第0章：吸光光度法

1、1第第1010章章 吸光光度法吸光光度法2化学分析化学分析：常量组分：常量组分(1%), Er 0.1%0.2% 依据化学反应依据化学反应, 使用玻璃仪器使用玻璃仪器 化学分析与仪器分析方法比较化学分析与仪器分析方法比较仪器分析仪器分析：微量组分：微量组分(v vr r 9能级跃迁能级跃迁紫外紫外- -可见光谱属于电子跃可见光谱属于电子跃迁光谱。迁光谱。电子能级电子能级间跃迁的同时总伴间跃迁的同时总伴随有振动和转动能级间的随有振动和转动能级间的跃迁。即电子光谱中总包跃迁。即电子光谱中总包含有振动能级和转动能级含有振动能级和转动能级间跃迁产生的若干谱线而间跃迁产生的若干谱线而呈现呈现宽谱带宽谱带

2、。10吸收光谱吸收光谱 Absorption Spectrum纯纯 电子能态电子能态 间跃迁间跃迁S2S1S0S3h E2E0E1E3S2S1S0h A h h h 分子内电子跃迁分子内电子跃迁带状光谱带状光谱 A111（1 1）转动能级间的能量差）转动能级间的能量差EEr r：0.0050.0050.050eV0.050eV，跃迁，跃迁产生吸收光谱位于远红外区。远红外光谱或分子转动光谱；产生吸收光谱位于远红外区。远红外光谱或分子转动光谱；1（2 2）振动能级的能量差）振动能级的能量差E Ev v约为：约为：0.050.05eVeV，跃迁产，跃迁产生的吸收光谱位于红外区，红外光谱或分子振动光谱

3、；生的吸收光谱位于红外区，红外光谱或分子振动光谱；1（3 3）电子能级的能量差）电子能级的能量差EEe e较大较大1 120eV20eV。电子跃迁产生。电子跃迁产生的吸收光谱在紫外的吸收光谱在紫外可见光区，紫外可见光区，紫外可见光谱或分子的电可见光谱或分子的电子光谱子光谱讨论：讨论：121 （4 4）吸收光谱的波长分布是由产生谱带的跃迁能级）吸收光谱的波长分布是由产生谱带的跃迁能级间的能量差所决定，反映了分子内部能级分布状况，间的能量差所决定，反映了分子内部能级分布状况，是物质定性的依据。是物质定性的依据。1 （5 5）吸收谱带强度与分子偶极矩变化、跃迁几率有吸收谱带强度与分子偶极矩变化、跃迁

4、几率有关，也提供分子结构的信息。通常将在最大吸收波长关，也提供分子结构的信息。通常将在最大吸收波长处测得的摩尔吸光系数处测得的摩尔吸光系数maxmax也作为定性的依据。也作为定性的依据。不同不同物质的物质的maxmax有时可能相同，但有时可能相同，但maxmax不一定相同不一定相同；1 （6 6）吸收谱带强度与该物质分子吸收的光子数成正）吸收谱带强度与该物质分子吸收的光子数成正比，定量分析的依据。比，定量分析的依据。13 物质对光的选择性吸收及吸收曲线物质对光的选择性吸收及吸收曲线M + h M *M + 热热M + 荧光或磷光荧光或磷光基态基态 激发态激发态E1 （E） E2 E = E2

5、- E1 = h 量子化量子化 ；选择性吸收；选择性吸收; ; 分子结构的复杂性使其对不同波长分子结构的复杂性使其对不同波长光的吸收程度不同；光的吸收程度不同； 用不同波长的单色光照射，测吸光用不同波长的单色光照射，测吸光度度 吸收曲线与最大吸收波长吸收曲线与最大吸收波长 maxmax； 光的互补光的互补：蓝：蓝 黄黄14 若两种不同颜色的单色光按一定的强度比若两种不同颜色的单色光按一定的强度比例混合得到白光，那么就称这两种单色光为互例混合得到白光，那么就称这两种单色光为互补色光，这种现象称为光的互补。补色光，这种现象称为光的互补。蓝蓝黄黄紫红紫红绿绿紫紫黄绿黄绿绿蓝绿蓝橙橙红红蓝绿蓝绿15

6、/nm颜色颜色互补光互补光400-450紫黄绿450-480蓝蓝黄黄480-490绿蓝绿蓝橙橙490-500蓝绿蓝绿红红500-560绿绿红紫红紫560-580黄绿黄绿紫紫580-610黄黄蓝蓝610-650橙橙绿蓝绿蓝650-760红红蓝绿蓝绿不同颜色的可见光波长及其互补光不同颜色的可见光波长及其互补光16吸收曲线的讨论：吸收曲线的讨论： （1）同一种物质对不同波长光的吸光度不）同一种物质对不同波长光的吸光度不同。吸光度最大处对应的波长称为同。吸光度最大处对应的波长称为最大吸收波长最大吸收波长max （2）不同浓度的同一种物质，其吸收曲线）不同浓度的同一种物质，其吸收曲线形状相似形状相似ma

