第1讲 基因工程(一轮复习)

1、第第1 1讲讲 基因工程基因工程单元单元8 8 现代生物科技专题现代生物科技专题牛奶草莓向喷药箱里装牛奶向喷药箱里装牛奶 为草莓浇牛奶为草莓浇牛奶 水果也奢华水果也奢华 草莓在产果期每周用稀释的牛奶浇灌。椐了解草莓在产果期每周用稀释的牛奶浇灌。椐了解一个大棚浇一次奶需要约一个大棚浇一次奶需要约200元钱，一个月浇四次；元钱，一个月浇四次； 培植出的草莓个大汁多，入口清软甜柔且带奶香，培植出的草莓个大汁多，入口清软甜柔且带奶香，在市场上极受欢迎。在市场上极受欢迎。 牛奶草莓的种植方法：牛奶草莓的种植方法：说句心里话说句心里话：你不是我的：你不是我的真爱真爱 请你帮他找到真爱请你帮他找到真爱1 1

2、、获取目的基因。、获取目的基因。2 2、形成重组、形成重组DNADNA分子。分子。3 3、将重组、将重组DNADNA导入受体细胞。导入受体细胞。4 4、筛选含有目的基因的受体细胞。、筛选含有目的基因的受体细胞。5 5、目的基因的表达。、目的基因的表达。爱情五步曲：爱情五步曲：1、找准目标、找准目标2、约会牵手、约会牵手3、进入殿堂、进入殿堂4、神父作证、神父作证5、爱情结晶、爱情结晶基因操作步骤基因操作步骤提取目的基因（牛奶基因）提取目的基因（牛奶基因）构建重组构建重组DNA转入农杆菌转入农杆菌感染感染草莓细胞草莓细胞植物组织培养植物组织培养转基因牛奶草莓转基因牛奶草莓质粒质粒基因工程概念基因

3、工程概念基因工程的核心基因工程的核心形成重组形成重组DNA（构建目的基因表达载体）（构建目的基因表达载体） 基因工程的工具：基因工程的工具：限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶DNA连接酶连接酶载体载体解旋酶解旋酶RNA聚合酶聚合酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶DNA连接酶连接酶酶的作用位点酶的作用位点教材片段教材片段限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶是识别是识别DNADNA的的特定序列特定序列，并在，并在特定位点特定位点切割切割双链双链DNADNA的一类内切酶。的一类内切酶。思考：思考：ECOR I是在大肠杆菌中发现最早的限制是在大肠杆菌中发现最早的限制性核酸内切酶，那该酶为什么不会切割大肠杆性

4、核酸内切酶，那该酶为什么不会切割大肠杆菌自身的菌自身的DNA呢？呢？大肠杆菌中不存在该酶的识别序列。大肠杆菌中不存在该酶的识别序列。细菌容易被噬菌体感染，许多细菌用切割细菌容易被噬菌体感染，许多细菌用切割外来外来DNADNA的方法进行自我保护。的方法进行自我保护。三个看点三个看点识别序列识别序列切点切点末端末端黏性末端黏性末端粘性末端粘性末端粘性末端粘性末端平末端平末端平末端平末端旋转旋转180度度这是否是所有限制酶的共性呢？这是否是所有限制酶的共性呢？CCTCAGCGGAGTCGBbvCBbvC酶酶CCGGAGTTCAGC CGGGATCCGGATCCBamHBst细心观察，你会发现很多细心

5、观察，你会发现很多Sau3AGATCBglAGATCT限制酶限制酶I I的识别序列和切点是的识别序列和切点是GGATCCGGATCC，限制酶限制酶IIII的识别序列和切点是的识别序列和切点是GATCGATC。 现有一个目的基因两侧分别含有现有一个目的基因两侧分别含有1 1个酶个酶I I和和1 1个酶个酶IIII识别序列，则用识别序列，则用酶酶II切割得到含目的基因的片段如何？切割得到含目的基因的片段如何？动手画一画动手画一画酶酶I识别序列识别序列酶酶II识别序列识别序列例题：基因工程中，需使用特定的限制酶切割目的基因和例题：基因工程中，需使用特定的限制酶切割目的基因和质粒，便于重组和筛选。已知

6、限制酶质粒，便于重组和筛选。已知限制酶I I的识别序列和切点的识别序列和切点是是G GGATCCGATCC，限制酶，限制酶IIII的识别序列和切点是的识别序列和切点是GATCGATC。根据图示判断下列操作正确的是（根据图示判断下列操作正确的是（ ）A A目的基因和质粒均用限制酶目的基因和质粒均用限制酶I I切割切割B B目的基因和质粒均用限制酶目的基因和质粒均用限制酶IIII切割切割C C质粒用限制酶质粒用限制酶I I切割，目的基因用限制酶切割，目的基因用限制酶切割切割D D质粒用限制酶质粒用限制酶切割，目的基因用限制酶切割，目的基因用限制酶I I切割切割C限制酶限制酶I：GGATCC 限制酶

