模式，通常也称为超二级结构，如锌指模体、螺旋指模体、螺旋-环环-螺旋模体等。螺旋模体等。网络模体网络模体 在代谢网络、转录网络、蛋白质相互作用网络等网络在代谢网络、转录网络、蛋白质相互作用网络等网络结构中能够重复出现并具有统计学意义的网络模式。结构中能够重复出现并具有统计学意义的网络模式。在许多蛋白质分子中，可发在许

11、多蛋白质分子中，可发现二个或三个具有二级结构的现二个或三个具有二级结构的肽肽段，在空间上相互接近，形成一段，在空间上相互接近，形成一个特殊的空间构象，被称为模体个特殊的空间构象，被称为模体(motif)(motif)。超二级结构超二级结构Zinc finger motifEF-hand motifHLH motif蛋白质分子中常见的结构模体蛋白质分子中常见的结构模体钙结合蛋白中结钙结合蛋白中结合钙离子的模体合钙离子的模体 锌指结构锌指结构 影响影响 螺旋的因素：螺旋的因素：1.Pro1.Pro残基残基2. 2.空间位阻空间位阻:R:R基过大基过大3. 3.同性电荷互相排斥同性电荷互相排斥侧链对

12、二级结构的影响侧链对二级结构的影响三、三级结构 tertiary structure疏水键疏水键、离子键、氢键和、离子键、氢键和 Van der Waals力等。力等。二硫键二硫键 维系键维系键:即肽链中所有原子在三维空间的排布位置。即肽链中所有原子在三维空间的排布位置。（一）（一） 定义定义 肌红蛋白肌红蛋白 (Mb) N 端端 C端端大分子蛋白质的三级结构常可分割成一个或大分子蛋白质的三级结构常可分割成一个或数个球状或纤维状的区域，数个球状或纤维状的区域，折叠得较为紧密，各折叠得较为紧密，各行使其功能行使其功能，称为结构域，称为结构域(domain) 。结构域结构域纤连蛋白纤连蛋白(fib

13、ronectin)分子的结构域分子的结构域( (部分序列部分序列) )（三）分子伴侣（三）分子伴侣 chaperonu提供保护环境提供保护环境u可逆结合可逆结合u修改错误折叠修改错误折叠u参与二硫键形成参与二硫键形成亚基之间的结合力主要是亚基之间的结合力主要是疏水作用疏水作用，其次是，其次是氢键和离子键。氢键和离子键。四级结构四级结构各亚基的空间排布及接触部位的布局和相互作用各亚基的空间排布及接触部位的布局和相互作用（因此就存在亚基的聚合与解聚现象）（因此就存在亚基的聚合与解聚现象）亚基亚基 (subunit)(subunit) 具有具有完整三级结构完整三级结构的多的多肽肽链链四、蛋白质的四级

14、结构四、蛋白质的四级结构亚基的立体排布方式亚基的立体排布方式血红蛋白的四级结构血红蛋白的四级结构蛋白质四级结构与功能的关系蛋白质四级结构与功能的关系变构效应变构效应O2血红素与氧结血红素与氧结合后，铁原子半径合后，铁原子半径变小，就能进入卟变小，就能进入卟啉环的小孔中，继啉环的小孔中，继而引起肽链位置的而引起肽链位置的变动。变动。血红蛋白的变构血红蛋白的变构血红蛋白的氧饱和曲线血红蛋白的氧饱和曲线当血红蛋白的一个当血红蛋白的一个 亚基与亚基与氧分子结合以后，可引起氧分子结合以后，可引起其他亚基的构象发生改变，其他亚基的构象发生改变，对氧的亲和力增加，从而对氧的亲和力增加，从而导致整个分子的氧结