7、x不变。而对于不同物质，它们的不变。而对于不同物质，它们的吸收曲线形状和吸收曲线形状和max则不同。则不同。 （3）吸收曲线可以提供物质的结构信息，并作为物质定性分析的依据）吸收曲线可以提供物质的结构信息，并作为物质定性分析的依据之一。之一。 （4）不同浓度的同一种物质，在某一定波长下吸光度不同浓度的同一种物质，在某一定波长下吸光度 A 有差异，在有差异，在max处吸光度处吸光度A 的差异最大。此特性可作为物质定量分析的依据。的差异最大。此特性可作为物质定量分析的依据。 （5）在在max处吸光度随浓度变化的幅度最大，所以测定最灵敏。吸处吸光度随浓度变化的幅度最大，所以测定最灵敏。吸收曲线是定量

8、分析中选择入射光波长的重要依据。收曲线是定量分析中选择入射光波长的重要依据。定性、定量基础定性、定量基础17定性分析与定量分析的基础定性分析与定量分析的基础定性分析基础定性分析基础定量分析基础定量分析基础物质对光的选择物质对光的选择吸收吸收ABA )(maxA)(maxB在一定的实验条在一定的实验条件下，物质对光件下，物质对光的吸收与物质的的吸收与物质的浓度成正比。浓度成正比。A C增增大大1810.1.2 10.1.2 光吸收的基本定律光吸收的基本定律 1.1.朗伯朗伯比耳定律比耳定律 布格布格(Bouguer(Bouguer) )和朗伯和朗伯(Lambert)(Lambert)先后于先后于

9、17291729年和年和17601760年阐明了光的吸收程度和吸收层厚度的关系。年阐明了光的吸收程度和吸收层厚度的关系。A Ab b 18521852年比耳年比耳(Beer)(Beer)又提出了光的吸收程度和吸收物又提出了光的吸收程度和吸收物浓度之间也具有类似的关系。浓度之间也具有类似的关系。A A c c 二者的结合称为朗伯二者的结合称为朗伯比耳定律，其数学表达式为：比耳定律，其数学表达式为： 19朗伯朗伯比耳定律数学表达式比耳定律数学表达式 A Alglg（I I0 0/ /I It t)= )= b cb c 式中式中A A：吸光度；描述溶液对光的吸收程度；：吸光度；描述溶液对光的吸收程

10、度； b b：液层厚度：液层厚度( (光程长度光程长度) )，通常以，通常以cmcm为单位；为单位； c c：溶液的摩尔浓度，单位：溶液的摩尔浓度，单位molmolL L； ：摩尔吸光系数，单位：摩尔吸光系数，单位L Lmolmolcmcm； 或或: : A Alglg（I I0 0/ /I It t)= )= a b ca b c c c：溶液的浓度，单位：溶液的浓度，单位g gL L a a：吸光系数，单位：吸光系数，单位L Lg gcmcm a a与与的关系为：的关系为： a a = =/ /M M （M M为摩尔质量）为摩尔质量） 20吸光度与光程的关系吸光度与光程的关系 A = bc

11、 光源光源检测器检测器0.00吸光度吸光度检测器检测器b样品样品光源光源0.22吸光度吸光度光源光源检测器检测器0.44吸光度吸光度b样品样品b样品样品21吸光度与浓度的关系吸光度与浓度的关系 A = bc 吸光度吸光度0.00光源光源检测器检测器 吸光度吸光度0.22光源光源检测器检测器b 吸光度吸光度0.42光源光源检测器检测器b22透光度透光度( (透光率透光率)T)T透透光光度度T : 描述入射光透过溶液的程度描述入射光透过溶液的程度: T = I t / I0吸光度吸光度A与透光度与透光度T的关系的关系: A lg T 朗伯朗伯比耳定律是吸光光度法的理论基础和定量测定的比耳定律是吸光

12、光度法的理论基础和定量测定的依据。应用于各种光度法的吸收测量；依据。应用于各种光度法的吸收测量； 摩尔吸光系数摩尔吸光系数在数值上等于浓度为在数值上等于浓度为1 mol/L、液层厚度、液层厚度为为1cm时该溶液在某一波长下的吸光度；时该溶液在某一波长下的吸光度； 吸光系数吸光系数a(Lg-1cm-1）相当于浓度为）相当于浓度为1 g/L、液层厚度、液层厚度为为1cm时该溶液在某一波长下的吸光度。时该溶液在某一波长下的吸光度。232.2.摩尔吸光系数摩尔吸光系数的讨论的讨论 （1 1）吸收物质在一定波长和溶剂条件下的吸收物质在一定波长和溶剂条件下的特征常数特征常数； （2 2）不随浓度不随浓度c