7、限制酶II：GATC酶酶II切割切割酶酶II切割切割酶酶I切割切割思考：如上图切割后目的基因与质粒形成重组思考：如上图切割后目的基因与质粒形成重组DNA能能否再被限制酶否再被限制酶I和限制酶和限制酶II切割？切割？GGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGABamHBamHBglBgl下列两种酶切割后连接形成的重组下列两种酶切割后连接形成的重组DNA能否再能否再被原来的酶切割？被原来的酶切割？GGATCT CCTAGAAGATCCTCTAGG切割后再连接切割后再连接2 2、为了防止质粒和含目的基因的外源、为了防止质粒和含目的基因的外源DNADNA片段自身环化可使用片段自身环化可使用什么限制

8、酶同时处理质粒、外源什么限制酶同时处理质粒、外源DNADNA？1 1、EcoREcoR处理后的质粒和外源处理后的质粒和外源DNADNA混合物中加入混合物中加入DNADNA连接酶，则连接酶，则产物可能是什么？产物可能是什么？BamH和和Hind 或或 ECOR和和Hind目前常用的有E.coliE.coliDNA连接酶和T4DNA连接酶。T4DNA连接酶既可以连接黏性末端，也可以连接平末端，而E.coliE.coliDNA连接酶只能连接黏性末端。 DNA连接酶是否就不能连接平末端了呢？连接酶是否就不能连接平末端了呢？教材片段教材片段思考：用思考：用Hpa和和Sma两种不同酶切后，再用两种不同酶切

9、后，再用DNA连接酶连接的序列是否能被原来的酶切割？连接酶连接的序列是否能被原来的酶切割？1 1.下表为常用的限制性核酸内切酶的识别序列和切割位点，下表为常用的限制性核酸内切酶的识别序列和切割位点，由此推断的以下说法中，正确的是（由此推断的以下说法中，正确的是（ ）限制酶名称限制酶名称识别序列和切割识别序列和切割位点位点限制酶名称限制酶名称识别序列和切识别序列和切割位点割位点BamHBamHGGATCCGGATCCKpnKpnGGTACCGGTACCEcoREcoRCAATTCCAATTCSau3ASau3AGATCGATCHindHindGTYRACGTYRACSmaSmaCCCGGGCCC

10、GGGA.A.一种限制酶只能识别一种核苷酸序列一种限制酶只能识别一种核苷酸序列 B.B.限制酶切割后一定形成黏性末端限制酶切割后一定形成黏性末端C.C.不同的限制酶可以形成相同的黏性末端不同的限制酶可以形成相同的黏性末端 D.D.限制酶的切割位点在识别序列内部限制酶的切割位点在识别序列内部(注：Y=C或T，R=A或G)C2、防御素吞噬细胞中的一种富含半胱氨酸的小分子蛋、防御素吞噬细胞中的一种富含半胱氨酸的小分子蛋白质，具有抗菌和带被膜病毒的作用。白质，具有抗菌和带被膜病毒的作用。09年由中国专年由中国专家张涌主持培育的世界首例转人防御素基因克隆奶牛在家张涌主持培育的世界首例转人防御素基因克隆奶

11、牛在陕西杨凌降生。下列关于转基因技术说法正确的是（陕西杨凌降生。下列关于转基因技术说法正确的是（ ）A、在该实例中噬菌体可作为导入目的基因的载体。、在该实例中噬菌体可作为导入目的基因的载体。B、该转基因奶牛目的基因是人防御素。、该转基因奶牛目的基因是人防御素。C、基因工程常用载体质粒上常带有标记基因，如氨苄、基因工程常用载体质粒上常带有标记基因，如氨苄青霉素基因等。青霉素基因等。D、一种限制酶只能切出一种黏性末端，一种末端是可、一种限制酶只能切出一种黏性末端，一种末端是可由多种限制酶切出。由多种限制酶切出。D（1 1）能稳定存在于受体细）能稳定存在于受体细胞中，并能自我复制。胞中，并能自我复制