15、合力导致整个分子的氧结合力迅速增高，使血红蛋白的迅速增高，使血红蛋白的氧饱和曲线呈氧饱和曲线呈“S”形。形。由于蛋白质分子构象改变而导致其生物学由于蛋白质分子构象改变而导致其生物学功能发生改变的现象称为功能发生改变的现象称为变构效应（别构变构效应（别构效应）效应）。重要概念：重要概念：allosteric effect蛋白质分子构象改变与疾病蛋白质分子构象改变与疾病已知有已知有20多种疾病的发生与蛋白质分子构多种疾病的发生与蛋白质分子构象的错误直接相关，包括帕金森病、阿尔茨象的错误直接相关，包括帕金森病、阿尔茨海默病、海默病、朊蛋白病朊蛋白病(疯牛病疯牛病)、囊性纤维化、囊性纤维化、成骨不全症

16、等。成骨不全症等。疯牛病是由朊病毒蛋白疯牛病是由朊病毒蛋白(prion protein, PrP)引起的一组人和动物神经退行性病变。引起的一组人和动物神经退行性病变。PrPc-螺旋螺旋PrPsc-折叠折叠正常正常疯牛病疯牛病疯牛病中的蛋白质构象改变疯牛病中的蛋白质构象改变Conformation of Prion ProteinPrPcPrPsc蛋白质分子的结构层次蛋白质分子的结构层次Summary第三节第三节蛋白质的理化性质蛋白质的理化性质The Physical and Chemical Characters and Separation and Purification of Prote

17、in（一）蛋白质的两性电离（一）蛋白质的两性电离 酸性和碱性氨基酸残基的侧链基团酸性和碱性氨基酸残基的侧链基团 等电点等电点( isoelectric point, pI) 一、理化性质一、理化性质布朗运动，丁达尔现象，布朗运动，丁达尔现象，不能穿过半透膜不能穿过半透膜* * 蛋白质胶体稳定的因素蛋白质胶体稳定的因素颗粒表面电荷颗粒表面电荷水化膜水化膜（二）蛋白质的胶体性质（二）蛋白质的胶体性质+带正电荷的蛋白质带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质在等电点的蛋白质在等电点的蛋白质水化膜水化膜+带正电荷的蛋白质带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质不稳定的蛋白质颗粒不稳定的

18、蛋白质颗粒酸酸碱碱酸酸碱碱酸酸碱碱脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用脱水作用溶液中蛋白质的聚沉溶液中蛋白质的聚沉* 蛋白质的变性蛋白质的变性(denaturation)特定的特定的空间构象被破坏：空间构象被破坏： 理化性质改变和理化性质改变和生物活性的丧失生物活性的丧失 变性的本质变性的本质 破坏非共价键和二硫键，不改变蛋白破坏非共价键和二硫键，不改变蛋白质的质的一级结构一级结构。（三）蛋白质的变性、沉淀和凝固（三）蛋白质的变性、沉淀和凝固u变性蛋白质的性质改变：变性蛋白质的性质改变： 物理性质物理性质：旋光性改变，溶解度下降，沉降率：旋光性改变，溶解度下降，沉降率升高，粘度升高，光吸收

19、度增加等；升高，粘度升高，光吸收度增加等； 化学性质化学性质：官能团反应性增加，易被蛋白酶水：官能团反应性增加，易被蛋白酶水解。解。 生物学性质生物学性质：原有生物学活性丧失，抗原性改：原有生物学活性丧失，抗原性改变。变。 应用举例应用举例临床医学上，变性因素常被应用来消毒及临床医学上，变性因素常被应用来消毒及灭菌。灭菌。此外此外, , 防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制剂（如疫苗等）的必要条件。制剂（如疫苗等）的必要条件。 若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构后，蛋白质仍可恢复或部分恢复其原

20、有的构象和功能，称为复性象和功能，称为复性(renaturation) 。 天然状态，天然状态，有催化活性有催化活性 尿素、尿素、 -巯基乙醇巯基乙醇 去除尿素、去除尿素、-巯基乙醇巯基乙醇非折叠状态，无活性非折叠状态，无活性* * 蛋白质沉淀蛋白质沉淀蛋白质从溶液中析出的现象。蛋白质从溶液中析出的现象。变性的蛋白质易于沉淀，有时蛋白质发生沉变性的蛋白质易于沉淀，有时蛋白质发生沉淀，但并不变性。淀，但并不变性。 * 蛋白质的凝固作用蛋白质的凝固作用(protein coagulation) 蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固的凝块，此凝块不易再溶于强酸