13、 c和光程长度和光程长度b b的改变而改变的改变而改变。在温度和波长在温度和波长等条件一定时，等条件一定时，仅与吸收物质本身的性质有关，与待测物仅与吸收物质本身的性质有关，与待测物浓度无关；浓度无关； （3 3）可作为可作为定性鉴定的参数定性鉴定的参数； （4）同一吸收物质在不同波长下的同一吸收物质在不同波长下的值是不同的。在最大值是不同的。在最大吸收波长吸收波长max处的摩尔吸光系数，常以处的摩尔吸光系数，常以max表示。表示。max表明了表明了该该吸收物质最大限度的吸光能力吸收物质最大限度的吸光能力，也反映了光度法测定该物也反映了光度法测定该物质可能达到的最大灵敏度。质可能达到的最大灵敏度

14、。 24 （5 5）max越大表明该物质的吸光能力越强，用光度法测定越大表明该物质的吸光能力越强，用光度法测定该物质的灵敏度越高。该物质的灵敏度越高。105：超高灵敏；：超高灵敏； =(610）104 ：高灵敏；：高灵敏； 2104 ：不灵敏。：不灵敏。 （6）在数值上等于浓度为在数值上等于浓度为1mol/L、液层厚度为、液层厚度为1cm时该时该溶液在某一波长下的吸光度。溶液在某一波长下的吸光度。摩尔吸光系数摩尔吸光系数的讨论的讨论253.3.偏离朗伯偏离朗伯比耳定律的原因比耳定律的原因 标准曲线法测定未知溶液的浓标准曲线法测定未知溶液的浓度时，发现：标准曲线常发生弯曲度时，发现：标准曲线常发

15、生弯曲（尤其当溶液浓度较高时），这种（尤其当溶液浓度较高时），这种现象称为对朗伯现象称为对朗伯比耳定律的偏离。比耳定律的偏离。 引起这种偏离的因素（两大类）：引起这种偏离的因素（两大类）： （1 1）物理性因素，即仪器的非理想引起的；物理性因素，即仪器的非理想引起的； （2 2）化学性因素。化学性因素。26（1）物理性因素物理性因素 难以获得真正的纯单色光难以获得真正的纯单色光。 朗朗比耳定律的前提条件之一是入射光为单色光。比耳定律的前提条件之一是入射光为单色光。 分光光度计只能获得近乎单色的狭窄光带。复合光可导分光光度计只能获得近乎单色的狭窄光带。复合光可导致对朗伯致对朗伯比耳定律的正或负偏

16、离。比耳定律的正或负偏离。 非单色光、杂散光、非平行入射非单色光、杂散光、非平行入射光都会引起对朗伯光都会引起对朗伯比耳定律的偏离，比耳定律的偏离，最主要的是非单色光作为入射光引起最主要的是非单色光作为入射光引起的偏离。的偏离。 27非单色光作为入射光引起的偏离非单色光作为入射光引起的偏离 假设由波长为假设由波长为1和和2的两单色光的两单色光组成的入射光通过浓度为组成的入射光通过浓度为c的溶液，则：的溶液，则： A 1lg（o1 /t1 ）1bc A 2lg(o2 /t2 ）2bc故：故：cbcbIIII22111O2tOt10;10式中：式中：o1、o2分别为分别为1、2 的入射光强度；的入

17、射光强度； t1、t2分别为分别为1、2 的透射光强度；的透射光强度； 1、2分别为分别为1、2的摩尔吸光系数；的摩尔吸光系数；因实际上只能测总吸光度因实际上只能测总吸光度A总总，并不能分别测得，并不能分别测得A1和和A2，故，故28 因实际上只能测总吸光度因实际上只能测总吸光度A A总总，并不能分别测得，并不能分别测得A A1 1和和A A2 2，故：，故： A总总 lg（o总总/t总总 ) lg(Io1+o2)/(t1+t2） lg(Io1+o2)/(o110-1bc +o210-2bc ）令：令： 1-2 ；设：设： o1 o2 A总总 lg(2Io1)/t1(110 - bc ） A

18、1 + lg2 - lg(110 - bc ) 讨论讨论: :29讨论讨论: : A总总 =A1 + lg2 - lg(110 bc ) (1) = 0； 即：即： 1= 2 = 则：则： A总 lg（o/t） bc(2) 0 若若 0 ；即；即 20, lg(110 bc )值随值随c c值增大而增大，则标准曲线偏离值增大而增大，则标准曲线偏离直线向直线向c c 轴弯曲，即负偏离；反之，则向轴弯曲，即负偏离；反之，则向A A 轴弯曲，即正偏轴弯曲，即正偏离。离。30讨论讨论: : A总总 =A1 + lg2 - lg(110 bc ) (3) 很小时，即很小时，即12： 可近似认为是单色光。