12、。（2 2）具有多个特定限制性）具有多个特定限制性核酸内切酶的切割位点（核酸内切酶的切割位点（便于插入目的基因便于插入目的基因 ）。）。（3 3）有标记基因（）有标记基因（便于筛选便于筛选 ）。）。（4 4）对受体细胞无害、易分离）对受体细胞无害、易分离（5 5）具有进入受体细胞的能力。）具有进入受体细胞的能力。作为载体的质粒特点作为载体的质粒特点 动植物病毒、噬菌体动植物病毒、噬菌体四环素抗性基因四环素抗性基因抗氨苄青霉素基因抗氨苄青霉素基因点为目的基因与点为目的基因与质粒质粒A的结合点的结合点如何鉴别细菌是否导入了重组质粒？如何鉴别细菌是否导入了重组质粒？将得到的细菌接种在一个含有氨苄青霉

13、素的培养基上，将得到的细菌接种在一个含有氨苄青霉素的培养基上，能够生长的就是导入质粒能够生长的就是导入质粒A或重组质粒的，反之则没有。或重组质粒的，反之则没有。四环素抗性基因四环素抗性基因抗氨苄青霉素基因抗氨苄青霉素基因点为目的基因与点为目的基因与质粒质粒A的结合点的结合点导入细菌导入细菌B细胞细胞 中的目的基因成功表达的标志是什么中的目的基因成功表达的标志是什么?受体细胞通过转录翻译过程合成出相应的蛋白质，即受体细胞通过转录翻译过程合成出相应的蛋白质，即人的生长激素。人的生长激素。 获取目的基因获取目的基因（1）方法：）方法： 人工合成目的基因人工合成目的基因(目的基因的序列已知目的基因的序

14、列已知)利用聚合酶链式反应利用聚合酶链式反应(PCR)技术扩增目的基因技术扩增目的基因 （目的基因的序列已知）（目的基因的序列已知）从基因文库中获取目的基因从基因文库中获取目的基因甲硫氨酸甲硫氨酸苯丙氨酸苯丙氨酸色氨酸色氨酸蛋白质：蛋白质：信使信使RNAAUGUUUUGG或或AUGUUCUGG基因或基因或DNATACAAAACCATGTTTTGGTACAACACCATGTTGTGG或或利用利用PCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因 聚合酶链式反应，在生物体外复制特定聚合酶链式反应，在生物体外复制特定DNADNA片段的核酸合成技术。可以获得大量的目的基因。片段的核酸合成技术。可以获得大量的目的基

15、因。 基因基因DNADNA文库的构建文库的构建 将总将总DNADNA经过多种限制酶切割，分离不同长短的经过多种限制酶切割，分离不同长短的DNADNA片段。片段。包含的基因片段分别克隆在质粒或噬菌体载包含的基因片段分别克隆在质粒或噬菌体载体上，体上，转染细菌或体外包装到转染细菌或体外包装到噬菌体噬菌体上上便构成了该生便构成了该生物物的基因文库。的基因文库。AGATCCTCTAGG5、某线性DNA分子含有5000个碱基对（bp），先用限制酶a切割，再把得到的产物用限制酶b切割，得到的DNA片段大小如下表。限制酶a和b的识别序列和切割位点如下图所示。下列有关说法不正确的是（ ）A在该DNA分子中，a

16、酶与b酶的识别序列分别有3个和2个Ba酶与b酶切出的粘性末端不能相互连接Ca酶与b酶切断的化学键相同D用这两种酶和DNA连接酶对该DNA分子进行反复切割、连接操作，若干循环后， 序列会明显增多7、限制性内切酶能识别特定的DNA序列并进行剪切，不同的限制性内切酶可以对不同的核酸序列进行剪切。现以3种不同的限制性内切酶对6.2kb大小的线状DNA进行剪切后。用凝胶电泳分离各核酸片段，实验结果如图所示：（ ）请问：3种不同的限制性内切酶在此DNA片段上相应切点的位置是思考思考:用图中的质粒和外源用图中的质粒和外源DNA构建重组质粒，不能使构建重组质粒，不能使用用Sma I切割，原因是切割，原因是 什

17、么？什么？拓展讨论拓展讨论 （2010年浙江卷）年浙江卷） 2在用基因工程技术构在用基因工程技术构建抗除草剂的转基因烟草过程中，下列操作错建抗除草剂的转基因烟草过程中，下列操作错误的是误的是( ) A用限制性核酸内切酶切割烟草花叶病毒的用限制性核酸内切酶切割烟草花叶病毒的核酸核酸 B用用DNA连接酶连接经切割的抗除草剂基因连接酶连接经切割的抗除草剂基因和载体和载体 C将重组将重组DNA分子导入烟草原生质体分子导入烟草原生质体 D用含除草剂的培养基筛选转基因烟草细胞。用含除草剂的培养基筛选转基因烟草细胞。A感受高考感受高考（2011年浙江卷）年浙江卷）6、将、将ada（腺苷酸脱氨酶基因）（腺苷酸