21、和强碱中。的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中。 （四）蛋白质的紫外吸收（四）蛋白质的紫外吸收酪氨酸酪氨酸和和色氨酸色氨酸残基残基OD280（五）蛋白质的呈色反应（五）蛋白质的呈色反应茚三酮反应茚三酮反应(ninhydrin reaction) 双缩脲反应双缩脲反应(biuret reaction)肽键肽键Cu2+（OH-） 呈现紫色或红色呈现紫色或红色（一）透析及超滤法（一）透析及超滤法* 透析透析(dialysis)蛋白质与小分子化合物分离蛋白质与小分子化合物分离* * 超滤法超滤法 浓缩蛋白质溶液浓缩蛋白质溶液二、分离和纯化二、分离和纯化*盐析盐析(salt precipitation)

22、是将是将硫酸铵硫酸铵、硫酸钠、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面表面电荷被中和以及水化膜被破坏电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质，导致蛋白质沉淀（沉淀（未变性未变性）。）。 （二）丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀（二）丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀蛋白质在高于或低于其蛋白质在高于或低于其pIpI的溶液中为带电的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术质的技术, , 称为电泳称为电泳(electrophoresis) 。根据

23、支撑物的不同，可分为薄膜电泳、凝根据支撑物的不同，可分为薄膜电泳、凝胶电泳等。胶电泳等。 （三）电泳（三）电泳*SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于蛋白质分子量的测定。分子量的测定。*等电聚焦电泳，通过蛋白质等电点的差异等电聚焦电泳，通过蛋白质等电点的差异而分离蛋白质的电泳方法。而分离蛋白质的电泳方法。*双向凝胶电泳是蛋白质组学研究的重要技双向凝胶电泳是蛋白质组学研究的重要技术。术。two-dimensional electrophoresis几种重要的蛋白质电泳几种重要的蛋白质电泳流动相流动相固定相固定相待分离的组分在两相中反复分配待分离的组分在两相中反复分配（

24、四）层析（四）层析 chromatography* * 离子交换层析：利用各蛋白质的电荷量及性离子交换层析：利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离。质不同进行分离。* * 凝胶过滤凝胶过滤(gel filtration)又称分子筛层析，利又称分子筛层析，利用用各各蛋白质分子大小不同分离。蛋白质分子大小不同分离。蛋白质分离常用的层析方法蛋白质分离常用的层析方法* * 超速离心法超速离心法(ultracentrifugation)既可以既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量。白质的分子量。 *蛋白质在离心场中的行为用沉降系数蛋白质在离心场中的行为用沉

25、降系数(sedimentation coefficient, S)表示表示,沉降系沉降系数与蛋白质的密度和形状相关数与蛋白质的密度和形状相关 。（五）超速离心（五）超速离心因为沉降系数因为沉降系数S大体上和分子量成正比大体上和分子量成正比关系，故可应用超速离心法测定蛋白质分子关系，故可应用超速离心法测定蛋白质分子量，但对分子形状的高度不对称的大多数纤量，但对分子形状的高度不对称的大多数纤维状蛋白质不适用。维状蛋白质不适用。分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成测定多肽链的氨基末端与羧基末端为何种氨基酸残基测定多肽链的氨基末端与羧基末端为何种氨基酸残基把肽链水解成片段，分别进行分析把肽链水解成片段，分别进行分析测定各肽段的氨基酸排列顺序，一般采用测定各肽段的氨基酸排列顺序，一般采用Edman降解法降解法一般需用数种水解法，并分析出各肽段中的氨基酸一般需用数种水解法，并分析出各肽段中的氨基酸顺序，然后经过组合排列对比，最终得出完整肽链中氨顺序，然后经过组合排列对比，最终得出完整肽链中氨基酸顺序的结果。基酸顺序的结果。三、多三、多肽肽链中氨基酸序列分析链中氨