19、在低浓度范围内，不发生偏离。若可近似认为是单色光。在低浓度范围内，不发生偏离。若浓度较高，即使浓度较高，即使 很小，很小， A总总 1 ，且随着且随着c c值增大值增大， A A总总 与与A A 1 1的差异愈大，在图上则表现为的差异愈大，在图上则表现为A Ac c曲线上部曲线上部( (高浓度区高浓度区) )弯曲愈严重。弯曲愈严重。故朗伯故朗伯比耳定律只适用于稀溶液比耳定律只适用于稀溶液。 (4) 为克服非单色光引起的偏离，首先应选择比较好的单色为克服非单色光引起的偏离，首先应选择比较好的单色器。此外还应将入射波长选定在待测物质的最大吸收波长且吸器。此外还应将入射波长选定在待测物质的最大吸收波

20、长且吸收曲线较平坦处。收曲线较平坦处。31(2) (2) 化学性因素化学性因素 朗朗比耳定律的假定：所有的吸光质点之间不发生相互比耳定律的假定：所有的吸光质点之间不发生相互作用；作用；假定只有在稀溶液假定只有在稀溶液(c10 2 mol/L 时，吸光质点间可能发生缔合时，吸光质点间可能发生缔合等相互作用，直接影响了对光的吸收。等相互作用，直接影响了对光的吸收。 故：朗伯故：朗伯比耳定律只适用于稀溶液比耳定律只适用于稀溶液。 溶液中存在着离解、聚合、互变异构、配合物的形成等溶液中存在着离解、聚合、互变异构、配合物的形成等化学平衡时。使吸光质点的浓度发生变化，影响吸光度。化学平衡时。使吸光质点的浓

21、度发生变化，影响吸光度。 例：例： 铬酸盐或重铬酸盐溶液中存在下列平衡：铬酸盐或重铬酸盐溶液中存在下列平衡： CrO42- 2H = Cr2O72- H2O 溶液中溶液中CrOCrO4 42-2-、 CrCr2 2O O7 72-2-的颜色不同，吸光性质也不相的颜色不同，吸光性质也不相同。故此时溶液同。故此时溶液pH pH 对测定有重要影响。对测定有重要影响。32偏离朗伯偏离朗伯-比尔定律的原因比尔定律的原因1. 非单色光引起的偏离非单色光引起的偏离 2. 介质不均匀引起的偏离介质不均匀引起的偏离3. 由于溶液本身的化学反应引起的偏由于溶液本身的化学反应引起的偏离离 解离、络合反应、其他反应解

22、离、络合反应、其他反应4. 显色反应的干扰显色反应的干扰33朗伯朗伯-比尔定律的适用条件比尔定律的适用条件1. 单色光单色光 应选用应选用 max处或肩峰处测定处或肩峰处测定2. 吸光质点形式不变吸光质点形式不变 离解、络合、缔合会破坏线性关系离解、络合、缔合会破坏线性关系 应控制条件应控制条件(酸度、浓度、介质等酸度、浓度、介质等)3. 稀溶液稀溶液 浓度增大，分子之间作用增强浓度增大，分子之间作用增强34吸光度的加和性与吸光度的测量吸光度的加和性与吸光度的测量 A = A1 + A2 + +An 用参比溶液调用参比溶液调T=100%（A=0），再测样品溶），再测样品溶液的吸光度，即消除了吸

23、收池对光的吸收、反射，液的吸光度，即消除了吸收池对光的吸收、反射，溶剂、试剂对光的吸收等溶剂、试剂对光的吸收等。3510.2 10.2 紫外紫外可见分光光度计可见分光光度计363710.2.110.2.1基本组成基本组成光源单色器样品室检测器显示1. 1. 光源光源 在整个紫外光区或可见光谱区可以发射连续光谱，具在整个紫外光区或可见光谱区可以发射连续光谱，具有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命。有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命。 可见光区：钨灯作可见光区：钨灯作为光源，其辐射波长范为光源，其辐射波长范围在围在3203202500 nm2500 nm。 紫外区：氢、氘灯。

24、紫外区：氢、氘灯。发射发射185185400 nm400 nm的连续的连续光谱。光谱。38 2.2.单色器单色器 将光源发射的复合光分解成单色光并可从中选出一任将光源发射的复合光分解成单色光并可从中选出一任波长单色光的光学系统。波长单色光的光学系统。 入射狭缝：光源的光由此进入单色器；入射狭缝：光源的光由此进入单色器； 准光装置：透镜或返射镜使入射光成为平行光束；准光装置：透镜或返射镜使入射光成为平行光束； 色散元件：将复合光分解成单色光；色散元件：将复合光分解成单色光；棱镜或光栅棱镜或光栅； 聚焦装置：透镜或聚焦装置：透镜或凹面反射镜，将分光凹面反射镜，将分光后所得单色光聚焦至后所得单色光聚