18、脱氨酶基因）通过质粒通过质粒pET28b导入大肠杆菌并成功表达腺苷酸导入大肠杆菌并成功表达腺苷酸脱氨酶。下列叙述错误的是（脱氨酶。下列叙述错误的是（ ） A. 每个大肠杆菌细胞至少含一个重组质粒每个大肠杆菌细胞至少含一个重组质粒 B. 每个重组质粒至少含一个限制性核酸内切酶每个重组质粒至少含一个限制性核酸内切酶识别位点识别位点 C. 每个限制性核酸内切酶识别位点至少插入一每个限制性核酸内切酶识别位点至少插入一个个ada D. 每个人的每个人的ada至少表达一个腺苷酸脱氨酶分子至少表达一个腺苷酸脱氨酶分子C（天津改编）在培育转基因植物的研究中，卡那霉素抗性基因（天津改编）在培育转基因植物的研究中

19、，卡那霉素抗性基因（kankan）常作为标记基因，只有含卡那霉素抗性基因的细胞才能）常作为标记基因，只有含卡那霉素抗性基因的细胞才能在卡那霉素培养基上生长。下图为获得抗虫棉的技术流程。在卡那霉素培养基上生长。下图为获得抗虫棉的技术流程。 1 1、A A过程需要的酶有过程需要的酶有_ 。 2 2、B B过程及其结果体现了质粒作为载体过程及其结果体现了质粒作为载体DNADNA必须具备的必须具备的两个条件是两个条件是_ 。 3 3、C C过程的培养基除含有必要营养物质、琼脂和激素过程的培养基除含有必要营养物质、琼脂和激素外，还必须加入外，还必须加入_ 。 4 4、如果利用、如果利用DNADNA分子杂

20、交原理对再生植株进行检测，分子杂交原理对再生植株进行检测，D D过程应该用过程应该用_ 作为探针。作为探针。限制性核酸内切酶和限制性核酸内切酶和DNADNA连接酶连接酶标记基因；在宿主细胞复制并稳定保存标记基因；在宿主细胞复制并稳定保存卡那霉素卡那霉素放射性标记的抗虫基因（或荧光分子）放射性标记的抗虫基因（或荧光分子）为从根本上解决水稻中的高植酸问题，可将植酸酶基因为从根本上解决水稻中的高植酸问题，可将植酸酶基因导入水稻，培育低植酸转基因水稻品种。下图是获取植导入水稻，培育低植酸转基因水稻品种。下图是获取植酸酶基因的流程。据图分析下列说法错误的是酸酶基因的流程。据图分析下列说法错误的是( )

21、A图中基因组文库等于图中基因组文库等于cDNA文库。文库。 BB过程需要的酶是逆转录酶。过程需要的酶是逆转录酶。C从基因文库中可获取我们想要的植酸酶基因。从基因文库中可获取我们想要的植酸酶基因。DA、C过程依据的原理是碱基互补配对原则。过程依据的原理是碱基互补配对原则。BACACA.0.30.72.60.90.51.2ABCABB.0.30.72.60.90.51.2ABCBCC.0.30.72.60.90.51.2ABCACD.0.30.72.60.90.51.21.限制性内切酶能识别特定的DNA序列并进行剪切，不同的限制性内切酶可以对不同的核酸序列进行剪切。现以3种不同的限制性内切酶对6.

22、2kb大小的线状DNA进行剪切后。用凝胶电泳分离各核酸片段，实验结果如图所示。请问：3种不同的限制性内切酶在此DNA片段上相应切点的位置是（ ）请根据以上图表回答下列问题。（1）在采用常规PCR方法扩增目的基因的过程中，使用的DNA聚合酶不同于一般生物体内的DNA聚合酶，其最主要的特点是 。（2）PCR过程中退火（复性）温度必须根据引物的碱基数量和种类来设定。表1为根据模板设计的两对引物序列，图2为引物对与模板结合示意图。请判断哪一对引物可采用较高的退火温度？_。（3）图1步骤所用的DNA连接酶对所连接的DNA两端碱基序列是否有专一性要求？ 。（4）为将外源基因转入马铃薯，图1步骤转基因所用的细菌B通常为 。（5）对符合设计要求的重组质粒T进行酶切，。假设所用的酶均可将识别位点完全切开，请根据图1中标示的酶切位点和表2所列的识别序列，对以下酶切结果作出判断。采用EcoR和Pst酶切，得到_种DNA片断。采用EcoR和Sma酶切，得到_种DNA片断。46. （1）耐高温 2）引物对B （3）否 （4）农杆菌 （5）2 11.将动物致病菌的抗原基因导入马铃