25、焦至出射狭缝；出射狭缝； 出射狭缝。出射狭缝。39棱镜：棱镜：依据不同波长光通过棱镜时折射率不同依据不同波长光通过棱镜时折射率不同单色器单色器入射狭缝入射狭缝准直透镜准直透镜棱镜棱镜聚焦透镜聚焦透镜出射狭缝出射狭缝白光白光红红紫紫1 12 2800 600 50040040光栅：光栅：在镀铝的玻璃表面刻有数量很大的在镀铝的玻璃表面刻有数量很大的等宽度等宽度等间距等间距条痕条痕(600、1200、2400条条/mm )。M1M2出出射射狭狭缝缝光屏光屏透透镜镜平面透平面透射光栅射光栅光栅衍射示意图光栅衍射示意图原理原理：利用光通过光栅时利用光通过光栅时发生衍射和干涉现象而发生衍射和干涉现象而分光

26、分光.413. 3. 样品室样品室 样品室放置各种类型的吸收池样品室放置各种类型的吸收池（比色皿）和相应的池架附件。吸（比色皿）和相应的池架附件。吸收池主要有石英池和玻璃池两种。收池主要有石英池和玻璃池两种。在紫外区须采用石英池，可见区一在紫外区须采用石英池，可见区一般用玻璃池。般用玻璃池。4. 4. 检测器检测器 利用光电效应将透过吸收池的利用光电效应将透过吸收池的光信号变成可测的电信号，常用的光信号变成可测的电信号，常用的有光电池、光电管或光电倍增管。有光电池、光电管或光电倍增管。5. 5. 结果显示记录系统结果显示记录系统 检流计、数字显示、微机进行检流计、数字显示、微机进行仪器自动控制

27、和结果处理仪器自动控制和结果处理42光电管光电管红敏管红敏管 625-1000 nm蓝敏管蓝敏管 200-625 nmNi环（片）环（片）碱金属碱金属光敏阴极光敏阴极h 43光电倍增管光电倍增管待扫描160-700 nm1个光电子可产生个光电子可产生106107个电子个电子4410.2.210.2.2分光光度计的类型分光光度计的类型1.1.单光束单光束 简单，价廉，适于在给定波长处测量吸光度或透光度，简单，价廉，适于在给定波长处测量吸光度或透光度，一般不能作全波段光谱扫描，要求光源和检测器具有很高一般不能作全波段光谱扫描，要求光源和检测器具有很高的稳定性。的稳定性。2.2.双光束双光束 自动记

28、录，快速全波自动记录，快速全波段扫描。可消除光源不稳段扫描。可消除光源不稳定、检测器灵敏度变化等定、检测器灵敏度变化等因素的影响，特别适合于因素的影响，特别适合于结构分析。仪器复杂，价结构分析。仪器复杂，价格较高。格较高。453.3.双波长双波长 将不同波长的两束单色光将不同波长的两束单色光( (1 1、2 2) ) 快束交替通过同快束交替通过同一吸收池而后到达检测器。产生交流信号。无需参比池。一吸收池而后到达检测器。产生交流信号。无需参比池。 = =1 12nm2nm。两波长同时扫描即可获得导数光谱。两波长同时扫描即可获得导数光谱。46多通道仪器多通道仪器（Multichannel Inst

29、ruments） 光电二极管阵列光电二极管阵列(通常具有通常具有316个硅二极管个硅二极管) photodiode arrays (PDAs) 同时测量同时测量200820nm范围内的整个光谱范围内的整个光谱, 比单个比单个检测器快检测器快316倍倍,信噪比增加信噪比增加 316 1/2 倍倍. 其他类型分光光度计其他类型分光光度计将光度计放入样品中将光度计放入样品中, , 原位测量原位测量. . 对环境和对环境和过程监测非常重要过程监测非常重要. .纤维光度计纤维光度计47镀铝反射镜镀铝反射镜纤维光度计示意图纤维光度计示意图48纤维光度计纤维光度计4910.3 10.3 显色反应及其影响因素

30、显色反应及其影响因素10.3.1显色反应和显色剂显色反应和显色剂1.1.选择显色反应时，应考虑的因素选择显色反应时，应考虑的因素 灵敏度高灵敏度高，选择性好选择性好； 有色化合物的组成恒定，符合一定的化学式；有色化合物的组成恒定，符合一定的化学式； 生成物稳定生成物稳定； 显色剂在测定波长处无明显吸收显色剂在测定波长处无明显吸收，两种有色物最大吸收两种有色物最大吸收波长之差波长之差要求要求 60nm, 60nm,对照性好对照性好。 50： ：助色团助色团NH2，OH，X （孤对电子）（孤对电子）neO生色团生色团：NN，NO，OC=S,N （共轭双键）（共轭双键）e无机显色剂无机显色剂: SC

31、N- Fe(SCN)2+ H2O2 TiOH2O22+有机显色剂有机显色剂:2.2.显色剂显色剂51有机显色剂有机显色剂CH3CCCH3 HON NOH NNOHCOOHSO3HOO型：型：NNNOH OHON型型：PARNH NHNSNS型型：双硫腙双硫腙NN型：型：丁二丁二酮肟酮肟邻二邻二氮菲氮菲磺基水杨酸磺基水杨酸5210.3.2 10.3.2 影响显色反应的因素影响显色反应的因素1.1.显色剂用量显色剂用量 吸光度吸光度A A与显色剂用量与显色剂用量C CR R的关系会出现如图所示的几种的关系会出现如图所示的几种情况。选择曲线变化平坦处。情况。选择曲线变化平坦处。2.2.溶液的酸度溶液

32、的酸度3.3.显色反应时间显色反应时间4.4.显色反应温度显色反应温度5.5.溶剂溶剂 一般尽量采用水相测定一般尽量采用水相测定6.6.干扰离子的影响干扰离子的影响53c(R)c(R)c(R) 显色剂用量显色剂用量（c(M)、pH一定）一定）Mo(SCN)32+ 浅红浅红Mo(SCN)5 橙红橙红Mo(SCN)6- 浅红浅红Fe(SCN)n3-n54 显色反应酸度显色反应酸度（c(M)、 c(R)一定）一定）pH1pH2.2.控制适宜的吸光度（读数范围）控制适宜的吸光度（读数范围）60控制适宜的吸光度（读数范围）控制适宜的吸光度（读数范围） 不同的透光度读数，产生的误差大小不同：不同的透光度读

33、数，产生的误差大小不同： A=lgT=bc微分：微分：dA=dlgT0.434dlnT = - 0.434T -1 dT =b dc两式相除得：两式相除得： dA/A= （ 0.434 / TlgT ）dT =dc/c 以有限值表示可得：以有限值表示可得： A/A = c/c =（0.434/TlgT）T 浓度测量值的相对误差（浓度测量值的相对误差（c c/ /c c）不仅与仪器的透光度）不仅与仪器的透光度误差误差T T 有关，而且与其透光度读数有关，而且与其透光度读数T T 的值也有关。的值也有关。 是否存在最佳读数范围？何值时误差最小？是否存在最佳读数范围？何值时误差最小？ 61最佳读数范

34、围与最佳值最佳读数范围与最佳值 设：设：T =1%，则可绘出溶液浓度，则可绘出溶液浓度相对误差相对误差c/c与其透光度与其透光度T 的关系曲线的关系曲线。如图所示：。如图所示： 当：当：T =1%，T 在在15%65%之之间时，浓度相对误差较小，最佳读数间时，浓度相对误差较小，最佳读数范围。范围。 用仪器测定时应尽量使溶液透光度值在用仪器测定时应尽量使溶液透光度值在T %=1565% (吸光度吸光度 A =0.800.20)。 可求出浓度相对误差最小时的透光度可求出浓度相对误差最小时的透光度Tmin为：为： Tmin36.8%, Amin0.4346210.5 10.5 吸光光度法吸光光度法1

35、0.5.1 10.5.1 普通吸光光度法普通吸光光度法1.1.单组分的测定单组分的测定 目视比色法目视比色法 通常采用通常采用 A-C 标准曲线法定量测定。标准曲线法定量测定。2.2.多组分的同时测定多组分的同时测定 若各组分的吸收曲线互不重叠，则可若各组分的吸收曲线互不重叠，则可在各自最大吸收波长处分别进行测定。这在各自最大吸收波长处分别进行测定。这本质上与单组分测定没有区别。本质上与单组分测定没有区别。 若各组分的吸收曲线互有重叠，则若各组分的吸收曲线互有重叠，则可根据吸光度的加合性求解联立方程组可根据吸光度的加合性求解联立方程组得出各组分的含量。得出各组分的含量。 A1= a1bca b

36、1bcb A2= a2bca b2bcb 目视比色法目视比色法未知样品未知样品特点特点利用自然光利用自然光比较吸收光的互补色光比较吸收光的互补色光准确度低（半定量）准确度低（半定量）不可分辨多组分不可分辨多组分方法简便，灵敏度高方法简便，灵敏度高标准系列标准系列64 光电比光电比色法色法通过滤光片得一窄范围的光通过滤光片得一窄范围的光(几十几十nm)光电比色计结构示意图光电比色计结构示意图灵敏度和准灵敏度和准确度较差确度较差6510.5.210.5.2、示差吸光光度法（示差法）、示差吸光光度法（示差法） 普通分光光度法一般只适于测定微量组分，当待测组分含普通分光光度法一般只适于测定微量组分，当

37、待测组分含量较高时，将产生较大的误差。需采用示差法。即提高入射量较高时，将产生较大的误差。需采用示差法。即提高入射光强度，并采用浓度稍低于待测溶液浓度的标准溶液作参比光强度，并采用浓度稍低于待测溶液浓度的标准溶液作参比溶液。溶液。 设：待测溶液浓度为设：待测溶液浓度为c cx x，标准溶液浓度为，标准溶液浓度为c cs s( (c cs s c cx x) )。则：。则： Ax= b cx As = b cs x s =b(cx cs ）=bc 测得的吸光度相当于普通法中待测溶液与标准溶液的吸测得的吸光度相当于普通法中待测溶液与标准溶液的吸光度之差光度之差。 示差法测得的吸光度与示差法测得的吸

38、光度与c呈直线关系呈直线关系,由标准曲线上查由标准曲线上查得相应的得相应的c值，则待测溶液浓度值，则待测溶液浓度cx ：cx = cs + c 66示差法标尺扩展原理：示差法标尺扩展原理： 普通法：普通法： cs的的T=10%；cx的的T=5% 示差法：示差法： cs 做参比，调做参比，调T=100% 则：则： cx的的T=50% ；标尺扩展；标尺扩展10倍倍67例题例题已知已知 dT = 0.01, 样品样品Tx = 2.00 %, 标准标准 Ts = 10.0 %示差法示差法sxrIIT %0 .200 .1000. 2xxTxcTTdcdxln02. 0lg02. 0434. 001.

39、0%8 .12xrTxcTTdcdxln常规法误差常规法误差示差法误差示差法误差02. 0lg20. 0434. 001. 0%28. 1已知已知 dT = 0.01, 样品样品Tx = 2.00 %, 标准标准 Ts = 5.00 %0IITxr%0 .4000. 500. 2xrTxcTTdcdxln%64. 0sxTT6810.5.310.5.3、双波长分光光度法、双波长分光光度法 不需空白溶液作参比；但需要两个单色器获得两束单色不需空白溶液作参比；但需要两个单色器获得两束单色光光( (1 1和和2 2) )；以参比波长；以参比波长1 1处的吸光度处的吸光度A A11作为参比，来作为参比

40、，来消除干扰。在分析浑浊或背景吸收较大的复杂试样时显示出消除干扰。在分析浑浊或背景吸收较大的复杂试样时显示出很大的优越性。灵敏度、选择性、测量精密度等方面都比单很大的优越性。灵敏度、选择性、测量精密度等方面都比单波长法有所提高。波长法有所提高。 A A A22 A A11 ( (22 11) )b cb c 两波长处测得的吸光度差值两波长处测得的吸光度差值A与待测组分浓度成正比与待测组分浓度成正比。11和和22分别表示待测组分在分别表示待测组分在1 1和和2 2处的摩尔吸光系处的摩尔吸光系数。数。69关键问题关键问题: : 测量波长测量波长2 2和参比波长和参比波长1 1的选择与组合的选择与组

41、合 以两组分以两组分x x和和y y的双波长法测定为例：的双波长法测定为例：设：设：x x为待测组分，为待测组分，y y为干扰组分，二者的吸光度差分别为为干扰组分，二者的吸光度差分别为: : Ax和和Ay，则该体系的总吸光度差，则该体系的总吸光度差Ax+y为：为： Ax+y = A x + A y 如何选择波长如何选择波长1 、2有一定的要求。有一定的要求。70选择波长组合选择波长组合1 1 、2 2的基本要求是：的基本要求是： 选定的波长选定的波长1 1和和2 2处干扰组分应具有相同吸光度，处干扰组分应具有相同吸光度，即：即： Ay = y = A y y22 A y y11 = 0 = 0

42、故：故： Ax+y = x+y = A x=(x=(x x22x x11) )bcbcx x此时：测得的吸光度差此时：测得的吸光度差A只与待测组分只与待测组分x x的浓度呈线性关系的浓度呈线性关系，而与干扰组分，而与干扰组分y y无关。若无关。若x x为干扰组分，则也可用同样的方为干扰组分，则也可用同样的方法测定法测定y y组分。组分。 在选定的两个波长在选定的两个波长1 1和和2 2处待测组分的吸光度应具有处待测组分的吸光度应具有足够大的差值。足够大的差值。 可采用作图法选择符合上可采用作图法选择符合上述两个条件的波长组合述两个条件的波长组合。7110.5.410.5.4、导数光度分析法、导

43、数光度分析法 导数分光光度法在多组分同时测定、浑浊样品分析、消导数分光光度法在多组分同时测定、浑浊样品分析、消除背景干扰、加强光谱的精细结构以及复杂光谱的辨析等除背景干扰、加强光谱的精细结构以及复杂光谱的辨析等方面，显示了很大的优越性。方面，显示了很大的优越性。 利用吸光度利用吸光度( (或透光度或透光度) )对波长的导数曲线来进行分析：对波长的导数曲线来进行分析： 0 0 e e-bcbc假定入射光强度假定入射光强度0 0 在整个波长范围内保持恒定：在整个波长范围内保持恒定： d dI I 0 0 /d /d0 0则则：d dI I/d/d0 0 bcbc e e -bc-bc d d/d/

44、d bcbc d d/d/d 72 d dI I/d/d bcbc d d/d/d 一阶导数信号与试样浓度呈一阶导数信号与试样浓度呈线性关系；线性关系； 测定灵敏度依赖于摩尔吸光测定灵敏度依赖于摩尔吸光系数对波长的变化率系数对波长的变化率d d/d/d。吸。吸收曲线的拐点处收曲线的拐点处d d/d/d最大，故最大，故其灵敏度最高其灵敏度最高( (见图）。见图）。 同理可以导出其二阶和三阶导同理可以导出其二阶和三阶导数光谱（略）数光谱（略） 7310.6 吸光光度分析法的应用吸光光度分析法的应用1. 单一组分测定单一组分测定1) 金属离子金属离子: Fe-phen, Ni-丁二酮肟丁二酮肟, C

45、o-钴试剂钴试剂2) 磷的测定磷的测定: DNA中含中含P9.2%, RNA中含中含P9.5%, 可得核酸量可得核酸量.H3PO4+12(NH4)2MoO4+21HNO3=(NH4)3PO412MoO3+12NH4NO3+12H2O磷钼黄磷钼黄( 小小)磷钼磷钼(V)蓝蓝( 大大)Sn2+743) 蛋白质测定蛋白质测定溴甲酚绿、考马司亮蓝等溴甲酚绿、考马司亮蓝等4) 氨基酸测定氨基酸测定茚三酮茚三酮(紫色化合物紫色化合物)5) 水质检测水质检测: NH4+、NO2-、Mn2+、Fe2+、SO42-、Hg2+-6) 药物含量测定药物含量测定比吸光系数定量；荷移比吸光系数定量；荷移光谱法测定光谱法

46、测定.7) 紫外吸收紫外吸收(UV): NO2-、NO3-、SO42-、SO32-、CO32-、SCN-、酪氨酸、色氨酸、酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋白质等。苯丙氨酸、蛋白质等。752. 多组分的测定多组分的测定 x 1, y 1, x 2, y 2由由x,y标液标液 在在 1, 2处分别测得处分别测得a) 在 1处测组分处测组分x, 在 2处测组分处测组分yb) 在 1处测组分处测组分x; 在在 2处测总吸处测总吸收收,扣除扣除x吸收吸收,可求可求yc) x,y组分不能直接测定组分不能直接测定A1= x 1bcx+ y 1bcy(在 1处测得处测得A1) A2 = x 2bcx+ y 2bc

47、y(在 2处测得处测得A2)76 3. 3. 光度滴定光度滴定NaOH滴定滴定 对硝基酚对硝基酚 pKa=7.15 间硝基酚间硝基酚 pKa=8.39 pKa =1.24V1V2V(NaOH)/mL对硝基酚对硝基酚间硝基酚间硝基酚酸形均酸形均无色无色. .碱形均碱形均黄色黄色77典型的光度滴定曲线典型的光度滴定曲线依据滴定过程中溶液吸光度变化来确定终点的滴定分析方法。依据滴定过程中溶液吸光度变化来确定终点的滴定分析方法。Vsp滴定剂吸收滴定剂吸收Vsp被滴物吸收被滴物吸收Vsp滴定剂与待滴定剂与待测物均吸收测物均吸收Vsp产物吸收产物吸收784. 4. 络合物组成的测定络合物组成的测定(1)(

48、1)摩尔比法摩尔比法: : 固定固定cM , ,改变改变c cR R 1:13:1c(R)/c(M)A1.0 2.0 3,0 79(2)(2)等摩尔连续变化法等摩尔连续变化法: :M:R=1:10.50.33cM/ccM/cM:R=1:2MRMRnn MR(ccc）常数常数80表观形成常数的测定表观形成常数的测定 (设设M、R均无吸收均无吸收)0.5cM/cM:R=1:1A0A00-=A AA c(M)=c(R)=c)2MR(1-1-=M R cKccc MmRn型型 ?815.5.一元弱酸离解常数的测定一元弱酸离解常数的测定 HL HLHLHLL=HL+LKccAKK +L+aaa(HL)H (HL)=+H +H KaH+L/HL高酸度下，几乎全部以高酸度下，几乎全部以HL存在，可测得存在，可测得AHLHLc(HL)；低酸度下，几乎全部以低酸度下，几乎全部以L存在，可测得存在